CN109312373A - 用于共生产乙二醇和三碳化合物的微生物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及可用于一乙二醇(MEG)和一种或多种三碳化合物如丙酮、异丙醇或丙烯的生物合成的重组微生物。在此描述的MEG和一种或多种三碳化合物可用作生产其它化合物的起始材料或用作工业和家庭使用的最终产品。本申请还涉及用于生产MEG和一种或多种三碳化合物的共同表达C2支路和C3支路的重组微生物。还提供了使用重组微生物生产MEG和一种或多种三碳化合物的方法，以及包含重组微生物和/或任选的产物MEG和一种或多种三碳化合物的组合物。

Description

用于共生产乙二醇和三碳化合物的微生物和方法
相关申请的交叉参照
本申请依据35 U.S.C. 119(e)要求2016年3月9日提交的美国临时申请号62/305,814和2016年12月6日提交的美国临时申请号62/430,742的优先权权益，其每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。
以电子方式提交的文本文件的说明
同此以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：BRAS_001_02WO_ST25.txt, 记录日期：2017年3月7日，文件大小约231千字节)。
技术领域
本申请涉及可用于一乙二醇和一种或多种三碳化合物的生物合成的重组微生物。本申请还涉及使用重组微生物生产一乙二醇和一种或多种三碳化合物的方法，以及包含一种或多种这些化合物和/或重组微生物的组合物。
背景
有机化合物如一乙二醇(MEG)、丙酮、异丙醇(IPA)和丙烯作为生产产品如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)树脂(源自MEG)和塑料聚丙烯(源自丙烯)的原料是有价值的。也发现这些化合物可直接用于工业或家庭目的。
然而，目前所述化合物由源自化石燃料的前体生产，这会导致气候变化。为开发用于生产MEG和三碳化合物如异丙醇的更加环境友好的方法，研究人员用生物合成途径对微生物进行了工程改造，以分别生产MEG或IPA。然而，这些途径的实施具有挑战性，其中产品产量的损失、氧化还原平衡和过量生物质形成是要克服的一些主要障碍。
因此，对用于生产MEG和三碳化合物如IPA的改进的生物合成途径，存在需要。
本公开内容简述
本申请涉及具有一个或多个用于生产一乙二醇和一种或多种三碳化合物的生物合成途径的重组微生物。
本公开内容提供一种从木糖生产MEG的易于实施、高产量的C2支路与从DHAP或丙酮酸生产一种或多种三碳化合物的易于实施的C3支路的组合。
本公开的共生产MEG和一种或多种三碳化合物的方法通过利用C3支路生产的过量NADH来满足C2支路的NADH需要而是协同性的。
在一个方面，本申请提供一种共生产一乙二醇(MEG)和一种或多种三碳化合物的重组微生物。在一个实施方案中，MEG和一种或多种三碳化合物是从木糖共同产生的。在另一个实施方案中，所述重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因和/或编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。在一些实施方案中，编码D-木酮糖-5-激酶的基因是xylB。在一些实施方案中，编码乙醇醛脱氢酶的基因是aldA。在一些实施方案中，MEG通过在C2支路中乙醇醛的转化而产生，而一种或多种三碳化合物通过在C3支路中DHAP或丙酮酸的转化而产生。在其它实施方案中，C3支路中产生的过量NADH的至少一部分在C2支路中用作减少等量物的来源。在进一步的实施方案中，C3支路中产生的过量NADH的至少一部分被用来产生ATP。在更进一步的实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和一种或多种三碳化合物。
在一个实施方案中，MEG从木糖经由核酮糖-1-磷酸生产。在另一个实施方案中，MEG从木糖经由木酮糖-1-磷酸生产。在进一步的实施方案中，MEG从木糖经由木糖酸生产。
在一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙酮。在另一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是异丙醇。在进一步的实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙烯。
在一个优选的实施方案中，MEG和丙酮是从木糖共同产生的，即使用将木糖转化为MEG的核酮糖-1-磷酸路径和将二羟基丙酮-磷酸(DHAP)转化为丙酮的C3支路。
在一个方面，本申请涉及一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 编码催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(b) 编码催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(c) 编码催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(d) 编码催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(e) 编码催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(f) 编码催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；和/或
(g) 编码催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶是D-塔格糖3-差向异构酶。在进一步的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是D-塔格糖3-差向异构酶，其由从选自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)和红细菌属(Rhodobacter sp.)的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码D-塔格糖3-差向异构酶的核酸分子从选自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)、假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的微生物获得。在一些实施方案中，编码D-塔格糖3-差向异构酶的核酸分子是dte、C1KKR1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是FJ851309.1或其同系物。在进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由选自SEQ ID NOs: 1、2和4的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶是D-核酮糖激酶。在进一步的实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由得自大肠杆菌(E. coli)的核酸分子编码的D-核酮糖激酶。在一些实施方案中，编码D-核酮糖激酶的核酸分子是fucK，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶由选自SEQ ID NOs: 6和7的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)的酶是D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶。在进一步的实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由得自大肠杆菌的核酸分子编码的D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶。在一些实施方案中，编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是fucA，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由选自SEQ ID NOs: 9和10的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶。在进一步的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶，其由从选自大肠杆菌或酿酒酵母(S. cerevisiae)的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙醇醛还原酶或醛还原酶的核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA (yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ IDNOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其由从选自梭菌属(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、大肠杆菌、酵母属(Saccharomyces sp.)和海杆菌属(Marinobacter sp.)的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和除烃海杆菌(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)的微生物获得。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶。在一些实施方案中，转移酶是乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶，其由从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子从丙酮丁醇梭菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子是从大肠杆菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶亚单元的核酸分子是atoA和atoD，或其同系物。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶亚单元的核酸分子是ctfA和ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶是乙酰乙酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酰乙酸脱羧酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的微生物获得。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 在编码催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；
