CN109554386A - 一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产d-木糖酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D‑木糖酸方法，是以大肠杆菌W3110为出发菌株，连续敲除其内源性基因获得工程菌E.coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac‑xylBC导入E.coli XGL2中，得到能高产D‑木糖酸的工程大肠杆菌E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC；再以玉米芯水解液为底物，生物发酵E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC，由发酵液得到D‑木糖酸。实验证实本发明方法能够生产获得D‑木糖酸91.2g/L，得率为1.05g D‑木糖酸/1g D‑木糖，生产效率为1.52g/[L·h]，为工业化生产D‑木糖酸并充分利用玉米芯提供了新途径。

Description

一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸 的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵生产D-木糖酸的方法。尤其涉及一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸的方法。

背景技术

玉米芯是第二大农作物废料(Kumar V et al.,Bioresour.Technol.,2018,251:416-419)，仅我国的玉米芯年产量就超过4千万吨(中国农业资源与区划.2016,37:1-8)。玉米芯经过简单处理后，可以形成富含木糖和少量葡萄糖的玉米芯水解液(Koqje A et al.,3Biotech,2016,6:127；Cai D et al.,Bioresour.Technol.,2016,211:677-684)，后者主要被用于制备D-木糖和木糖醇。相对于年需求量为24万吨的木糖醇来说，产能过剩的玉米芯如果处理不当则会造成环境问题(Zhang H et al.,Bioresour.Technol.,2018,257:223-228；Venkateswar Rao L et al.,Bioresour.Technol.,2016,213:199-310；Chen Met al.,Carbohyd.Polym.,2008,71:411-415)。因此，迫切需要开发新的玉米芯利用技术，以缓解玉米芯产量不断增多造成的环境压力。

D-木糖酸是一种五碳有机酸，可以应用在很多领域，例如食品、工业、医药等行业(Y et al.,Metab.Eng.,2011,13:383-391；Toivari MH et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8；Ma J et al.,Green Chem.,2016,18:1738-1750)。它还可以作为前体物质，用于1,2,4-丁三醇、1,4-丁二醇、3,4-二羟基丁醛、3,4-二羟基丁酸等重要化学品的生产(Zhang N et al.,Enzyme Microb.Technol.,2016,93:51-58；Wang J et al.,Metab.Eng.,2017,41:39-45；Liu H et al.,Metab.Eng.,2015,29:135-141)。由于其广泛的用途和工业化生产潜力，因此被美国能源部门评为前三十种重要化学品之一(Cao Y et al.,PLoS One,2013,8:e67305)。

根据文献报道，目前微生物法生产D-木糖酸的主要菌株包括筛选得到的野生菌和代谢工程改造后的基因工程菌。天然野生菌包括葡萄杆菌属、肠杆菌属和假单胞菌属等(Buchert J et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1988,27:333-336)。基因工程菌包括代谢工程改造后的酿酒酵母、大肠杆菌等。例如，Toivari等人在酿酒酵母中外源表达了里氏木霉中的木糖脱氢酶(xyd1)，生产了3.8g/L D-木糖酸(Toivari MH et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8)，后续又在具有水解液耐受性的酿酒酵母中敲除醛糖还原酶(GRE3)，又表达来自月柄杆菌的木糖脱氢酶(xylB)后，生产了43g/L D-木糖酸(Toivari M et al.,Metab.Eng.,2012,14:427-436)。Liu等人在大肠杆菌W3110中进行代谢工程改造，并外源表达xylB，实现了39.2g/L的D-木糖酸积累(Liu H et al.,Bioresour.Technol.,2012,115:244-248)。

利用天然野生菌生产D-木糖酸具有诸多缺点，例如，菌株培养条件复杂，成本高，产物不单一等。而利用基因工程菌生产D-木糖酸则具有生产效率低，产量低等限制工业化生产的问题。因此，迫切需要开发出一种利用工程菌以玉米芯水解液为底物，高产D-木糖酸的方法，既要解决D-木糖酸生产效率低，产量低的问题，又要为玉米芯产能过剩问题提供新思路。然而，目前尚未有利用玉米芯水解液生产D-木糖酸的报道。

发明内容

针对上述现有方法中，产品成本高、生产效率低、产量低、难以工业化生产的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用构建的基因工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸的方法，为玉米芯产能过剩提供一种利用途径。

本发明所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，步骤是：

(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术(Datsenko KA et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,2000,97:6640-6645)连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β-半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为Escherichia coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac-xylBC导入Escherichia coli XGL2中，获得在Escherichia coli XGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC；

(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC，由发酵液得到D-木糖酸；

其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；

玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D-木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。

上述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法中，步骤(一)所述工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC的构建方法是：

(1)采用中拷贝、含强启动活性Tac启动子的pETPtac表达载体外源表达来自月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，构建得到重组质粒pETPtac-xylBC；其中，所述木糖脱氢酶的xylB基因序列长度为747个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述木糖酸内酯酶的xylC基因序列长度为870个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该重组质粒pETPtac-xylBC图谱如图1所示；

(2)采用基因工程手段在野生型大肠杆菌W3110中敲除内源性木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF，阻断内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，得到工程大肠杆菌，命名为E.coli X3；其中：所述大肠杆菌内源性木糖异构酶基因xylA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述木糖酸脱水酶基因yjhG核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述木糖酸脱水酶基因yagF核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)采用基因工程手段在E.coli X3菌株中敲除内源性乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB和乙酸激酶基因ackA，阻断乳酸、乙醇的生成途径，削弱乙酸的生产途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XG4；其中，所述内源性乳酸脱氢酶基因ldhA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述乙醇脱氢酶基因adhE核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述丙酮酸氧化酶基因poxB核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述乙酸激酶基因ackA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4)采用基因工程手段在E.coli XG4菌株中敲除内源性磷酸转移酶系统中特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG，消除碳源代谢阻遏，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL1；所述葡萄糖转运蛋白基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(5)采用基因工程手段在E.coli XGL1菌株中敲除内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ，阻断乳糖降解途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL2；所述内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(6)在E.coli XGL2菌株中导入步骤(1)所述重组质粒pETPtac-xylBC，获得在E.coli XGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC。

上述基因工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，该菌的较佳培养温度为37±1℃，可以在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中生长。

上述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法中，步骤(二)所述利用工程大肠杆菌发酵生产D-木糖酸的条件优选是：

