CN102965324B - 产(r, r)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。所述基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体pTrc99a转化大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655得到的基因工程菌。本发明的菌株能够在不需要添加诱导剂的情况下，高产高纯度的(R,R)-2,3-丁二醇，同时细胞生长良好，底物消耗迅速，发酵周期较短，成本低。该工程菌的获得对生物制造(R,R)-2,3-丁二醇具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)是一种重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域，具有良好的应用前景；同时，通过特定的化学反应，2,3-丁二醇可以衍生出多种重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1,3-丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台化合物。
2,3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，因此存在三种立体异构体。 其中(R,
R)-2,3-丁二醇不仅具有混旋型2,3-丁二醇的一般功能，而且还可以用于制备手性化学品以及作为高级防冻剂。
目前，(R, R)-2,3-丁二醇的生产主要采用化学合成法，先由1-丁醇脱水得1-丁烯，再经加成得2-氯-丁烷，再消除得2-丁烯，再与次溴酸反应生成3-溴-2-丁醇，然后在碱液中水解可得到2,3-丁二醇的外消旋混合物，最后通过外消旋体的拆分得到(R,
R)2,3-丁二醇（纪晓俊, 聂志奎, 黎志勇, 高振, 黄和. 化学进展, 2010, 22:
2450-2461）；但是化学合成法过程繁琐，最后还需要通过化学法进行手性拆分，因此成本高、难以实现大规模生产。
在制备化学品的方法中，微生物制造方法与化学合成法相比，其原料丰富、工艺简单、环境友好，因此越来越受到各国科学家的青睐。据报道，传统的天然微生物一般都生成两种不同构型2,3-丁二醇的混合物，至今还没有发现单一生成某种构型2,3-丁二醇的微生物(Celińska E, Grajek, W. Biotechnol Adv, 2009, 27: 715–725)。利用传统的天然微生物发酵法难以实现单一构型的2,3-丁二醇的高纯积累，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质十分相近，实现其分离很困难，故通过构建能够产单一构型2,3-丁二醇的基因工程菌则有望解决该问题。
据报道，目前构建出的基因工程菌都只能在IPTG存在的情况下表现出较强的外源蛋白表达和目标产物积累的能力，且产(R,
R)-2,3-丁二醇的能力均偏低。诱导剂对细胞的生长有一定的抑制作用，且价格相对昂贵，若利用基因工程菌进行工业化生产，诱导剂的添加必会大幅增加成本，不利于(R,
R)-2,3-丁二醇的规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌，该基因工程菌能在不添加任何诱导剂的情况下发酵产高纯度的(R, R)-2,3-丁二醇。
本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法，该方法简单，效率高。
本发明的再一目的是提供上述基因工程菌在制备(R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，该制备方法简单，产率高，对环境友好，成本低廉。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体导入宿主菌得到的重组菌。
所述宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655。
所述表达载体为pTrc99a。
一种构建所述产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步骤：
（1）从肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella
pneumoniae) CICC 10011中分别扩增budB基因和budA基因，从枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis) 168中扩增ydjL基因；
（2）利用重叠延伸PCR技术将budB基因、budA基因和ydjL基因拼接得到budB基因、budA基因和ydjL基因的融合基因；
（3）将所述融合基因插入表达载体的多克隆位点处，得到重组质粒；
（4）将所述重组质粒导入宿主内即得所述产(R,
R)-2,3-丁二醇的基因工程菌。
步骤（1）中用于扩增budB基因的引物为P1和P2；用于扩增budA基因的引物为P5和 P6；用于扩增ydjL基因的引物为P9和P10；
所述P1、P2、 P5、P6、P9和P10序列分别为：
P1：5’-GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，
P2：5’-GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，
P5：5’-GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6：5’-GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，
P9：5’-TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3’，
P10：5’-GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3’。
步骤（2）的具体方法为：
（
）将步骤（1）所得budB基因与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-budB，以P3和P4为引物扩增出含有budB基因的拼接序列1；所述P3和P4的序列如下：
P3：5’-TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA
AACAG TATC-3’，
P4：5’-AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC
TCAGATGC-3’；
（Ⅱ）将budA基因与载体pMD18-simple-T相连，获得重组质粒pMD18-simple-T-budA，以P7和P8为引物扩增出含有budA基因的拼接序列2；所述P7和P8的序列如下：
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’，
P8：5’-TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’；
（Ⅲ）将ydjL基因与载体pMD18-simple-T相连，获得重组质粒pMD18-simple-T-ydjL，以P11和P12为引物扩增出含有ydjL基因的拼接序列3；所述P11和P12的序列如下：
P11：5’-TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA
GA-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；
（Ⅳ）以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物1；以所述扩增产物1为模板，以P7及P12为引物扩增获得budA基因与ydjL基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下：
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’；
以budA基因与ydjL基因的融合基因和拼接序列1的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物2；以扩增产物2为模板，P13及P14为引物，进行扩增，获得budB基因、budA基因和ydjL基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下：
P13：5’-GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’，
P14：5’-CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。
一种所述基因工程菌在制备 (R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，将基因工程菌接种至发酵培养基，在摇床转速180~220r/min
、35-38℃条件下发酵30~48h，收获含有(R, R)-2,3-丁二醇的发酵液；
所述发酵培养基为：葡萄糖80 ~ 200 g/L，蛋白胨5~10 g/L，酵母膏3~7 g/L，NaCl 5~10 g/L，氨苄青霉素20~50
µg/mL，溶剂为水。
有益效果：
本发明基因工程菌性质稳定，在不添加诱导剂的情况下，以葡萄糖为底物高产高纯度的(R,
R)-2,3-丁二醇，突破了以往报道基因工程菌需要添加诱导剂的限制。摇瓶发酵结果：该基因工程菌可利用80g/L葡萄糖，产出32.2g/L的(R, R)-2,3-丁二醇，对映体纯度高达99.5%，相对于葡萄糖的转化率为40.3%，理论最高转化率为50%；在上述相同条件下，原始菌株几乎不耗糖，与原始的大肠杆菌菌株相比，在导入有效的(R,
R)-2,3-丁二醇合成途径后，重组菌不仅实现了(R, R)-2,3-丁二醇从无到有的合成，而且也不需要诱导剂的作用。与目前文献报道的大肠杆菌产(R, R)-2,3-丁二醇产量相比，产物终浓度也是相对最高的。
本发明构建基因工程菌的方法，巧妙、简单、效率高。
本发明基因工程菌用于发酵制备(R, R)-2,3-丁二醇，方法简单，产率高，对环境友好，成本低廉。发酵液中仅存在单一构型的(R,
R)-2,3-丁二醇，因此不需要复杂的拆分步骤。在发酵过程中，不需要添加诱导剂IPTG，成本低。
附图说明
图1为budB、budA和ydjL这三种基因的拼接模式示意图。
图2 为三种外源基因在宿主细胞Escherichia coli
MG1655中成功表达的SDS-PAGE图谱；M为SDS-PAGE低分子量Marker；Lane 1为添加了诱导剂IPTG的原始菌；Lane 2未经IPTG诱导的基因工程菌；Lane 3为IPTG诱导的基因工程菌。
图3为原始菌Escherichia coli
MG1655的发酵液高效液相色谱图。
图4为基因工程菌Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL加IPTG诱导情况下的发酵液高效液相色谱图，其中1是3-羟基丁酮；2是(R, R)-2,3-丁二醇。
图5为基因工程菌Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL无IPTG诱导情况下的发酵液高效液相色谱图，其中1是3-羟基丁酮；2是(R, R)-2,3-丁二醇；3是乙醇。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中的生物材料来源如下：
Klebisella pneumoniae CICC10011菌株（缩写为K. pneumoniae CICC10011菌株）：购于中国微生物菌种保藏中心；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168（缩写为B. subtilis 168菌株）：购于中国工业微生物菌种保藏中心；
pMD18-simple-T载体：商业载体，购于TaKaRa公司（宝生物工程有限公司）；
pUC18：商业载体，购于TaKaRa公司（宝生物工程有限公司）；
pTrc99a载体：商业载体 ，购于上海北诺生物科技有限公司；
Escherichia coli MG1655：由广东菌种保藏中心代购于美国菌种保藏中心(编号：ATCC 700926)。
本发明中budB基因为α-乙酰乳酸合成酶编码基因，budA基因为α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因，ydjL基因为 (R,
R)-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因。
实施例
1
：重组质粒
pTrc99a-budBbudAydjL
的构建
(1) 基因budB的克隆
根据Genebank公布的肺炎克雷伯氏杆菌(K.