(b) 在编码催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；和
(c) 在编码催化丙酮酸转化为乳酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶是来自大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和三碳化合物的重组微生物包含在编码D-木酮糖-5-激酶的基因中的缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，而代之以将反应转向D-木酮糖向D-木酮糖-1-磷酸的转化。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶是乙醇醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和三碳化合物的重组微生物包含在编码乙醇醛脱氢酶的基因中的缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，而代之以将反应转向乙醇醛向MEG的转化。
在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，所述酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含在编码乳酸脱氢酶的基因中的缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，而代之以转向产生三碳化合物的反应。
在一个实施方案中，重组微生物还包含催化D-木糖转化为D-木酮糖的内源性酶。
在一个优选的实施方案中，从木糖开始，使用木酮糖-1-磷酸路径将木糖转化为MEG和使用C3支路将二羟基丙酮-磷酸(DHAP)转化为丙酮，共同产生MEG和丙酮。
在另一个方面，本申请涉及能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 编码催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(b) 编码催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(c) 编码催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(d) 编码催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(e) 编码催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；和/或
(f) 编码催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的酶是D-木酮糖1-激酶。在进一步的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从智人(Homo sapiens)获得的核酸分子编码的D-木酮糖1-激酶。在一个实施方案中，智人D-木酮糖1-激酶是己酮糖激酶C。在一些实施方案中，编码人己酮糖激酶C的核酸分子是khk-C，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子包含在SEQ ID NO:55中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)的酶是D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶。在进一步的实施方案中，催化D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从智人获得的核酸分子编码的D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶。在一个实施方案中，智人D-木酮糖1-磷酸醛缩酶是醛缩酶B。在一些实施方案中，编码人醛缩酶B的核酸分子是ALDOB，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 56和57的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶。在进一步的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶，其由从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙醇醛还原酶或醛还原酶的核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA (yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶是核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶。在一些实施方案中，转移酶是乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶，其由从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子从丙酮丁醇梭菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子是从大肠杆菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶亚单元的核酸分子是atoA和atoD，或其同系物。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶亚单元的核酸分子是ctfA和ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶是乙酰乙酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酰乙酸脱羧酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 在编码催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；
(b) 在编码催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；和
(c) 在编码催化丙酮酸转化为乳酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，而代之以将反应转向未将D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶是乙醇醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，而代之以将反应转向将乙醇醛转化为MEG。
在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含在编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，而代之以转向产生三碳化合物的反应。
在一个实施方案中，重组微生物还包含内源性酶，其催化D-木糖转化为D-木酮糖。
在另一个方面，本申请涉及能够从外源性D-木糖和葡萄糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 编码催化D-木糖转化为木糖醇的酶的至少一个外源性核酸分子和编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的酶的至少一个外源性核酸分子；
(b) 编码催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶的至少一个外源性核酸分子，和
其中微生物还表达以下的一种或多种：
(c) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)或(b)的D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(d) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(e) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶或甲基乙二醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为木糖醇的酶是木糖还原酶或醛糖还原酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖转化为木糖醇的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖转化为木糖醇的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是木糖还原酶或醛糖还原酶，其由从选自肉座菌属(Hypocrea sp.)、Scheffersomyces sp.、酵母属、管囊酵母属(Pachysolen sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、脉孢菌属(Neurospora sp.)，和隐球酵母属(Cryptococcus sp.)的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子从选自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)、Scheffersomyces stipitis、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、栎柱毕赤酵母(Pichia quercuum)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、纤细假丝酵母(Candida tenuis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和嗜乳酸隐球酵母(Cryptococcus lactativorus)的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1、GRE3，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 84和87的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 82、83、85和86的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化木糖醇转化为D-木酮糖的酶是木糖醇脱氢酶。