CN103305544B - 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种阿卡波糖工程菌、制备该工程菌的方法及该工程菌的应用。本发明的阿卡波糖工程菌是通过接合转移的方法导入同源重组片段将游动放线菌的treY基因灭活而获得。所述阿卡波糖工程菌发酵后，产生的阿卡波糖C组分杂质含量明显降低。

Description

阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程方法构建的阿卡波糖工程菌，更具体地，涉及一种降低了C组分杂质的阿卡波糖工程菌、制备该工程菌的方法以及该工程菌的应用。

背景技术

据统计，目前我国糖尿病患者人数已达9240万人，其中男性5020万人，女性4220万人。发病人数超过印度，成为世界糖尿病人最多的国家，发病率（9.7%）仅次于美国（11%）。此外，还有约1.5亿人为糖尿病前期，每年治疗费用就达到1740亿元。

游动放线菌（Actinoplanes sp.）产生的降糖药阿卡波糖是II型糖尿病的首选治疗药物，国内年销售额已近20亿元。目前阿卡波糖在生产上主要存在杂质组分问题，严重影响产品质量；其中最为突出的是C组分杂质（YvonneRockser,Udo F.Wehmeier.The gac-gene cluster for the production of acarbosefrom Streptomyces glaucescens GLA.O-Identification,isolation andcharacterization.Journal of Biotechnology，第140卷，第1-2期，2009年3月10日，114-123页）。一般情况下，产品中对C组分杂质含量的要求是在0.1%以下，杂质含量不达标的产品不能进入销售渠道。然而现有的由游动放线菌发酵工程生产的阿卡波糖中，C组分杂质含量普遍在2.5%以上。为保证产品质量，需要进行后续提纯步骤，导致工艺复杂，生产成本提高。

目前使用较多的是通过控制发酵过程来控制杂质组分的含量，但是该方法不稳定。

根据文献报导（ppl Microbiol Biotechnol(2008)80:767-778），产生阿卡波糖C组分杂质有两条途径：一是阿卡波糖经过treY基因编码的麦芽寡糖基海藻糖合酶催化反应直接得到C组分杂质；二是由treS基因编码的海藻糖酶合成海藻糖，再进入合成途径得到C组分杂质。因此，通过基因重组的方法控制C组分杂质也是一种途径。

利用接合转移方法进行转化的技术在链霉菌和其它一些放线菌中已广泛应用，但在游动放线菌中鲜有报道，而且传统的接合转移方法对游动放线菌的转化效率极低，不适合进行基因重组。例如，现有技术中，采用50℃热击10分钟对大肠杆菌和放线菌进行接合转移（Practical Streptomyces Genetics,2000,Tobias Kieser等），但该温度和时间对游动放线菌和大肠杆菌的接合转移不适用。

发明内容

本发明的目的是提供一种阿卡波糖工程菌，使发酵产生的阿卡波糖C组分杂质显著下降。

在第一个方面，本发明提供一种制备阿卡波糖工程菌的方法，所述方法是将生产阿卡波糖的游动放线菌中的treY基因灭活，所述treY基因的编码序列如SEQ ID NO:1所示；所述灭活是通过将DNA片段M导入到游动放线菌中，使DNA片段M与游动放线菌的treY基因发生同源重组而完成；所述同源重组是通过将游动放线菌的菌丝与导入所述DNA片段M的重组菌共同培养进行接合转移而完成；

所述DNA片段M，自5’端到3’端分别为同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1和同源臂T2能够与treY基因发生同源重组，灭活treY基因；所述片段N为连接片段。

优选地，所述同源臂T1与treY基因的上游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T1包括treY基因编码序列的5’端785bp核苷酸。

优选地，所述同源臂T2与treY基因的下游序列同源重组；进一步优选地，所述同源臂T2包括treY基因编码序列的3’端930bp核苷酸。

优选地，所述片段N为包含限制性核酸内切酶识别序列的片段；进一步优选地，所述片段N包含BamHI酶识别序列。

同源重组的原理是本领域技术人员已知的。所述DNA片段M分别在同源臂T1和同源臂T2包括treY基因编码序列的5’端和3’端序列，但缺失treY基因中间一部分编码序列。当T1、T2与出发游动放线菌的treY基因的上下游发生同源重组，所述DNA片段M将被重组至游动放线菌的基因组中；因其缺失treY基因的部分序列，无法表达正常产物或不表达，从而使构建的游动放线菌中的treY基因灭活。本领域技术人员可以理解，当treY基因的5’端和3’端分别被扩增后，需要将二者连接起来以形成完整的DNA片段。通常情况下，本领域技术人员将使用限制性内切酶识别序列来连接两个片段。限制性内切酶的选择、包含限制性内切酶识别序列的引物设计、PCR扩增以及扩增片段的回收和连接等都是本领域技术人员根据所使用的质粒、菌株和实验条件可以选择和判断的。