pneumoniae)中budB基因序列设计合成引物：
P1：5’-GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’
P2：5’-GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’
以K. pneumoniae
CICC10011菌株的基因组DNA为模板，应用Takara高保真酶PrimeSTAR® HS DNA Polymerase进行PCR扩增budB基因。
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P1 0.5μL，引物P2 0.5μL，K. pneumoniae CICC1001基因组DNA 2μL，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.25μL。
PCR反应程序：98℃变性20s，55~62℃退火30s，72℃延伸1min48s，循环30轮；最后10℃保温。
将PCR产物以0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用Takara DNA
A-Tailing Kit 在PCR产物3’端加A，然后与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-budB，进行序列测定。budB基因的序列如SEQ
ID NO:1所示。
以重组质粒pMD18-simple-T-budB为模板，P3和P4为引物，应用Takara高保真酶PrimeSTAR® HS DNA Polymerase扩增含有budB基因的拼接序列1。
P3：5’-TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA
AACAG TATC-3’；
P4：5’-AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC
TCAGATGC-3’；
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P3 0.5μL，引物P3 0.5μL， pMD18-simple-T-budB质粒DNA 2μL，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.25μL。
PCR程序为：98℃变性10s，68℃退火加延伸2min，循环30轮；最后10℃保温。反应结束后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。
拼接序列1用于之后的重叠延伸PCR反应，其组成是：在budB基因的前端加了SacI酶切位点和RBS序列，在budB基因后端加了与拼接序列2前端相重叠的15~20bp。
(2)
基因budA的克隆：
根据Genebank公布的肺炎克雷伯氏杆菌(K.
pneumoniae)中budA基因序列设计合成引物：
P5：5’-GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6：5’-GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’。
以K. pneumoniae CICC 10011菌株的基因组为模板进行PCR扩增，应用Takara高保真酶PrimeSTAR® HS DNA Polymerase扩增budA基因。
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P5 0.5μL，引物P6 0.5μL，K. pneumoniae CICC1001基因组DNA 2μL，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.25μL。
PCR反应程序： 98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸48s，循环30轮；最后10℃保温。
PCR产物以0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用Takara DNA A-Tailing Kit 在PCR产物3’端加A，然后再与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-budA，进行序列测定。budA基因的具体序列如SEQ
ID NO:2所示。
以重组质粒pMD18-simple-T-bud A为模板，P7和P8为引物，扩增含有budA基因的拼接序列2。
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’
P8：5’-TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ 。
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P7 0.5μL，引物P8 0.5μL， pMD18-simple-T-budA质粒DNA 2μL，PrimeSTAR® HS
DNA Polymerase 0.25μL。
PCR反应程序为：98℃变性10s，55~65℃退火15s，72℃延伸50s，循环30轮，最后10℃保温。反应结束后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。
拼接序列2用于之后的重叠延伸PCR，其组成是在budA基因的前端加入SacI酶切位点，在budA基因的后端具有与ydjL基因前段序列相重叠的部分。
(3)
基因ydjL的获取
根据Genebank公布的枯草芽孢杆菌(B.
subtilis)中ydjL基因序列设计合成引物：
P9：5’-TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3’，
P10：5’-GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3’。
以B. subtilis 168菌株的基因组为模板进行PCR扩增，应用Takara高保真酶PrimeSTAR® HS DNA Polymerase扩增ydjL基因。
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P9 0.5μL，引物P10 0.5μL，B. subtilis 168基因组DNA 2μL，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.25μL。
PCR反应程序： 98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸1min，循环30轮；最后10℃保温。
PCR产物以0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用Takara DNA A-Tailing Kit 在PCR产物3’端加A，然后再与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-ydjL，进行序列测定。ydjL基因序列如SEQ
ID NO:3所示。
以重组质粒pMD18-simple-T-ydjL为模板，P11和P12为引物，扩增含有ydjL基因的拼接序列3。
P11：5’-TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA
GA-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ 。
PCR反应体系：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P11 0.5μL，引物P12 0.5μL， pMD18-simple-T-ydjL质粒DNA 2μL，PrimeSTAR® HS
DNA Polymerase 0.25μL。
PCR反应程序为：98℃变性10s，59.1℃退火15s，72℃延伸1min10s，循环30轮，最后10℃保温。反应结束后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。
拼接序列3用于之后的重叠延伸PCR，其组成是：在ydjL基因的前端具有与budA基因后段序列的相重叠部分，在ydjL基因的后端加入BamHI酶切位点。
(4)
重叠延伸PCR反应拼接budA基因和ydjL基因
重叠延伸PCR获得budA基因与ydjL基因的融合基因，分为两步反应。
重叠延伸PCR第一步反应中，不加引物，以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，每管的反应体系是：ddH2O
12μL，Buffer
5μL，dNTP
2μL，拼接序列2和拼接序列3各3μL，PrimeSTAR® HS
DNA Polymerase 0.3μL。PCR反应条件：98℃ 变性10s，55℃ 退火15s，72℃延伸1min10s，循环8 轮； 10℃保温。
重叠延伸PCR的第二步反应中，将第一步反应产物稀释100倍后作为模板，P7和P12为引物，扩增获得budA基因与ydjL基因的融合基因。每管的反应体系是：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P7 0.5μL，引物P12 0.5μL，模板2μL，PrimeSTAR® HS
DNA Polymerase 0.25μL。PCR反应条件：98℃变性10s，55℃ 退火15s，72℃延伸2min，循环30 轮，10℃保温。
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’。
P7引物前端有SacI酶切位点，P12引物后端有BamHI酶切位点。
(5)
重叠延伸PCR反应拼接budB基因、 budA基因和ydjL基因
重叠延伸PCR获得budB、budA、ydjL三种基因的融合基因，分为两步PCR反应。
重叠延伸PCR反应第一步中，不加引物，以budA基因与ydjL基因的融合基因和拼接序列1的重叠部分互为模板进行扩增，每管的反应体系是：ddH2O 12μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，budA基因与ydjL基因的融合基因3μL，3μL拼接序列1，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.3μL；反应程序为：98℃ 变性10s，55℃ 退火15s，72℃延伸2min，循环8 轮，10℃保温。
重叠延伸PCR的第二步反应中，以第一步反应产物作为模板， P13及P14为引物，扩增获得budB基因、 budA基因和ydjL基因的融合基因。每管的反应体系是：ddH2O 14.75μL，Buffer 5μL，dNTP 2μL，引物P13 0.5μL，引物P14 0.5μL，第一步反应产物2μL，PrimeSTAR® HS
DNA Polymerase 0.25μL；反应程序为：98℃变性10s，57℃ 退火15s，72℃延伸4min，循环29 轮， 10℃保温。
P13：5’-GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’
P14：5’-CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’
这对引物前端有SacI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。
反应结束后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。将PCR回收产物与pUC18载体连接获得重组载体pUC18-budBbudAydjL，进行序列测定，发现序列正确。
SacI和BamHI酶切重组载体pUC18-budBbudAydjL，回收budB、budA和ydjL的融合基因（约3.5Kb片段）；同时SacI和BamHI酶切pTrc99a载体，回收大片段产物；将双酶切产物在T4
DNA连接酶的作用下连接从而获得重组质粒pTrc99a-budBbudAydjL。budB基因、 budA基因和ydjL基因的拼接模式见图1。
实施例 2 ：制备基因工程菌 Escherichia coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
利用电击穿孔仪将重组质粒pTrc99a-budBbudAydjL转化大肠杆菌Escherichia coli MG1655，电转化参数为：电压2.5 kv, 200 Ω，脉冲时间4.5
msec。电击转化完毕，将经电击处理过的Escherichia coli
MG1655涂布于含有50 µg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养12~16小时，然后挑取阳性转化子，经质粒提取酶切验证后，确定得到重组大肠杆菌，命名为Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL。
实施例
3
基因工程菌
Escherichia
coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
的稳定性
考察方法：将Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL接种至3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下培养12h作为种子，转种培养24h（即传种20代），转种培养5次（即传种100代）。将上述菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，从中挑取100个单菌落分别点在添加和不添加氨苄青霉素的LB平板上，37℃下培养12~16h，比较在添加和不添加氨苄青霉素的LB平板上的菌落数，即其稳定性。
考察结果：传种100代之后，其质粒稳定性为99%。
实施例
4
：基因工程菌
Escherichia
coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
诱导后的蛋白表达考察
(1) 出发菌株：Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2) 以诱导蛋白表达为目的的基因工程菌培养：
培养基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，氨苄青霉素20 µg/mL，溶剂为水；
培养条件：50mL培养基装于250mL锥形瓶中，37℃、200rpm培养至OD600在0.6~0.8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，然后30℃、200rpm培养8h，诱导外源蛋白充分表达。