在进一步的实施方案中，催化木糖醇转化为D-木酮糖的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化木糖醇转化为D-木酮糖的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是木糖醇脱氢酶，其由从Scheffersomyces sp.、木霉属(Trichodermasp.)、毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter sp.)、产半乳糖假丝酵母属(Galactocandida sp.)、脉孢菌属，和沙雷氏菌属(Serratia sp.)选择的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码木糖醇脱氢酶的核酸分子从选自Scheffersomyces stipitis、里氏木霉(Trichoderma reesei)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、代谢木糖产半乳糖假丝酵母(Galactocandida mastotermitis)、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的微生物获得。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2、xdh1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 88、89和91的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由得自大肠杆菌的核酸分子编码的D-木糖异构酶。在另一个实施方案中，木糖异构酶由从Pyromyces sp.获得的一个或多个核酸分子编码。在一些实施方案中，编码D-木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶是D-塔格糖3-差向异构酶。在进一步的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-核酮糖的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是D-塔格糖3-差向异构酶，其由从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属和红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码D-塔格糖3-差向异构酶的核酸分子从选自菊苣假单胞菌、假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌和类球红细菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码D-塔格糖3-差向异构酶的核酸分子是dte，C1KKR1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是FJ851309.1或其同系物。在进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ IDNOs: 3和5的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由选自SEQ IDNOs: 1、2和4的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶是D-核酮糖激酶。在进一步的实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由得自大肠杆菌的核酸分子编码的D-核酮糖激酶。在一些实施方案中，编码D-核酮糖激酶的核酸分子是fucK，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶由选自SEQ ID NOs: 6和7的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)的酶是D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶。在进一步的实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由得自大肠杆菌的核酸分子编码的D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶。在一些实施方案中，编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是fucA，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由选自SEQ ID NOs: 9和10的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶。在进一步的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶，其由从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙醇醛还原酶或醛还原酶的核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA (yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶。在一些实施方案中，转移酶是乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶，其由一个或多个从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子从丙酮丁醇梭菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子从大肠杆菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶亚单元的核酸分子是atoA和atoD，或其同系物。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶亚单元的核酸分子是ctfA和ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶是乙酰乙酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酰乙酸脱羧酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 在编码催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；和
(b) 在编码催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XKS1基因，或其同系物编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XYL3基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，而代之以将反应转向D-木酮糖向D-木酮糖-1-磷酸的转化。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的酶是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，碱性磷酸酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，碱性磷酸酶由PHO13基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从D-木酮糖-5-磷酸生产D-木酮糖。
在一个实施方案中，能够从外源性D-木糖和葡萄糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物是真菌。
在一个优选的实施方案中，从木糖开始，使用木糖酸(xylonite)路径将木糖转化为MEG和使用C3支路将二羟基丙酮-磷酸(DHAP)转化为丙酮，来共产生MEG和丙酮。
在另一个方面，本申请涉及能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 编码催化D-木糖转化为D-木糖内酯(D-xylonolactone)的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(b) 编码催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(c) 编码催化得自(b)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(d) 编码催化得自(c)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(e) 编码催化得自(d)的乙醇醛转化为MEG的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(f)编码催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶的至少一个外源性核酸分子；
(g) 编码催化得自(f)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；和/或