培养温度为37℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600转/分钟，通气量为1.0vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0，培养时间为40～55小时。

上述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法中，玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例优选为10:1，D-木糖含量不低于40g/L；乳糖诱导使用浓度优选为10～100mM。

进一步的，玉米芯水解液成分优选为：D-木糖118.5g/L；D-葡萄糖11.5g/L；L-阿拉伯糖11.8g/L；甲酸1.4g/L；乙醇0.83g/L；乙酸0.34g/L。

具体的，本发明所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法的步骤是：

(1)平板培养：将菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；

(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；

(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液以体积比为1～2％的接种量，接种到100mL含有50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；

(4)发酵培养：在无菌条件下，取步骤(3)所培养的菌液以体积比为5％～6％的接种量，接种到含有4L M9无机盐培养基的5-L发酵罐中，同时添加玉米芯水解液及终浓度为50μg/mL的卡那霉素及10mM乳糖。以如下发酵培养条件培养：搅拌桨转速为600rpm，通气量为1vvm，培养温度为37℃，采用14％的氨水自动调节pH至7.0，必要时采用消泡剂消泡。添加玉米芯水解液浓缩液后，发酵初始D-木糖浓度为40g/L，D-葡萄糖浓度为4g/L。选择在D-木糖浓度低于10g/L时进行补料，补加玉米芯水解液浓缩液至培养基中D-木糖浓度为30～40g/L。培养时间为36～60小时。

上述(1)～(4)所用LB培养基配方：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；LB培养基在121℃条件下高压灭菌20分钟。

M9无机盐培养基配方：Na₂HPO₄·12H₂O 12.069g/L；KH₂PO₄ 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH₄Cl 0.5g/L；酵母粉5g/L；MgSO₄母液0.1％(v/v)；CaCl₂母液0.03％(v/v)；金属离子母液1％(v/v)。采用NaOH调节M9无机盐培养基的pH至7.4，在121℃条件下高压灭菌20分钟。MgSO₄母液：1M MgSO₄·7H₂O。CaCl₂母液：1M CaCl₂·6H₂O。金属离子母液：EDTA 5g/L；FeCl₃·6H₂O 0.839g/L；ZnCl₂ 84mg/L；CuCl₂·2H₂O 13mg/L；CoCl₂·2H₂O 10mg/L；H₃BO₃10mg/L；MnCl₂·4H₂O 1.6mg/L。

玉米芯水解液单独在115℃条件下灭菌20分钟。

上述培养过程中，底物与产物的检测方法是：

采用生物传感分析仪(SBA-40D)检测D-葡萄糖。采用高效液相色谱仪(HPLC)Agilent 1100 Hewlett-Packard检测D-木糖、L-阿拉伯糖，分析条件为：示差折光检测器，Bio-Rad Aminex HPX-87P分析柱(300×7.8mm)，柱温75℃，流动相为纯水，流速0.7mL/min，进样体积5μL。采用HPLC检测D-木糖酸，分析条件为：紫外检测器，检测波长为210nm，Bio-Rad Aminex HPX-87H分析柱(300×7.8mm)，柱温55℃，流动相为10mM H₂SO₄，流速0.4mL/min，进样体积5μL。

本发明提供了一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法。实验证实：使用该方法能够生产获得D-木糖酸91.2g/L，得率为1.05g D-木糖酸/1gD-木糖，生产效率为1.52g/[L·h]，其结果如图2所示。

本发明具有的突出特点和有益效果是：

(1)本发明提供的基因工程菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC是一株能够高产D-木糖酸的菌株，其外源表达了来自月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，实现了大肠杆菌胞内D-木糖到D-木糖酸的转化；本发明通过敲除九个基因阻断了内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，乳酸、乙醇的生成途径，乳糖降解途径；削弱了乙酸的生产途径，消除了碳源代谢阻遏，最终实现了D-木糖酸高产。

(2)本发明所用菌株的培养基简单、发酵过程简单、无IPTG诱导、成本低，并且适合工业化应用。

(3)本发明能够发酵生产得到91.2g/L D-木糖酸，并具有高得率，高生产效率的优良特点，为解决玉米芯产能过剩问题提供了途径。

(4)本发明发酵产物单一，副产物有机酸积累减少，后续产物分离纯化简单，操作成本低，具有广泛的工业应用前景。

附图说明

图1 pETPtac-xylBC质粒图谱。

图2Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC以玉米芯水解液为底物的补料分批发酵过程曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

实施例1：Escherichia coli XGL2菌株的构建

(1)敲除方法：本发明所用基因敲除方法为一步法敲除技术(Datsenko KA etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.,2000,97:6640-6645)。该方法中，pKD4(CGSC7632)、pKD46(CGSC7669)、pCP20(CGSC14177)购自大肠杆菌基因保藏中心(纽黑文，美国.康涅狄格州)。

(2)突变片段的获得：上述方法中所用的核苷酸突变片段具有敲除基因上下游两个同源臂及卡那霉素抗性基因盒。本发明所用到的核苷酸突变片段有两种获得方式。其中xylA、ackA、adhE、poxB、ptsG和yjhG基因的核苷酸突变片段通过PCR直接扩增获得。其模板购自大肠杆菌基因保藏中心(纽黑文，美国.康涅狄格州)。ldhA、yagF和lacZ基因的核苷酸突变片段则通过重组PCR获得。其中扩增核苷酸突变片段的引物序列如下：

核苷酸突变片段直接扩增引物

xylA上游引物5’-TCACCGCGATAAACGTAACC-3’

xylA下游引物5’-CGGCAATACCCAATGCTTTA-3’

ackA上游引物5’-CATGCTTCACCTCAACTTCA-3’

ackA下游引物5’-GATTGCTGGAAAGCAGACCT-3’

adhE上游引物5’-AACATGCTAATGTAGCCACC-3’

adhE下游引物5’-ACGGCGAACAACATCGGTAA-3’

poxB上游引物5’-GAGGCGCTGGAAAGCAATAA-3’

poxB下游引物5’-TTGAATACTGCCCAGCACCG-3’

ptsG上游引物5’-GTTTCACATCGACGCTTCCC-3’

ptsG下游引物5’-TGCCTGTCATGCCAGAGTTG-3’

yjhG上游引物5’-ACGGTGCGATAACCGCCAGCGCTAA-3’

yjhG下游引物5’-AATATCAAACCAATATGGCCCAGCG-3’