同时设立不用IPTG诱导的基因工程菌的培养作为对照。该培养过程中不添加IPTG，其他培养条件与IPTG诱导基因工程菌相同。
(3) 诱导后基因工程菌的细胞破碎：取步骤（2）获得的培养液3ml，4000rpm、4℃下离心5min，用pH7.4的磷酸钠缓冲液洗涤一次、重悬至3ml；冰浴下超声破碎细胞(2s, 3s, 15min,
300W)；然后12000rpm, 4℃下离心20min, 取上清；取30ul上清与10ul 4*SDS-PAGE loading buffer混合于灭菌的1.5ml离心管，煮沸5min后放于-20℃冰箱备用。
(4) 将煮沸后的样品用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察是否有外源蛋白表达。
考察结果：在SDS-PAGE图谱（见图2）中，可以看出：对应IPTG诱导基因工程菌的泳道上，能够看到表达的三种外源蛋白的明显条带；同时，可以发现IPTG诱导基因工程菌表达的目的蛋白量比未经IPTG诱导基因工程菌显著增加。
对比例
1
：原始菌
Escherichia
coli
MG1655
诱导后的蛋白表达考察
(1) 出发菌株：Escherichia coli
MG1655
(2) 诱导蛋白表达为目的的原始菌培养：
培养基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水；
培养条件：50mL培养基装于250mL锥形瓶中，37℃、200rpm培养至OD600在0.6~0.8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，然后30℃、200rpm培养8h，保证与基因工程菌的同等培养及诱导条件。
(3) 诱导后原始菌的细胞破碎：取诱导后的培养液3ml，4000rpm、4℃下离心5min，用pH7.4的磷酸钠缓冲液洗涤一次、重悬至3ml；冰浴下超声破碎细胞(2s, 3s, 15min, 300W)；然后12000rpm,
4℃下离心20min, 转移上清；取30ul上清与10ul 4*SDS-PAGE loadingbuffer混合于灭菌的1.5ml离心管，煮沸5min后放于-20度冰箱备用。
(4) 将煮沸后的样品用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察原始菌的蛋白表达情况。
考察结果：原始菌的SDS-PAGE凝胶图与基因工程菌的SDS-PAGE凝胶图相比（见图2），没有发现三种外源蛋白的表达条带。这种对比结果说明，基因工程菌中已经实现了原始菌中不存在的三种外源蛋白的成功表达。
实施例
5
：基因工程菌
Escherichia
coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
发酵产
(R, R)-2,3-
丁二醇
方法一
无IPTG诱导的基因工程菌Escherichia
coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL发酵产(R, R)-2,3-丁二醇：
(1) 出发菌株：Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2) 种子液制备：
种子培养基：蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 5g/L，氨苄青霉素20µg/mL，溶剂为水；
培养条件：50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37℃，摇床转速180r/min，培养12h。
(3) 发酵培养：
发酵培养基：葡萄糖80 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L，NaCl 5 g/L，氨苄青霉素20 µg/mL，溶剂为水；
培养条件：接种量5% (v/v)，发酵温度37℃，全程不添加诱导剂，摇床转速180r/min，发酵30h。
设计基因工程菌在IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在0.6~0.8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，然后30℃、200rpm诱导培8h，再转回37℃、180rpm进行发酵，发酵总时间30h。其他培养条件同无IPTG诱导的基因工程菌。
设计原始菌Escherichia coli MG1655的对照，种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。
发酵结果：将发酵液离心后，采用高效液相色谱检测。基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将80g/L葡萄糖转化得到32.2g/L的(R, R)-2,3-丁二醇（见图5）。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖20g/L，生成(R, R)-2,3-丁二醇5.7g/L（见图4）。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到(R,
R)-2,3-丁二醇生成（见图3）。
(R,
R)-2,3-丁二醇采用高效液相色谱检测：采用日本岛津高效液相色谱仪，RID-10A示差折光检测器，Aminex HPX-87H（美国Bio-Rad公司）色谱柱。柱温箱温度65℃，流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min。
方法二
无IPTG诱导的基因工程菌Escherichia
coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL发酵产(R, R)-2,3-丁二醇：
(1) 出发菌株：Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2) 种子液制备：
种子培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L，NaCl 10 g/L，氨苄青霉素50
µg/mL，溶剂为水；
培养条件：50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37℃，摇床转速220r/min，培养16h。
(3) 发酵培养：
发酵培养基：葡萄糖200 g/L，蛋白胨10
g/L，酵母膏7 g/L，NaCl
10 g/L，氨苄青霉素50 µg/mL，溶剂为水；
培养条件：接种量10%(v/v)，发酵温度37℃，全程不添加诱导剂，摇床转速220r/min，发酵48h。
设计基因工程菌在加IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在0.6~0.8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，然后30℃、200rpm诱导培8h，再转回37℃、220rpm进行发酵，发酵总时间48h。其他培养条件同无IPTG诱导的基因工程菌。
设计原始菌Escherichia coli MG1655的对照，种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。