(h) 编码催化得自(g)的乙酰乙酸转化为丙酮的酶的至少一个外源性核酸分子；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖内酯的酶是木糖脱氢酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖内酯的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖内酯的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是木糖脱氢酶，其由从选自柄杆菌属(Caulobacter sp.)、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码木糖脱氢酶的核酸分子从选自新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、死海盐盒菌(Haloarcula marismortui)、沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh (HVO_B0028), xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木糖内酯转化为D-木糖酸的酶是木糖内酯酶(xylonolactonase)。在进一步的实施方案中，催化D-木糖内酯转化为D-木糖酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖内酯转化为D-木糖酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码的木糖内酯酶。在一些实施方案中，编码木糖内酯酶的核酸分子从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌(Haloferax gibbonsii)的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子由在SEQ IDNO: 66中提出的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶是木糖酸脱水酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是木糖酸脱水酶，其由从选自柄杆菌属、富盐菌属、硫叶菌属(Sulfolobus sp.)和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码木糖酸脱水酶的核酸分子从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌、大肠杆菌和硫磺矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG、yagF、xad，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 69、72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶是2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶。在进一步的实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶，其由从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH、yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ IDNOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶。在进一步的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶，其由从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙醇醛还原酶或醛还原酶的核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA (yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶是核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶。在一些实施方案中，转移酶是乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶，其由一个或多个从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子从丙酮丁醇梭菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子得自大肠杆菌。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶亚单元的核酸分子是atoA和atoD，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶亚单元的核酸分子是ctfA和ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶是乙酰乙酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酰乙酸脱羧酶，其由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs:49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 在编码催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶的基因中的缺失、插入或功能丢失突变；
(b) 在编码催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；和
(c) 在编码催化丙酮酸转化为乳酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含在编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向D-木糖转化为D-木糖酸的反应。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶是乙醇醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，而代之以将反应转向乙醇醛向MEG的转化。
在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，而代之以转向产生三碳化合物的反应。
在另一个方面，本申请涉及能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 编码催化D-木糖转化为D-木糖酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(b) 编码催化得自(a)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(c) 编码催化得自(b)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；
(d) 编码催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG的酶的至少一个外源性核酸分子；
(e) 编码催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶的至少一个外源性核酸分子；
(f) 编码催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶的至少一个内源性或外源性核酸分子；和/或
(g) 编码催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮的酶的至少一个外源性核酸分子；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖酸的酶是木糖脱氢酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木糖酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码的木糖脱氢酶。在一些实施方案中，编码木糖脱氢酶的核酸分子从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh (HVO_B0028)、xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶是木糖酸脱水酶。在进一步的实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从选自柄杆菌属、富盐菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码的木糖酸脱水酶。在一些实施方案中，编码木糖酸脱水酶的核酸分子从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌、大肠杆菌和硫磺矿硫叶菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG、yagF、xad，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 69, 72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶是2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶。在进一步的实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是由从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码的2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶。在一些实施方案中，编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子从选自大肠杆菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH、yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶。在进一步的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙醇醛转化为MEG的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙醇醛还原酶或醛还原酶，其由从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙醇醛还原酶或醛还原酶的核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA (yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶是核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在一个实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶。在一些实施方案中，转移酶是乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶，其由一个或多个从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子从丙酮丁醇梭菌获得。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子得自大肠杆菌。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶亚单元的核酸分子是atoA和atoD，或其同系物。在一些实施方案中，编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶亚单元的核酸分子是ctfA和ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ IDNOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码