核苷酸突变片段重组PCR引物

yagF上游引物一5’-ACGGGGCGATATCGGCGAGCGGCAACTTTG-3’

yagF下游引物一15’-GAAGCAGCTCCAGCCTACACCGTTATCGTCCGGCTCAGCA-3’

yagF上游引物二5’-TGCTGAGCCGGACGATAACGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

yagF下游引物二5’-GGTTTTATCTCTTAAAATAAATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

yagF上游引物三5’-GGACCATGGCTAATTCCCATTTATTTTAAGAGATAAAACC-3’

yagF下游引物三5’-GCCTGCCAGACGAAGCCGCAGGCGGTGTCT-3’

ldhA上游引物一5’-GGGAACCCACAGCCCGAGCGTCATC-3’

ldhA下游引物一15’-CTCCAGCCTACACAAGACTTTCTCC-3’

ldhA上游引物二5’-TGGAGAAAGTCTTGTGTAGGCTGGA-3’

ldhA下游引物二5’-GGGAGCGGCAAGAATGGGAATTAGC-3’

ldhA上游引物三5’-GGCTAATTCCCATTCTTGCCGCTCC-3’

ldhA下游引物三5’-CGGAAATCATCATTTTTTCACCAAA-3’

lacZ上游引物一5’-CCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGC-3’

lacZ下游引物一15’-CTCCAGCCTACACAGCTGTTTCCTG-3’

lacZ上游引物二5’-ACAGGAAACAGCTGTGTAGGCTGGA-3’

lacZ下游引物二5’-TGCCCGGTTATTAATGGGAATTAGC-3’

lacZ上游引物三5’-GGCTAATTCCCATTAATAACCGGGC-3’

lacZ下游引物三5’-CATGCCGGTAATAATCCACAGCAGG-3’

(3)感受态制备与电转：将pKD46质粒采用化学法导入目的菌株后，采用携带有50μg/mL壮观霉素抗性LB固体平板筛选重组菌株，验证后培养并进行感受态制备。采用携带有50μg/mL壮观霉素抗性50mL LB液体培养基培养重组菌株，30℃培养30分钟后加入终浓度为0.5mM IPTG诱导，待OD至0.5～0.6时6000转10分钟离心収菌。去上清后，菌体采用40mL 4℃预冷纯水洗涤2遍，再用40mL 4℃预冷10％甘油洗涤1遍。离心收集后的菌体采用150μL10％甘油重悬，并加入100ng/μL核苷酸突变片段混匀，分装至2个预冷的2mm电转杯。利用电转仪在电压2200V，电容25μF，电阻200Ω条件下电转。采用500μL LB液体重悬菌液，在37℃，180转摇床中孵育40分钟后涂布含有50μg/mL卡那霉素抗性平板，37℃培养箱培养12～13小时后，挑单一菌落PCR验证。

(4)卡那霉素抗性基因消除：将PCR验证正确的菌株采用化学法导入pCP20质粒，在30℃，180转摇床中孵育40分钟后涂布含有40μg/mL氯霉素抗性LB平板，30℃培养箱培养16～17小时后挑取单一菌落进行验证。将验证正确的菌株接种至无抗LB液体培养基，放置42℃，180转摇床培养2代后，37℃划线培养。挑取同一菌落分别点板至LB无抗平板、40μg/mL氯霉素抗性LB平板和50μg/mL卡那霉素抗性平板上，培养12～13小时。选择无抗平板上生长的，但在抗性平板上不生长的菌落进行菌株PCR验证。

将验证正确的菌株保菌，待用。

实施例2：含木糖脱氢酶基因xylB与木糖酸内酯酶基因xylC表达载体的构建

(1)基因克隆：携带有木糖脱氢酶基因xylB基因与木糖酸内酯酶基因xylC基因的原始pET28a-xylBC载体由通用生物系统(安徽)有限公司(滁州，中国.安徽)合成。木糖脱氢酶基因xylB核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；木糖酸内酯酶基因xylC核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。以该基因核苷酸序列设计引物，并使用合成引物以该载体为模板扩增得到目的片段，该片段含有xylB、xylC与限制性酶切位点EcoRⅠ、HindⅢ。扩增引物序列如下：

上游引物5’-ATATGAATTCATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCC-3’，携带一个EcoRⅠ位点；

下游引物5’-ATCAAAGCTTTTAGACAAGGCGGACCTCATGCTGG-3’，携带一个HindⅢ位点。

(2)将步骤(1)PCR扩增得到的片段回收并与质粒pETPtac在限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ下进行酶切反应和核苷酸电泳。将回收的片段xylBC及pETPtac进行连接反应，得到重组质粒pETPtac-xylBC。

(3)将上述质粒经转化导入宿主Escherichia coli XGL2中得到工程菌株，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC。

上述重组大肠埃希氏菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，较佳培养温度为37±1℃，可以在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基上生长，并可以用于以玉米芯水解液为底物生产D-木糖酸。

实施例3：利用Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸

(1)平板培养：将菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC划线到含有质量体积比为1.5～1.8％琼脂并含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37±1℃培养12±1小时；

(2)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落，然后接种到5mL的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；

(3)二级种子：在无菌条件下，取步骤(2)所培养的菌液，以体积比为1～2％的接种量接种到100mL含有50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃摇床振荡培养12±1小时；

(4)发酵培养：在无菌条件下，取步骤(3)所培养的菌液，以体积比为5％～6％的接种量接种到含有4L M9无机盐培养基的5-L发酵罐中，同时添加玉米芯水解液及终浓度为50μg/mL的卡那霉素及10mM乳糖。培养时间为36～60小时。

发酵培养条件：搅拌桨转速为600rpm，通气量为1vvm，培养温度为37℃，采用14％的氨水自动调节pH至7.0，必要时采用消泡剂消泡。添加玉米芯水解液浓缩液后，发酵初始D-木糖浓度为40g/L，D-葡萄糖浓度为4g/L。选择在D-木糖浓度低于10g/L时进行补料，补加玉米芯水解浓缩液直到培养基中D-木糖浓度为30～40g/L。

上述(1)～(4)所用LB培养基配方：蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；NaCl 10g/L；LB培养基在121℃条件下高压灭菌20分钟。