发酵结果：基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将200 g/L葡萄糖转化得到75.5g/L的(R, R)-2,3-丁二醇。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖38g/L，生成(R, R)-2,3-丁二醇10.6g/L。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到(R, R)-2,3-丁二醇生成。
方法三
无IPTG诱导的基因工程菌Escherichia
coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL发酵产(R, R)-2,3-丁二醇：
(1) 出发菌株：Escherichia coli
MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2) 种子液制备：
种子培养基：蛋白胨7.5 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 7.5 g/L，氨苄青霉素35
µg/mL，溶剂为水；
培养条件：50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养14h。
(3) 发酵培养：
发酵培养基：葡萄糖140 g/L，蛋白胨7.5
g/L，酵母膏5 g/L，NaCl
7.5 g/L，氨苄青霉素35 µg/mL，溶剂为水；
培养条件：接种量7.5%(v/v)，发酵温度37℃，全程不添加诱导剂，摇床转速200r/min，发酵39h。
设计基因工程菌在加IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在0.6~0.8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度1.0 mmol/L，然后30℃、200rpm诱导培养8h，再转回37℃、200rpm进行发酵，发酵总时间39h。其他培养条件同无IPTG诱导的基因工程菌。
设计原始菌Escherichia coli MG1655的对照，种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。
发酵结果：基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将140 g/L葡萄糖转化得到55g/L的(R, R)-2,3-丁二醇。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖29g/L，生成(R, R)-2,3-丁二醇8.1g/L。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到(R, R)-2,3-丁二醇生成。
通过上述发酵过程可以发现，虽然IPTG诱导后基因工程菌表达了大量的目的蛋白，但是发酵液中目的产物(R,
R)-2,3-丁二醇的浓度却不高；没有IPTG诱导的基因工程菌表达的目的蛋白量虽然少，但是发酵液中却有高浓度的 (R, R)-2,3-丁二醇。其原因可能是：基因工程菌不加IPTG诱导的本底表达就可满足细菌代谢及(R,
R)-2,3-丁二醇的大量合成；而添加IPTG后，蛋白大量表达可能引起无活性的包涵体生成，使得2,3-丁二醇途径活性大量降低，同时IPTG对细胞也有毒害作用。
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pneumoniae CICC 10011
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atggacaaac agtatccggt acgccagtgg gcgcacggcg ccgatctcgt cgtcagccag 60
ctggaagctc agggcgtacg tcagatcttc ggtatccccg gcgccaaaat cgacaaggtg 120
ttcgactcac tgctggattc ctcgattcgc attattccgg tacgccacga agccaacgcc 180
gcgtttatgg ccgccgcggt cggacgcatt accggcaaag cgggcgtggc gctggtcacc 240
tccggtccgg gttgttccaa cctgatcacc ggcatggcca ccgcgaacag cgaaggcgac 300
ccggtggtgg ccctgggcgg cgcggtgaaa cgcgccgata aggcgaagca ggtccatcag 360
agtatggata cggtggcgat gttcagcccg gtcaccaaat acgccgtcga ggtgacggcg 420
ccggatgcgc tggcggaagt ggtctccaac gccttccgtg ccgccgagca gggccgcccg 480
ggcagcgcgt tcgtcagcct gccgcaggat gtggtcgatg gcccggtcag cggtaaagta 540
ctgccggcca gccgggctcc gcagatgggc gccgcaccgg atgacgccat cgaccaggtg 600
gcgaagctta tcgctcaggc gaagaacccg atcttcctgc tcggcctgat ggccagccag 660
ccggaaaaca gcgcggcgct gcgccgtttg ctggaggcca gccatattcc ggtcaccagc 720
acctatcagg ccgccggggc ggtgaatcag gataacttct ctcgtttcgc cggtcgggtc 780
gggctgttta acaaccaagc cggggaccgt ctgctgcagc tcgccgacct ggtgatctgc 840
atcggctaca gcccggtgga atatgaaccg gcgatgtgga acagcggcaa cgcgacgctg 900
gtgcatatcg acgtgctgcc cgcttatgaa gagcgcaact acaccccgga tgtcgagctg 960
gtgggcgata tcgccggcac cctcaacaag ctggcgcaaa atatcgatca ccggctggtg 1020
ctctccccgc aggcggcgga gatcctccgc gaccgccagc accagcgcga gctgctggac 1080
cgccgcggcg cgcagctgaa tcagtttgcc ctgcatccgc tgcgcatcgt tcgcgccatg 1140
caggatatcg tcaacagcga cgtcacgctg accgtggaca tgggcagctt ccatatctgg 1200
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accatgggcg tcgccctgcc ctgggccatc ggcgcctggc tggtcaatcc tgagcgcaaa 1320
gtggtctccg tctccggcga cggcggcttc ctgcagtcga gcatggagct ggagaccgcc 1380
gtccgcctga aagccaacgt gctgcatctc atctgggtcg ataacggcta caacatggtg 1440