所述treY基因的编码序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一种优选的实施方式中，所述片段M的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明中使用的游动放线菌可以是任何能够生产阿卡波糖的游动放线菌。优选地，所述游动放线菌是Actinoplanes sp.SN223/29。在一种具体的实施方式中，所述游动放线菌是游动放线菌Actinoplanes sp.8-22，所述游动放线菌Actinoplanes sp.8-22是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）（北京市朝阳区北辰西路1号院3号）的编号为CGMCC No.7639的游动放线菌，保藏日期为2013年5月24日。所述游动放线菌8-22不产孢，气生菌丝生长紧致，颜色由橙色至棕黄色，产色素。

本发明方法通过构建包含DNA片段M的质粒和重组菌，利用重组菌与出发游动放线菌同源重组而完成。本领域技术人员可以根据实验条件而选择合适的原始质粒和菌株，构建出合适的包含DNA片段M的质粒和重组菌。

优选地，所述导入DNA片段M的重组菌是将所述DNA片段M克隆至pUAmT14质粒的多克隆酶切位点而得到重组质粒pAT-tre12，再将重组质粒pAT-tre12转化至大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中所得到的重组菌。

在一种优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：构建包含DNA片段M的重组质粒，制备重组菌，将重组菌与游动放线菌共同培养进行接合转移，使DNA片段M与游动放线菌的treY基因发生同源重组，筛选treY基因缺失失活的交换株。

优选地，所述方法中，在将重组菌与游动放线菌共同培养进行接合转移之前，将所述游动放线菌以37℃水浴20分钟。

上述优选的处理游动放线菌的条件可以用于本发明的任一种制备阿卡波糖工程菌的方法中。

在第二个方面，本发明提供一种阿卡波糖工程菌，所述工程菌由本发明的方法制备而成，所述工程菌中treY基因失活。优选地，所述工程菌是游动放线菌tre12-2#，所述游动放线菌tre12-2#是游动放线菌8-22的treY基因与序列为SEQ ID NO:3的DNA片段M发生同源重组后产生的treY基因失活的游动放线菌。

在第三个方面，本发明提供所述阿卡波糖工程菌在制备阿卡波糖中的应用。

在第四个方面，本发明提供一种制备阿卡波糖的方法，所述方法使用本发明的阿卡波糖工程菌，尤其是游动放线菌tre12-2#，进行发酵。

在第五个方面，本发明提供DNA片段M、包含所述DNA片段M的重组质粒或重组菌。所述DNA片段M、重组质粒和重组菌如本申请第一个方面所述。

本发明的阿卡波糖工程菌发酵的阿卡波糖中C组分杂质含量明显降低，由出发菌株的0.18%降到0.06%以下，而阿卡波糖的发酵单位没有受到影响。利用本发明的阿卡波糖工程菌发酵的阿卡波糖中杂质组分含量低，产品质量可以得到保证，不需要进行后续提纯，减少工艺步骤，降低生产成本。

附图说明

图1是用于treY基因双交换的重组质粒pAT-tre12构建过程示意图；

图2是游动放线菌自杀型质粒pUAmT14的结构及酶切位点示意图；

图3是构建的质粒pUAmT14的酶切电泳检测图；其中M是DNA Ladder，泳道1-3分别是以Bgl I、HincⅡ和Xba I酶切质粒pUAmT14后的电泳图；

图4是重组质粒pAT-tre1的结构及酶切位点示意图；

图5是重组质粒pAT-tre12的结构及酶切位点示意图；

图6是构建的重组质粒pAT-tre1、pAT-tre12的酶切电泳检测图；其中，泳道1-6分别是构建的6个pAT-tre12质粒以PstⅠ酶切后的电泳图，泳道7是pAT-tre1质粒以PstⅠ酶切后的电泳图，M是DNA Ladder（Fermentas#SM0333）；