M9无机盐培养基配方：Na₂HPO₄·12H₂O 12.069g/L；KH₂PO₄ 3g/L；NaCl 0.5g/L；NH₄Cl 0.5g/L；酵母粉5g/L；MgSO₄母液0.1％(v/v)；CaCl₂母液0.03％(v/v)；金属离子母液1％(v/v)。采用NaOH调节M9无机盐培养基的pH至7.4，在121℃条件下高压灭菌20分钟。MgSO₄母液：1M MgSO₄·7H₂O。CaCl₂母液：1M CaCl₂·6H₂O。金属离子母液：EDTA 5g/L；FeCl₃·6H₂O 0.839g/L；ZnCl₂ 84mg/L；CuCl₂·2H₂O 13mg/L；CoCl₂·2H₂O 10mg/L；H₃BO₃10mg/L；MnCl₂·4H₂O 1.6mg/L。

玉米芯水解液成分：D-木糖118.5g/L；D-葡萄糖11.5g/L；L-阿拉伯糖11.8g/L；甲酸1.4g/L；乙醇0.83g/L；乙酸0.34g/L等。与其相似的玉米芯水解液含D-木糖及D-葡萄糖浓度比例约为10:1。玉米芯水解液单独在115℃条件下灭菌20分钟。

其结果显示，该菌能够生产D-木糖酸91.2g/L，得率为1.05g D-木糖酸/1g D-木糖，生产效率为1.52g/[L·h]，其结果如图2所示。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸的方法

<141> 2018-12-07

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 747

<212> DNA

<213> 月柄杆菌(Caulobacter crescentus)

<221> 木糖脱氢酶基因xylB序列

<400> 1

atgtcctcag ccatctatcc cagcctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggc 60

tcgggcatcg gggccggcct caccgccggc ttcgcccgtc agggcgcgga ggtgatcttc 120

ctcgacatcg ccgacgagga ctccagggct cttgaggccg agctggccgg ctcgccgatc 180

ccgccggtct acaagcgctg cgacctgatg aacctcgagg cgatcaaggc ggtcttcgcc 240

gagatcggcg acgtcgacgt gctggtcaac aacgccggca atgacgaccg ccacaagctg 300

gccgacgtga ccggcgccta ttgggacgag cggatcaacg tcaacctgcg ccacatgctg 360

ttctgcaccc aggccgtcgc gccgggcatg aagaagcgtg gcggcggggc ggtgatcaac 420

ttcggttcga tcagctggca cctggggctt gaggacctcg tcctctacga aaccgccaag 480

gccggcatcg aaggcatgac ccgcgcgctg gcccgggagc tgggtcccga cgacatccgc 540

gtcacctgcg tggtgccggg caacgtcaag accaagcgcc aggagaagtg gtacacgccc 600

gaaggcgagg cccagatcgt ggcggcccaa tgcctgaagg gccgcatcgt cccggagaac 660

gtcgccgcgc tggtgctgtt cctggcctcg gatgacgcgt cgctctgcac cggccacgaa 720

tactggatcg acgccggctg gcgttga 747

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 月柄杆菌(Caulobacter crescentus)