gctattcagg aagagaaaaa atatcagcgc ctgtccggcg tcgagttcgg gccgatggat 1500
tttaaagcct atgccgaatc cttcggcgcc aaagggttcg tcgtggaaag cgccgaggcg 1560
ctggaaccga cgctgcgcgc ggcgatggac gtcgacggcc cggcggtggt ggccatcccg 1620
gtggattatc gcgataaccc gctgctgatg ggtcagctgc atctgagtca gattctgtaa 1680
<210> 2
<211> 780
<212> DNA
<213> Klebsiella
pneumoniae CICC 10011
<400> 2
atgaatcact ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctgt gcgaaaccct acgggcgttt 60
tccgcgcagc atcccgaaag cgtgctctat cagacatcgc taatgagcgc cctgctgagc 120
ggggtttacg aaggcagcac caccatcgcg gacctgctga aacacggcga tttcggcctc 180
ggcaccttta atgagctgga cggggagctg atcgccttca gcagccaggt ctatcagctg 240
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cacgacgtta ttgaccagca aattccctct gacaacctgt tctgcgccct gcgcatcgac 420
ggccatttcc gccatgccca tacccgcacc gtgccgcgcc agacgccacc gtaccgggcg 480
atgaccgacg tcctcgacga tcagccggtg ttccgcttta accagcgcga aggggtgctg 540
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tttattaccg atgaccgcaa aggcggcggt cacctgctgg attaccagct cgatcacggg 660
gtgctgacct tcggcgaaat tcacaagctg atgatcgacc tgcccgccga cagcgcgttc 720
ctgcaggcca atctgcatcc cgataatctc gatgccgcca tccgttccgt agaaagttaa 780
<210> 3
<211> 1041
<212> DNA
<213> Klebsiella
pneumoniae CICC 10011
<400> 3
atgaaggcag caagatggca taaccaaaag gatatccgta ttgaacatat cgaagagcca 60
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aatgaaacgg cacctgtcac aatggggcat gaattctccg gtgaagttgt cgaagtcgga 240
gaaggcgttg aaaattataa agttggagac cgcgttgtag tcgagccgat ttttgctaca 300
cacggccacc aaggcgccta caaccttgat gaacaaatgg gattcctcgg cttagccggc 360
ggaggcggcg gtttctctga atacgtctct gtggatgaag agcttttgtt caaacttcct 420
gatgaattat catatgaaca aggcgcgctc gttgaacctt ctgcagttgc tctatacgct 480
gtccgctcaa gcaaactcaa agcaggcgac aaagcggctg tattcggctg cggcccgatc 540
ggacttcttg tcattgaagc gctgaaggct gccggtgcaa ctgatattta cgctgttgag 600
ctttctcctg aacgccagca aaaagctgag gagcttggcg cgatcatcgt tgatccgtct 660
aaaacagacg atgtagtcgc tgagattgca gaacgtacag gaggcggtgt tgacgtagca 720
ttcgaagtca ctggtgtccc agtggtgtta cgacaagcca tccagtccac tacaattgcc 780
ggtgaaaccg tcatcgtcag catttgggaa aaaggtgctg aaatccatcc gaacgatatc 840
gtaatcaaag aacgtacagt aaaaggaatt atcggatacc gcgacatctt cccggctgta 900
ttgtcattaa tgaaagaagg ctatttctca gccgacaaac tcgtaacgaa aaaaatcgta 960
ctagatgatt tgatcgagga aggcttcggg gctcttatta aagagaaaag ccaagtcaaa 1020
atccttgtta gacctaacta a
1041
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P1
<400> 4
gatatggaca aacagtatcc ggt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P2
<400> 5
gcgttacaga atctgactca gat 23
<210> 6
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P3
<400> 6
tatgaccatg attacgagct ctaaggagga tatacatatg gacaaacagt atc 53
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P4
<400> 7
agcagagtga ttcatatgta tatcctcctt attacagaat ctgactcaga tgc 53
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P5
<400> 8
gctatgaatc actctgctga atg 23
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P6
<400> 9
gtcttaactt tctacggaac gga 23
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P7
<400> 10
aaatcgcgag ctcatgaatc actctgctga at 32
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P8
<400> 11
tgtatatcct ccttattaac tttctacgga acggat 36
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P9
<400> 12
tcaccatggg catgaaggca gcaaga 26