图7是treY基因双交换原理及酶切位点示意图；

图8是treY基因缺失重组子PCR筛选的电泳图；其中1～7泳道是待检测菌株tre12-1#～tre12-7#；8、10是具有安普霉素抗性的对照（单交换）；9是出发菌株8-22（负对照）；11是质粒pAT-tre12（正对照）；M是DNA ladder（Fermentas，#SM0333）；

图9是对照菌8-22的发酵产物阿卡波糖以及C组分杂质的HPLC图谱。

图10是tre12-2#工程菌的发酵产物阿卡波糖以及C组分杂质的HPLC图谱。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和附图说明本发明，但本发明的内容不限于此。如没有特殊说明，下面实施例中所使用的试剂均是常规化学试剂商店可购得的；所使用的方法及其参数都是本领域技术人员根据现有技术或公知常识可以完成的。

本发明的制备和筛选阿卡波糖工程菌的方法可以概括为以下步骤：

1、利用PCR，以游动放线菌的基因组为模板，分别扩增treY基因上游的3057bp片段（其中包括treY基因的编码序列5’端785bp），两端分别加入EcoRI和BamHI酶切位点；以及下游2885bp片段（其中包括treY基因的编码序列3’端930bp），两端分别加入BamHI和Hind III酶切位点。将这两个片段依次插入到放线菌自杀型质粒pUAmT14的相应酶切位点，得到用于灭活treY基因的重组质粒pAT-tre12。该质粒的treY基因因为缺失了内部的553个碱基而失去原有的生物活性。

2、将重组质粒pAT-tre12转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(中科院上海生理生态研究所覃重军老师提供)后，通过接合转移的方法转化到阿卡波糖产生菌游动放线菌。

3、筛选treY基因缺失失活的双交换株，进行摇瓶发酵试验。

结果表明，阿卡波糖C组分杂质的含量由出发菌株的0.18%降到0.06%以下，而阿卡波糖的发酵单位没有受到影响。

实施例1：用于敲除treY基因的重组质粒pAT-tre12的构建（构建过程示意图如图1所示）

a)放线菌自杀型质粒pUAmT14的构建：克隆载体pUC19（Fermentas）以Dra I(TaKaRa)和Ssp I(TaKaRa)双酶切；质粒pIJ773(中科院上海生理生态研究所覃重军老师提供）以Xba I(TaKaRa)和BstB I(TaKaRa)双酶切，并以BLK试剂盒(TaKaRa)补平末端。将上述两个片段连接，得到放线菌自杀型质粒pUAmT14。质粒pIJ773在文献Gust B,Kieser T and Chater K,F.technology:PCR-targeting system in Streptomyces coelicolor.JohnInnes Centre.2002中有详细说明。质粒pUAmT14的结构及酶切位点如图2所示。利用Bgl I、HincⅡ和Xba I酶切质粒pUAmT14以鉴定构建的质粒是否正确，质粒酶切电泳图如图3所示。

b)游动放线菌基因组的分离：取游动放线菌8-22冻存管菌液200μl接种于30ml TSB培养基（Bacto ^TM Tryptic Soy Broth.BD公司，货号211825），28℃，220rpm培养48hr后，于50ml离心管中，4000rpm离心10分钟，去上清，沉淀用30ml蔗糖-Tris缓冲液（10.3%蔗糖，10mM Tris-HCl，pH8.0）洗涤2遍后，以5ml蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入100mg/ml溶菌酶溶液20μl，37℃水浴2hr。加入10%SDS溶液500μl，温和颠倒直至基本澄清。加酚-氯仿-异戊醇（25:24:1，pH8.0）溶液5ml，温和颠倒数次后，4000rpm离心10分钟。取上层溶液4ml，加酚-氯仿-异戊醇（25:24:1，pH8.0）溶液4ml，温和颠倒数次后4000rpm离心10分钟。取上层溶液3ml，加入3mol/L的HAc/NaAc缓冲液（pH5.3）300μl，异丙醇3ml，温和颠倒数次后，将结团的沉淀用吸头挑到1.5ml离心管中。沉淀用70%乙醇洗涤2遍后，室温干燥。加入500μl Tris-HCl（pH8.0）溶解，得到游动放线菌8-22的总DNA。