<221> 木糖脱氢酶基因xylC序列

<400> 2

atgaccgctc aagtcacttg cgtatgggat ctgaaggcca cgttgggcga aggcccgatc 60

tggcatggcg acaccctgtg gttcgtcgac atcaagcagc gtaaaatcca caactaccac 120

cccgccaccg gcgagcgctt cagcttcgac gcgccggatc aggtgacctt cctcgcgccg 180

atcgtcggcg cgaccggctt tgtcgtcggt ctgaagaccg ggattcaccg cttccacccg 240

gccacgggct tcagcctgct gctcgaggtc gaggacgcgg cgctgaacaa ccgccccaac 300

gacgccacgg tcgacgcgca aggccgtctg tggttcggca ccatgcacga cggggaagag 360

aacaatagcg gctcgctcta tcggatggac ctcaccggcg tcgcccggat ggaccgcgac 420

atctgcatca ccaacggccc gtgcgtctcg cccgacggca agaccttcta ccacaccgac 480

accctggaaa agacgatcta cgccttcgac ctggccgagg acggcctgct gtcgaacaag 540

cgcgtcttcg tgcagttcgc cctgggcgac gatgtctatc cggacggttc ggtcgtcgat 600

tccgaaggct atctgtggac cgccctgtgg ggcggtttcg gcgcggtccg cttctcgccg 660

caaggcgacg ccgtgacgcg catcgaactg cccgccccca acgtcaccaa gccctgcttc 720

ggcgggcctg acctgaagac cctctatttc accaccgccc gcaagggcct gagcgacgag 780

accctggccc agtacccgct ggccggcggt gtgttcgccg ttccggtcga tgtggccggc 840

caaccccagc atgaggtccg ccttgtctaa 870

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因xylA序列

<400> 3

atgcaagcct attttgacca gctcgatcgc gttcgttatg aaggctcaaa atcctcaaac 60

ccgttagcat tccgtcacta caatcccgac gaactggtgt tgggtaagcg tatggaagag 120

cacttgcgtt ttgccgcctg ctactggcac accttctgct ggaacggggc ggatatgttt 180

ggtgtggggg cgtttaatcg tccgtggcag cagcctggtg aggcactggc gttggcgaag 240

cgtaaagcag atgtcgcatt tgagtttttc cacaagttac atgtgccatt ttattgcttc 300

cacgatgtgg atgtttcccc tgagggcgcg tcgttaaaag agtacatcaa taattttgcg 360

caaatggttg atgtcctggc aggcaagcaa gaagagagcg gcgtgaagct gctgtgggga 420

acggccaact gctttacaaa ccctcgctac ggcgcgggtg cggcgacgaa cccagatcct 480

gaagtcttca gctgggcggc aacgcaagtt gttacagcga tggaagcaac ccataaattg 540

ggcggtgaaa actatgtcct gtggggcggt cgtgaaggtt acgaaacgct gttaaatacc 600

gacttgcgtc aggagcgtga acaactgggc cgctttatgc agatggtggt tgagcataaa 660

cataaaatcg gtttccaggg cacgttgctt atcgaaccga aaccgcaaga accgaccaaa 720

catcaatatg attacgatgc cgcgacggtc tatggcttcc tgaaacagtt tggtctggaa 780

aaagagatta aactgaacat tgaagctaac cacgcgacgc tggcaggtca ctctttccat 840

catgaaatag ccaccgccat tgcgcttggc ctgttcggtt ctgtcgacgc caaccgtggc 900

gatgcgcaac tgggctggga caccgaccag ttcccgaaca gtgtggaaga gaatgcgctg 960

gtgatgtatg aaattctcaa agcaggcggt ttcaccaccg gtggtctgaa cttcgatgcc 1020

aaagtacgtc gtcaaagtac tgataaatat gatctgtttt acggtcatat cggcgcgatg 1080

gatacgatgg cactggcgct gaaaattgca gcgcgcatga ttgaagatgg cgagctggat 1140

aaacgcatcg cgcagcgtta ttccggctgg aatagcgaat tgggccagca aatcctgaaa 1200

ggccaaatgt cactggcaga tttagccaaa tatgctcagg aacatcattt gtctccggtg 1260

catcagagtg gtcgccagga acaactggaa aatctggtaa accattatct gttcgacaaa 1320

taa 1323

<210> 4

<211> 1968

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因yjhG序列

<400> 4

atgtctgttc gcaatatttt tgctgacgag agccacgata tttacaccgt cagaacgcac 60

gccgatggcc cggacggcga actcccatta accgcagaga tgcttatcaa ccgcccgagc 120

ggggatctgt tcggtatgac catgaatgcc ggaatgggtt ggtctccgga cgagctggat 180

cgggacggta ttttactgct cagtacactc ggtggcttac gcggcgcaga cggtaaaccc 240

gtggcgctgg cgttgcacca ggggcattac gaactggaca tccagatgaa agcggcggcc 300

gaggttatta aagccaacca tgccctgccc tatgccgtgt acgtctccga tccttgtgac 360

gggcgtactc agggtacaac ggggatgttt gattcgctac cataccgaaa tgacgcatcg 420

atggtaatgc gccgccttat tcgctctctg cccgacgcga aagcagttat tggtgtggcg 480

agttgcgata aggggcttcc ggccaccatg atggcactcg ccgcgcagca caacatcgca 540

accgtgctgg tccccggcgg cgcgacgctg cccgcaaagg atggagaaga caacggcaag 600

gtgcaaacca ttggcgcacg cttcgccaat ggcgaattat ctctacagga cgcacgccgt 660

gcgggctgta aagcctgtgc ctcttccggc ggcggctgtc aatttttggg cactgccggg 720

acatctcagg tggtggccga aggattggga ctggcaatcc cacattcagc cctggcccct 780

tccggtgagc ctgtgtggcg ggagatcgcc agagcttccg cgcgagctgc gctgaacctg 840

agtcaaaaag gcatcaccac ccgggaaatt ctcaccgata aagcgataga gaatgcgatg 900

acggtccatg ccgcgttcgg tggttcaaca aacctgctgt tacacatccc ggcaattgct 960

caccaggcag gttgccatat cccgaccgtt gatgactgga tccgcatcaa caagcgcgtg 1020

ccccgactgg tgagcgtact gcctaatggc ccggtttatc atccaacggt caatgccttt 1080

atggcaggtg gtgtgccgga agtcatgttg catctgcgca gcctcggatt gttgcatgaa 1140

gacgttatga cggttaccgg cagcacgctg aaagaaaacc tcgactggtg ggagcactcc 1200

gaacggcgtc agcggttcaa gcaactcctg ctcgatcagg aacaaatcaa cgctgacgaa 1260

gtgatcatgt ctccgcagca agcaaaagcg cgcggattaa cctcaactat caccttcccg 1320

gtgggcaata ttgcgccaga aggttcggtg atcaaatcca ccgccattga cccctcgatg 1380

attgatgagc aaggtatcta ttaccataaa ggtgtggcga aggtttatct gtccgagaaa 1440

agtgcgattt acgatatcaa acatgacaag atcaaggcgg gcgatattct ggtcattatt 1500

ggcgttggac cttcaggtac agggatggaa gaaacctacc aggttaccag tgccctgaag 1560

catctgtcat acggtaagca tgtttcgtta atcaccgatg cacgtttctc gggcgtttct 1620

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ttacgcaccg gggatttaat tgaaattaaa attgattgtc gcgagcttca cggcgaagtc 1740