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P10
<400> 13
ggcgtcgact tagttaggtc taaca 25
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P11
<400> 14
tccgtagaaa gttaataagg aggatataca tatgaaggca gcaaga
46
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P12
<400> 15
cgcggatcct tagttaggtc taacaaggat tttg 34
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P13
<400> 16
gtctatgacc atgactacga gctc 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> P14
<400> 17
cgcaggatcc ttagttaggt ctaac 25
Claims (4)
1.一种基因工程菌在制备 (R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，其特征在于：
将基因工程菌接种至不添加IPTG的发酵培养基，在摇床转速180~220r/min 、35-38℃条件下发酵30~48h，收获含有(R, R)-2,3-丁二醇的发酵液；
所述发酵培养基为：葡萄糖80 ~ 200 g/L，蛋白胨5~10 g/L，酵母膏3~7 g/L，NaCl 5~10 g/L，氨苄青霉素20~50 µg/mL，溶剂为水；
所述基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体导入宿主菌得到的重组菌；所述宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655；所述表达载体为pTrc99a。
2.根据权利要求1所述基因工程菌在制备 (R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，其特征在于所述基因工程菌采用如下方法构建，包括如下步骤：
（1）从肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae) CICC 10011中分别扩增budB基因和budA基因，从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
168中扩增ydjL基因；
（2）利用重叠延伸PCR技术将budB基因、budA基因和ydjL基因拼接得到budB基因、budA基因和ydjL基因的融合基因；
（3）将所述融合基因插入表达载体的多克隆位点处，得到重组质粒；
（4）将所述重组质粒导入宿主内即得所述产(R, R)-2,3-丁二醇的基因工程菌。
3.根据权利要求2所述基因工程菌在制备 (R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，其特征在于：步骤（1）中用于扩增budB基因的引物为P1和P2；用于扩增budA基因的引物为P5和 P6；用于扩增ydjL基因的引物为P9和P10；
所述P1、P2、 P5、P6、P9和P10序列分别为：
P1：5’-GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，
P2：5’-GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，
P5：5’-GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6：5’-GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，
P9：5’-TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3’，
P10：5’-GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3’。
4.根据权利要求3所述基因工程菌在制备 (R, R)-2,3-丁二醇方面的应用，其特征在于：步骤（2）的具体方法为：
（
）将步骤（1）所得budB基因与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-budB，以P3和P4为引物扩增出含有budB基因的拼接序列1；所述P3和P4的序列如下：
P3：5’-TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG
TATC-3’，
P4：5’-AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC
TCAGATGC-3’；
（Ⅱ）将budA基因与载体pMD18-simple-T相连，获得重组质粒pMD18-simple-T-budA，以P7和P8为引物扩增出含有budA基因的拼接序列2；所述P7和P8的序列如下：
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’，
P8：5’-TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’；
（Ⅲ）将ydjL基因与载体pMD18-simple-T相连，获得重组质粒pMD18-simple-T-ydjL，以P11和P12为引物扩增出含有ydjL基因的拼接序列3；所述P11和P12的序列如下：
P11：5’-TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA
GA-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；
（Ⅳ）以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物1；以所述扩增产物1为模板，以P7及P12为引物扩增获得budA基因与ydjL基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下：
P7：5’-AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3’，
P12：5’-CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’；
以budA基因与ydjL基因的融合基因和拼接序列1的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物2；以扩增产物2为模板，P13及P14为引物，进行扩增，获得budB基因、budA基因和ydjL基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下：
P13：5’-GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’，
P14：5’-CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。
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