c)treY基因上游片段的扩增和克隆：引物为：

treU1：atcgaattcCGTAAGGGGATAAATTAGCGCC（SEQ ID NO:4）；

treD1：atcggatcctATCTTCTCGATCACCAGCCAGG（SEQ ID NO:5）。

按以下配比配制反应液：

（PrimeSTAR试剂盒，TaKaRa）

进行PCR反应，程序为：

95℃×5分钟，

(98℃×10秒、55℃×30秒、72℃×3分钟)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物以PCR产物回收试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）回收后，以EcoRI和BamHI双酶切，回收产物与以EcoRI和BamHI双酶切的载体pUAmT14连接，得到重组质粒pAT-tre1。

d)treY下游片段的扩增和克隆，引物为：

treU2：atcggatccACCGACGAGTTCCACGAGTGCT（SEQ ID NO:6）；

treD2：atcaagcttGACCGCAGTCGCGAGTTGTCAT（SEQ ID NO:7）。

按以下配比配制反应液：

进行PCR反应，程序为：

95℃×5分钟，

(98℃×10秒、55℃×30秒、72℃×3分钟)×25个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物以PCR产物回收试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）回收后，以BamHI和Hind III双酶切，回收产物与以BamHI和Hind III双酶切的质粒pAT-tre1连接，得到重组质粒pAT-tre12。

质粒pAT-tre1、pAT-tre12的结构及酶切位点分别如图4、5所示。利用PstI酶切构建的质粒以检测质粒是否正确。质粒pAT-tre1、pAT-tre12的酶切电泳图如图6所示。

进一步通过测序检验pAT-tre12质粒中引物treU1和treD2之间的序列，其中从序列CGTAAGGGGATAAATTAGCGCC（引物treU1部分序列）开始至序列ATGACAACTCGCGACTGCGGTC（引物treD2的反向互补序列的部分序列）之间的序列即为SEQ ID NO:3所示的连接片段M的序列。

实施例2：将treY基因缺失的重组质粒pAT-tre12转化到宿主菌游动放线菌8-22

a)将重组质粒pAT-tre12转化到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)：取1μl重组质粒pAT-tre12加入到100μl大肠杆菌ET12567(pUZ8002)感受态细胞（以CaCl₂法制备）中，冰上放置30分钟后，42℃热击90秒，再迅速放到冰上冷却1分钟，加入900μl LB培养，37℃水浴50分钟。取100μl涂布于含25μg/ml氯霉素（Cm）、50μg/ml卡那霉素（Km）、50μg/ml安普霉素（Am）的固体LB培养上，37℃培养过夜，长出转化子，挑选其中一个转化子并鉴定已转入质粒pAT-tre12，命名为ET12567(pUZ8002,pAT-tre12)。

b)大肠杆菌ET12567(pUZ8002,pAT-tre12)的培养：挑一个转化子单菌落于3ml含25μg/ml Cm、50μg/ml Km和50μg/ml Am的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，菌液300μl接种于30ml含Cm、Km、Am的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养4-6h，至OD600为0.4-0.6之间。收集菌液，离心后，以LB培养基洗涤2遍，最后以3ml LB培养基悬浮，备用。

c)宿主菌8-22菌液的准备：从平板上刮下游动放线菌8-22的菌丝，在30mlTSB培养基中，28℃培养24-40h，至菌液变成黑色。取3ml菌液转接于30ml TSB培养基中，28℃培养6h。取500μl菌液，离心去上清后，以500μl2×YT培养基悬浮，37℃水浴20min，自然冷却，备用。

d)接合转移：取500μl b)的菌液加入到500μl c)的菌液中，离心去掉800μl上清。以剩余的上清悬浮菌体，并涂布于MS培养基。28℃培养16-20h后，以含有625μg Am和500μg萘啶酮酸（Nal）的1ml无菌水覆盖，28℃培养4-8d，长出转化子。

双交换过程的原理图如图7所示。

实施例3：treY基因缺失的游动放线菌工程菌的筛选培养

a)挑一个转化子，在含有25μg/ml Am和25μg/ml Nal的YMS培养基上划线，28℃培养4-6d。将生长的菌落在不含抗生素的YMS培养基上28℃连续培养2代后，再在不含抗生素的YMS培养基上划线分离单菌落，28℃培养4-6d。

b)用牙签将a)得到的单菌落分别于含和不含25μg/ml Am的YMS培养基上点种，28℃培养4-6d。挑选在含25μg/ml Am的YMS培养基上不生长而在不含Am的YMS培养基上生长的菌落，在不含抗生素的YMS培养基上进行放大培养。