aatttcctcg gaacccgtag cgatgaacaa ttaccttcac aggaggaggc aactgcaata 1800

ttaaatgcca gacccagcca tcaggattta cttcccgatc ctgaattgcc agatgatacc 1860

cggctatggg caatgcttca ggccgtgagt ggtgggacat ggaccggttg tatttatgat 1920

gtaaacaaaa ttggcgcggc tttgcgcgat tttatgaata aaaactga 1968

<210> 5

<211> 1968

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因yagF序列

<400> 5

atgaccattg agaaaatttt caccccgcag gacgacgcgt tttatgcggt gatcacccac 60

gcggcggggc cgcagggcgc tctgccgctg accccgcaga tgctgatgga atctcccagc 120

ggcaacctgt tcggcatgac gcagaacgcc gggatgggct gggacgccaa caagctcacc 180

ggcaaagagg tgctgattat cggcactcag ggcggcatcc gcgccggaga cggacgccca 240

atcgcgctgg gctaccacac cgggcattgg gagatcggca tgcagatgca ggcggcggcg 300

aaggagatca cccgcaatgg cgggatcccg ttcgcggcct tcgtcagcga tccgtgcgac 360

gggcgctcgc agggcacgca cggtatgttc gattccctgc cgtaccgcaa cgacgcggcg 420

atcgtgtttc gccgcctgat ccgctccctg ccgacgcggc gggcggtgat cggcgtagcg 480

acctgcgata aagggctgcc cgccaccatg attgcgctgg ccgcgatgca cgacctgccg 540

actattctgg tgccgggcgg ggcgacgctg ccgccgaccg tcggggaaga cgcgggcaag 600

gtgcagacca tcggcgcgcg tttcgccaac cacgaactct ccctgcagga ggccgccgaa 660

ctgggctgtc gcgcctgcgc ctcgccgggc ggcgggtgtc agttcctcgg cacggcgggc 720

acctcgcagg tggtcgcgga ggcgctgggt ctggcgctgc cgcactccgc gctggcgccg 780

tccgggcagg cggtgtggct ggagatcgcc cgccagtcgg cgcgcgcggt cagcgagctg 840

gatagccgcg gcatcaccac gcgggatatc ctctccgata aagccatcga aaacgcgatg 900

gtgatccacg cggcgttcgg cggctccacc aatttactgc tgcacattcc ggccatcgcc 960

cacgcggcgg gctgcacgat cccggacgtt gagcactgga cgcgcatcaa ccgtaaagtg 1020

ccgcgtctgg tgagcgtgct gcccaacggc ccggactatc acccgaccgt gcgcgccttc 1080

ctcgcgggcg gcgtgccgga ggtgatgctc cacctgcgcg acctcggcct gctgcatctg 1140

gacgccatga ccgtgaccgg ccagacggtg ggcgagaacc ttgaatggtg gcaggcgtcc 1200

gagcgccggg cgcgcttccg ccagtgcctg cgcgagcagg acggcgtaga gccggatgac 1260

gtgatcctgc cgccggagaa ggcaaaagcg aaagggctga cctcgacggt ctgcttcccg 1320

acgggcaaca tcgctccgga aggttcggtg atcaaggcca cggcgatcga cccgtcggtg 1380

gtgggcgaag atggcgtata ccaccacacc ggccgggtgc gggtgtttgt ctcggaagcg 1440

caggcgatca aggcgatcaa gcgggaagag attgtgcagg gcgatatcat ggtggtgatc 1500

ggcggcgggc cgtccggcac cggcatggaa gagacctacc agctcacctc cgcgctaaag 1560

catatctcgt ggggcaagac ggtgtcgctc atcaccgatg cgcgcttctc gggcgtgtcg 1620

acgggcgcct gcttcggcca cgtgtcgccg gaggcgctgg cgggcgggcc gattggcaag 1680

ctgcgcgata acgacatcat cgagattgcc gtggatcgtc tgacgttaac tggcagcgtg 1740

aacttcatcg gcaccgcgga caacccgctg acgccggaag agggcgcgcg cgagctggcg 1800

cggcggcaga cgcacccgga cctgcacgcc cacgactttt tgccggacga cacccggctg 1860

tgggcggcac tgcagtcggt gagcggcggc acctggaaag gctgtattta tgacaccgat 1920

aaaattatcg aggtaattaa cgccggtaaa aaagcgctcg gaatttaa 1968

<210> 6

<211> 990

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因ldhA序列

<400> 6

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120

actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180

ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240

aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300

gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360

caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420

actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480

cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540

gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600

atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660

gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720

caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780

gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840

ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900

gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990

<210> 7

<211> 2676

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因adhE序列

<400> 7

atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60

cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120

gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180

atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240

aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300

gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360

atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420

cgtgcaaaag atgccaccaa caaagcggct gatatcgttc tgcaggctgc tatcgctgcc 480

ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540

ctgatgcacc acccagacat caacctgatc ctcgcgactg gtggtccggg catggttaaa 600

gccgcataca gctccggtaa accagctatc ggtgtaggcg cgggcaacac tccagttgtt 660

atcgatgaaa ctgctgatat caaacgtgca gttgcatctg tactgatgtc caaaaccttc 720

gacaacggcg taatctgtgc ttctgaacag tctgttgttg ttgttgactc tgtttatgac 780

gctgtacgtg aacgttttgc aacccacggc ggctatctgt tgcagggtaa agagctgaaa 840

gctgttcagg atgttatcct gaaaaacggt gcgctgaacg cggctatcgt tggtcagcca 900

gcctataaaa ttgctgaact ggcaggcttc tctgtaccag aaaacaccaa gattctgatc 960

ggtgaagtga ccgttgttga tgaaagcgaa ccgttcgcac atgaaaaact gtccccgact 1020

ctggcaatgt accgcgctaa agatttcgaa gacgcggtag aaaaagcaga gaaactggtt 1080

gctatgggcg gtatcggtca tacctcttgc ctgtacactg accaggataa ccaaccggct 1140

cgcgtttctt acttcggtca gaaaatgaaa acggcgcgta tcctgattaa caccccagcg 1200

tctcagggtg gtatcggtga cctgtataac ttcaaactcg caccttccct gactctgggt 1260

tgtggttctt ggggtggtaa ctccatctct gaaaacgttg gtccgaaaca cctgatcaac 1320

aagaaaaccg ttgctaagcg agctgaaaac atgttgtggc acaaacttcc gaaatctatc 1380

tacttccgcc gtggctccct gccaatcgcg ctggatgaag tgattactga tggccacaaa 1440

cgtgcgctca tcgtgactga ccgcttcctg ttcaacaatg gttatgctga tcagatcact 1500

tccgtactga aagcagcagg cgttgaaact gaagtcttct tcgaagtaga agcggacccg 1560

accctgagca tcgttcgtaa aggtgcagaa ctggcaaact ccttcaaacc agacgtgatt 1620

atcgcgctgg gtggtggttc cccgatggac gccgcgaaga tcatgtgggt tatgtacgaa 1680

catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740

tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800

acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860

ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920

gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980

gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040

ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100

gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160

gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220

aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280

actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340

cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400

tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460

caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcatt cgatgaccag 2520

tgcaccggcg ctaacccgcg ttacccgctg atctccgagc tgaaacagat tctgctggat 2580

acctactacg gtcgtgatta tgtagaaggt gaaactgcag cgaagaaaga agctgctccg 2640

gctaaagctg agaaaaaagc gaaaaaatcc gcttaa 2676

<210> 8

<211> 1719

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因poxB序列

<400> 8

atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc 60

atctggggag tcacaggcga ctctctgaac ggtcttagtg acagtcttaa tcgcatgggc 120

accatcgagt ggatgtccac ccgccacgaa gaagtggcgg cctttgccgc tggcgctgaa 180

gcacaactta gcggagaact ggcggtctgc gccggatcgt gcggccccgg caacctgcac 240

ttaatcaacg gcctgttcga ttgccaccgc aatcacgttc cggtactggc gattgccgct 300

catattccct ccagcgaaat tggcagcggc tatttccagg aaacccaccc acaagagcta 360

ttccgcgaat gtagtcacta ttgcgagctg gtttccagcc cggagcagat cccacaagta 420

ctggcgattg ccatgcgcaa agcggtgctt aaccgtggcg tttcggttgt cgtgttacca 480

ggcgacgtgg cgttaaaacc tgcgccagaa ggggcaacca tgcactggta tcatgcgcca 540

caaccagtcg tgacgccgga agaagaagag ttacgcaaac tggcgcaact gctgcgttat 600

tccagcaata tcgccctgat gtgtggcagc ggctgcgcgg gggcgcataa agagttagtt 660

gagtttgccg ggaaaattaa agcgcctatt gttcatgccc tgcgcggtaa agaacatgtc 720

gaatacgata atccgtatga tgttggaatg accgggttaa tcggcttctc gtcaggtttc 780

cataccatga tgaacgccga cacgttagtg ctactcggca cgcaatttcc ctaccgcgcc 840

ttctacccga ccgatgccaa aatcattcag attgatatca acccagccag catcggcgct 900

cacagcaagg tggatatggc actggtcggc gatatcaagt cgactctgcg tgcattgctt 960

ccattggtgg aagaaaaagc cgatcgcaag tttctggata aagcgctgga agattaccgc 1020

gacgcccgca aagggctgga cgatttagct aaaccgagcg agaaagccat tcacccgcaa 1080

tatctggcgc agcaaattag tcattttgcc gccgatgacg ctattttcac ctgtgacgtt 1140

ggtacgccaa cggtgtgggc ggcacgttat ctaaaaatga acggcaagcg tcgcctgtta 1200

ggttcgttta accacggttc gatggctaac gccatgccgc aggcgctggg tgcgcaggcg 1260

acagagccag aacgtcaggt ggtcgccatg tgcggcgatg gcggttttag catgttgatg 1320

ggcgatttcc tctcagtagt gcagatgaaa ctgccagtga aaattgtcgt ctttaacaac 1380

agcgtgctgg gctttgtggc gatggagatg aaagctggtg gctatttgac tgacggcacc 1440

gaactacacg acacaaactt tgcccgcatt gccgaagcgt gcggcattac gggtatccgt 1500

gtagaaaaag cgtctgaagt tgatgaagcc ctgcaacgcg ccttctccat cgacggtccg 1560

gtgttggtgg atgtggtggt cgccaaagaa gagttagcca ttccaccgca gatcaaactc 1620

gaacaggcca aaggtttcag cctgtatatg ctgcgcgcaa tcatcagcgg acgcggtgat 1680

gaagtgatcg aactggcgaa aacaaactgg ctaaggtaa 1719

<210> 9

<211> 1203

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因ackA序列

<400> 9

atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60

atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120

gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180

gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240

ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300

agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360

ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420

ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480

tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540

gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600

gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660

cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720

ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780

atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840

gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900

cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960

atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020

gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080

aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140

gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200

tga 1203

<210> 10

<211> 1434

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因ptsG序列

<400> 10

atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcgctgat gctgccggta 60

tccgtactgc ctatcgcagg tattctgctg ggcgtcggtt ccgcgaattt cagctggctg 120

cccgccgttg tatcgcatgt tatggcagaa gcaggcggtt ccgtctttgc aaacatgcca 180

ctgatttttg cgatcggtgt cgccctcggc tttaccaata acgatggcgt atccgcgctg 240

gccgcagttg ttgcctatgg catcatggtt aaaaccatgg ccgtggttgc gccactggta 300

ctgcatttac ctgctgaaga aatcgcctct aaacacctgg cggatactgg cgtactcgga 360

gggattatct ccggtgcgat cgcagcgtac atgtttaacc gtttctaccg tattaagctg 420

cctgagtatc ttggcttctt tgccggtaaa cgctttgtgc cgatcatttc tggcctggct 480

gccatcttta ctggcgttgt gctgtccttc atttggccgc cgattggttc tgcaatccag 540

accttctctc agtgggctgc ttaccagaac ccggtagttg cgtttggcat ttacggtttc 600

atcgaacgtt gcctggtacc gtttggtctg caccacatct ggaacgtacc tttccagatg 660

cagattggtg aatacaccaa cgcagcaggt caggttttcc acggcgacat tccgcgttat 720

atggcgggtg acccgactgc gggtaaactg tctggtggct tcctgttcaa aatgtacggt 780

ctgccagctg ccgcaattgc tatctggcac tctgctaaac cagaaaaccg cgcgaaagtg 840

ggcggtatta tgatctccgc ggcgctgacc tcgttcctga ccggtatcac cgagccgatc 900

gagttctcct tcatgttcgt tgcgccgatc ctgtacatca tccacgcgat tctggcaggc 960

ctggcattcc caatctgtat tcttctgggg atgcgtgacg gtacgtcgtt ctcgcacggt 1020

ctgatcgact tcatcgttct gtctggtaac agcagcaaac tgtggctgtt cccgatcgtc 1080

ggtatcggtt atgcgattgt ttactacacc atcttccgcg tgctgattaa agcactggat 1140

ctgaaaacgc cgggtcgtga agacgcgact gaagatgcaa aagcgacagg taccagcgaa 1200

atggcaccgg ctctggttgc tgcatttggt ggtaaagaaa acattactaa cctcgacgca 1260

tgtattaccc gtctgcgcgt cagcgttgct gatgtgtcta aagtggatca ggccggcctg 1320

aagaaactgg gcgcagcggg cgtagtggtt gctggttctg gtgttcaggc gattttcggt 1380

actaaatccg ataacctgaa aaccgagatg gatgagtaca tccgtaacca ctaa 1434

<210> 11

<211> 3075

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<221> 木糖脱氢酶基因lacZ序列

<400> 11

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 60

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180

tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240

gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300

tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360

acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420

cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480

ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540

ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600

caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660

acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720

ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780

ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840

gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccgaaa 900

ctgtggagcg ccgaaatccc gaatctctat cgtgcggtgg ttgaactgca caccgccgac 960

ggcacgctga ttgaagcaga agcctgcgat gtcggtttcc gcgaggtgcg gattgaaaat 1020

ggtctgctgc tgctgaacgg caagccgttg ctgattcgag gcgttaaccg tcacgagcat 1080

catcctctgc atggtcaggt catggatgag cagacgatgg tgcaggatat cctgctgatg 1140

aagcagaaca actttaacgc cgtgcgctgt tcgcattatc cgaaccatcc gctgtggtac 1200

acgctgtgcg accgctacgg cctgtatgtg gtggatgaag ccaatattga aacccacggc 1260

atggtgccaa tgaatcgtct gaccgatgat ccgcgctggc taccggcgat gagcgaacgc 1320

gtaacgcgaa tggtgcagcg cgatcgtaat cacccgagtg tgatcatctg gtcgctgggg 1380

aatgaatcag gccacggcgc taatcacgac gcgctgtatc gctggatcaa atctgtcgat 1440

ccttcccgcc cggtgcagta tgaaggcggc ggagccgaca ccacggccac cgatattatt 1500

tgcccgatgt acgcgcgcgt ggatgaagac cagcccttcc cggctgtgcc gaaatggtcc 1560

atcaaaaaat ggctttcgct acctggagag acgcgcccgc tgatcctttg cgaatacgcc 1620

cacgcgatgg gtaacagtct tggcggtttc gctaaatact ggcaggcgtt tcgtcagtat 1680

ccccgtttac agggcggctt cgtctgggac tgggtggatc agtcgctgat taaatatgat 1740

gaaaacggca acccgtggtc ggcttacggc ggtgattttg gcgatacgcc gaacgatcgc 1800

cagttctgta tgaacggtct ggtctttgcc gaccgcacgc cgcatccagc gctgacggaa 1860

gcaaaacacc agcagcagtt tttccagttc cgtttatccg ggcaaaccat cgaagtgacc 1920

agcgaatacc tgttccgtca tagcgataac gagctcctgc actggatggt ggcgctggat 1980

ggtaagccgc tggcaagcgg tgaagtgcct ctggatgtcg ctccacaagg taaacagttg 2040

attgaactgc ctgaactacc gcagccggag agcgccgggc aactctggct cacagtacgc 2100

gtagtgcaac cgaacgcgac cgcatggtca gaagccgggc acatcagcgc ctggcagcag 2160

tggcgtctgg cggaaaacct cagtgtgacg ctccccgccg cgtcccacgc catcccgcat 2220

ctgaccacca gcgaaatgga tttttgcatc gagctgggta ataagcgttg gcaatttaac 2280

cgccagtcag gctttctttc acagatgtgg attggcgata aaaaacaact gctgacgccg 2340

ctgcgcgatc agttcacccg tgcaccgctg gataacgaca ttggcgtaag tgaagcgacc 2400

cgcattgacc ctaacgcctg ggtcgaacgc tggaaggcgg cgggccatta ccaggccgaa 2460

gcagcgttgt tgcagtgcac ggcagataca cttgctgatg cggtgctgat tacgaccgct 2520

cacgcgtggc agcatcaggg gaaaacctta tttatcagcc ggaaaaccta ccggattgat 2580

ggtagtggtc aaatggcgat taccgttgat gttgaagtgg cgagcgatac accgcatccg 2640

gcgcggattg gcctgaactg ccagctggcg caggtagcag agcgggtaaa ctggctcgga 2700

ttagggccgc aagaaaacta tcccgaccgc cttactgccg cctgttttga ccgctgggat 2760

ctgccattgt cagacatgta taccccgtac gtcttcccga gcgaaaacgg tctgcgctgc 2820

gggacgcgcg aattgaatta tggcccacac cagtggcgcg gcgacttcca gttcaacatc 2880

agccgctaca gtcaacagca actgatggaa accagccatc gccatctgct gcacgcggaa 2940

gaaggcacat ggctgaatat cgacggtttc catatgggga ttggtggcga cgactcctgg 3000

agcccgtcag tatcggcgga attccagctg agcgccggtc gctaccatta ccagttggtc 3060

tggtgtcaaa aataa 3075

Claims (5)

1.一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，步骤是：

(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β-半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为Escherichia coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac-xylBC导入Escherichia coli XGL2中，获得在Escherichia coli XGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC；

(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌Escherichiacoli XGL2/pETPtac-xylBC，由发酵液得到D-木糖酸；

其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；

玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D-木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。

2.根据权利要求1所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于，步骤(一)所述工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC的构建方法是：

(1)采用中拷贝、含强启动活性Tac启动子的pETPtac表达载体外源表达来自月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，构建得到重组质粒pETPtac-xylBC；其中，所述木糖脱氢酶的xylB基因序列长度为747个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述木糖酸内酯酶的xylC基因序列长度为870个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)采用基因工程手段在野生型大肠杆菌W3110中敲除内源性木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF，阻断内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，得到工程大肠杆菌，命名为E.coli X3；其中：所述大肠杆菌内源性木糖异构酶基因xylA核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述木糖酸脱水酶基因yjhG核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述木糖酸脱水酶基因yagF核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(3)采用基因工程手段在E.coli X3菌株中敲除内源性乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB和乙酸激酶基因ackA，阻断乳酸、乙醇的生成途径，削弱乙酸的生产途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XG4；其中，所述内源性乳酸脱氢酶基因ldhA核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述乙醇脱氢酶基因adhE核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；所述丙酮酸氧化酶基因poxB核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述乙酸激酶基因ackA核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

(4)采用基因工程手段在E.coli XG4菌株中敲除内源性磷酸转移酶系统中特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG，消除碳源代谢阻遏，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL1；所述葡萄糖转运蛋白基因ptsG核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(5)采用基因工程手段在E.coli XGL1菌株中敲除内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ，阻断乳糖降解途径，形成的工程大肠杆菌命名为E.coli XGL2；所述内源性β-半乳糖苷酶基因lacZ核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(6)在E.coli XGL2菌株中导入步骤(1)所述重组质粒pETPtac-xylBC，获得在E.coliXGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac-xylBC。

3.根据权利要求1所述所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于，步骤(二)所述利用工程大肠杆菌发酵生产D-木糖酸的条件是：

培养温度为37℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600转/分钟，通气量为1.0vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0，培养时间为40～55小时。

4.根据权利要求1所述所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于：玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例为10:1，D-木糖含量不低于40g/L；乳糖诱导使用浓度为10～100mM。

5.根据权利要求1所述所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于：玉米芯水解液成分为：D-木糖118.5g/L；D-葡萄糖11.5g/L；L-阿拉伯糖11.8g/L；甲酸1.4g/L；乙醇0.83g/L；乙酸0.34g/L。