实施例4：treY基因缺失的游动放线菌工程菌的鉴定

利用PCR方法对放大培养的菌株进行筛选，所用的引物为：

treY1：TTCTACGACATCGACTGGGAGC（SEQ ID NO:8）；

treY2：GTAGATCCGGTCGACCATCTCC（SEQ ID NO:9）。

按以下配比配制反应液：

15μl/管分装，分别用牙签挑取实施例3-b)所筛选的菌落为模板进行PCR反应，并以0.2μl8-22总DNA和重组质粒pAT-tre12分别为负对照和正对照。PCR反应程序为：

95℃×10分钟，

(94℃×30秒、55℃×30秒、72℃×1分钟)×30个循环，

72℃×5分钟，

16℃×1分钟。

PCR产物大小为1347bp的是回复突变，即其基因型与出发菌株8-22相同；PCR产物大小为801bp的是treY基因缺失的游动放线菌工程菌。图8是PCR筛选的电泳图。选择第2#菌，命名为tre12-2#，对该菌株进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO:10所示。PCR电泳结果与测序结果说明该菌株即是本发明预期的菌株。

实施例5：treY基因缺失的游动放线菌工程菌tre12-2#的发酵检验

将treY基因缺失的游动放线菌工程菌tre12-2#在YMS培养基上28℃培养3-4天后，将面积为1cm²左右菌落挖到30ml种子培养基（黄豆饼粉3.0%，玉米淀粉1.0%，葡萄糖1.0%，甘油2.0%，CaCO₃0.20%，pH自然）中，28℃，220rpm培养24-30hr，以2ml的接种量转接到发酵培养基（葡萄糖3.0%，麦芽糖5.0%，黄豆饼粉1.2%，K₂HPO₄0.10%，CaCl₂·H₂O0.35%，FeCl₃0.05%，CaCO₃0.3%，谷氨酸钠0.1%），28℃，220rpm培养7-8d。取发酵液5ml过滤后，取1ml滤液，加入4ml无水甲醇，浸泡过夜后，过滤。取滤液以HPLC检验阿卡波糖及C组分杂质的含量。HPLC方法为：氨基柱，流动相为KH₂PO₄0.87g、K₂HPO₄0.46g、乙腈2550ml、H₂O1450ml。波长210nm，流速1ml/分钟。以同样的方法检测出发菌株8-22的发酵产物以进行对比。

检测结果在图9、图10和表1、表2中示出，其中表1和表2分别是图9和图10的峰表（检测器A通道1/210nm检测值）。

表1：对照菌8-22的发酵产物阿卡波糖以及C组分杂质的HPLC图谱的峰表

峰#	保留时间	面积	高度	面积%	高度%
						1	29.233	134250	2294	2.976	5.271
2	33.311	79916	982	1.771	2.258
						3	34.249	10117	272	0.224	0.626
*4	36.957	4279709	39812	94.856	91.499
						*5	45.295	7824	150	0.173	0.346
总计		4511817	43511	100.000	100.000

峰*4代表阿卡波糖，峰*5代表C组分杂质。

表2：tre12-2#工程菌的发酵产物阿卡波糖及C组分杂质的HPLC图谱的峰表

峰#	保留时间	面积	高度	面积%	高度%
						1	29.154	113630	2045	1.939	3.637
2	33.178	101979	1211	1.740	2.154
						3	34.554	17432	370	0.297	0.659
*4	36.803	5624632	52604	95.973	93.545
						*5	45.137	2971	3	0.051	0.006
总计		5860645	56234	100.000	100.000

峰*4代表阿卡波糖，峰*5代表C组分杂质。

如图9和10所示，阿卡波糖和C组分杂质的保留时间分别为37分钟和45分钟左右；进一步由表1和表2可知，tre12-2#工程菌发酵液样品中的阿卡波糖峰面积大于对照菌株8-22的阿卡波糖峰面积。结果表明，与出发菌株8-22相比，treY基因缺失的游动放线菌工程菌tre12-2#的C组分杂质含量从0.18%（C组分杂质：阿卡波糖=7824:4278709=0.18%）降至0.053%（C组分杂质：阿卡波糖=2971:5624632=0.053%），而阿卡波糖的含量则略有提高。

Claims (15)

1.一种制备阿卡波糖工程菌的方法，所述方法是将生产阿卡波糖的游动放线菌中的treY基因灭活；所述灭活是通过将DNA片段M导入到游动放线菌中，使DNA片段M与游动放线菌的treY基因发生同源重组而完成；所述同源重组是通过将游动放线菌的菌丝与导入所述DNA片段M的重组菌共同培养进行接合转移而完成,在将重组菌与游动放线菌共同培养进行接合转移之前，将所述游动放线菌以37℃水浴20分钟；

所述DNA片段M，自5’端到3’端分别为同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1与treY基因的上游序列同源重组，所述同源臂T2与treY基因的下游序列同源重组，灭活treY基因；所述片段N为连接片段；其中，同源臂T1由treY基因编码序列的5’端785bp核苷酸和treY基因上游片段组成，同源臂T2由treY基因编码序列的3’端930bp核苷酸和treY基因下游片段组成，以限制性内切酶识别序列作为片段N。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源臂T1为包括treY基因编码序列的5’端785bp核苷酸的3057bp片段；所述同源臂T2为包括treY基因编码序列的3’端930bp核苷酸的2885bp片段；所述片段N为BamHI酶识别序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA片段M的序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述导入DNA片段M的重组菌是将所述DNA片段M克隆至pUAmT14质粒的多克隆酶切位点而得到重组质粒pAT-tre12，再将重组质粒pAT-tre12转化至包含质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567中所得到的重组菌；其中所述pUAmT14质粒的构建过程为：将克隆载体pUC19以Dra I和Ssp I双酶切，将质粒pIJ773以Xba I和BstB I双酶切，并补平末端，将上述两个片段连接，得到质粒pUAmT14。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述游动放线菌是Actinoplanes sp.SN223/29。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述游动放线菌是游动放线菌8-22。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法制备的阿卡波糖工程菌，其特征在于，所述工程菌中treY基因失活。

8.根据权利要求7所述的阿卡波糖工程菌，其特征在于，所述阿卡波糖工程菌是游动放线菌tre12-2#，所述游动放线菌tre12-2#是游动放线菌8-22的treY基因与序列为SEQ ID NO:3的DNA片段M发生同源重组后产生的treY基因失活的游动放线菌。

9.根据权利要求7或8所述的阿卡波糖工程菌在制备阿卡波糖中的应用。

10.一种制备阿卡波糖的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求7或8所述的阿卡波糖工程菌。

11.DNA片段M，其特征在于，所述片段M自5’端到3’端分别为同源臂T1、DNA片段N和同源臂T2；所述同源臂T1与treY基因的上游序列同源重组，同源臂T1由treY基因编码序列的5’端785bp核苷酸和treY基因上游片段组成；所述同源臂T2与treY基因的下游序列同源重组，同源臂T2由treY基因编码序列的3’端930bp核苷酸和treY基因下游片段组成；所述片段N为连接片段，为限制性核酸内切酶识别序列。

12.根据权利要求11所述的DNA片段M，其特征在于，所述同源臂T1为包括treY基因编码序列的5’端785bp核苷酸的3057bp片段，所述同源臂T2为包括treY基因编码序列的3’端930bp核苷酸的2885bp片段，所述片段N为BamHI酶识别序列。

13.根据权利要求12所述的DNA片段M，其特征在于，所述DNA片段M的序列如SEQ ID NO:3所示。

14.包含权利要求11-13任一项所述的DNA片段M的质粒或重组菌。

15.根据权利要求14所述的质粒或重组菌，其特征在于，所述质粒是pAT-tre12；所述重组菌是将质粒pAT-tre12转化至包含质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567中所得到的重组菌；其中，将所述DNA片段M克隆至pUAmT14质粒的多克隆酶切位点而得到重组质粒pAT-tre12；所述pUAmT14质粒的构建过程为：将克隆载体pUC19以Dra I和Ssp I双酶切，将质粒pIJ773以Xba I和BstB I双酶切，并补平末端，将上述两个片段连接，得到质粒pUAmT14。