在一个实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶是乙酰乙酸脱羧酶。在进一步的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化乙酰乙酸转化为丙酮的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在另一个实施方案中，所述酶是乙酰乙酸脱羧酶，其由从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得。在一些实施方案中，编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 在编码催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶的基因中的缺失、插入或功能丢失突变；
(b) 在编码催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变；和
(c) 在编码催化丙酮酸转化为乳酸的酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。
在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。
在一个实施方案中，催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶是乙醇醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，而代之以将反应转向乙醇醛向MEG的转化。
在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，所述酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，而代之以转向产生三碳化合物的反应。
在任何上述方面和实施方案中，重组微生物还可包含至少一个编码催化丙酮转化为异丙醇的酶的核酸分子。在一个实施方案中，催化丙酮转化为异丙醇的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化丙酮转化为异丙醇的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在一个实施方案中，催化丙酮转化为异丙醇的酶是仲醇脱氢酶(S-ADH)。在另一个实施方案中，所述酶是仲醇脱氢酶，其由从选自伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、梭菌属、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter sp.)、植物单胞菌属(Phytomonas sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)、甲烷杆菌属(Methanobacterium sp.)、产甲烷菌属(Methanogenium sp.)、内阿米巴属(Entamoeba sp.)、毛滴虫属(Trichomonas sp.)，和三毛滴虫属(Tritrichomonas sp.)的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码仲醇脱氢酶的核酸分子从选自伯克霍尔德氏菌AIU 652、真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、拜氏梭菌、Clostridium carboxidivorans、布氏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)、嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)(嗜热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum))、赤红球菌(Rhodococcus rubber)、发光甲烷杆菌(Methanobacterium palustre)、产甲烷古菌泥游产甲烷菌(Methanogenium liminatans)、寄生原生动物溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、寄生原生动物阴道毛滴虫(Tritrichomonas foetus)和人类寄生虫阴道滴虫(Trichomonas vaginalis)的微生物获得。在一些实施方案中，一个或多个编码仲醇脱氢酶的核酸分子是adh、adhB、EhAdh1，或其同系物。在一些实施方案中，S-ADH从同族关系来预测并可以来自油藏嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、阿尔巴拟诺卡菌(Nocardiopsis alba)、幼龄林菌株分枝杆菌(Mycobacterium hassiacum)、猪螺杆菌(Helicobacter suis)、白色念珠菌(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、拟平滑念珠菌(Candida orthopsilosis)、热带假丝酵母(Candida metapsilosis)、Grosmannia clavigera和Scheffersomyces stipitis。在进一步的实施方案中，醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。在又一个实施方案中，醇脱氢酶由选自SEQ ID NOs: 104, 105和107的核酸序列编码。
在任何上述方面和实施方案中，重组微生物还可包含至少一个编码催化异丙醇转化为丙烯的酶的核酸分子。在一个实施方案中，催化异丙醇转化为丙烯的酶由一个或多个内源性核酸分子编码。在一个备选的实施方案中，催化异丙醇转化为丙烯的酶由一个或多个外源性核酸分子编码。在一个实施方案中，催化异丙醇转化为丙烯的酶是脱水酶。
在一个实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而丙酮通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。在另一个实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而IPA通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。在进一步的实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而丙烯通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。
在一个实施方案中，在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分被用作在C-2支路中减少等量物的来源。在另一个实施方案中，在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分被用来生产ATP。
在一个实施方案中，共生产的MEG和丙酮包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。在另一个实施方案中，共生产的MEG和IPA包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。在进一步的实施方案中，共生产的MEG和丙烯包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。
在一个实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙酮。在另一个实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和IPA。在进一步的实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙烯。
在又一个方面，本申请提供使用如上所述的重组微生物生产MEG和三碳化合物的方法，其中该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物，直至产生MEG和三碳化合物。在一些实施方案中，三碳化合物选自丙酮、异丙醇，和丙烯。
在又一个方面，本申请提供一种产生共生产、生产或积聚MEG和三碳化合物的重组微生物的方法。在一些实施方案中，三碳化合物选自丙酮、异丙醇，和丙烯。
在又一个方面，本申请提供一种共生产一乙二醇(MEG)和三碳化合物的重组微生物。在一些实施方案中，三碳化合物选自丙酮、异丙醇，和丙烯。
附图简述
本公开内容的示例性实施方案在附图中说明，其中；
图1说明经由核酮糖-1-磷酸的MEG和异丙醇共生产路径。
图2说明经由木酮糖-1-磷酸的MEG和异丙醇共生产路径。
图3说明经由木糖酸的MEG和异丙醇共生产路径。
图4说明用于MEG的可能的三种碳共产物。
图5说明从木糖和葡萄糖，经由核酮糖-1-磷酸，在酿酒酵母中共生产MEG和异丙醇的路径。
图6说明在酿酒酵母中，从木糖和葡萄糖共生产MEG和异丙醇。
图7说明在大肠杆菌中从木糖生产MEG。
图8说明在大肠杆菌中改进的从木糖生产MEG。
图9说明在实施例3和表2中描述的6种大肠杆菌菌株中，使用核酮糖-1-磷酸路径生产的乙二醇、异丙醇和/或丙酮的总产量(g产物/g木糖)。
图10说明使用实施例4描述的木酮糖-1-磷酸路径，MEG、异丙醇和丙酮在大肠杆菌中的共生产。
图11说明使用如在实施例4中所述的木酮糖-1-磷酸路径生产的乙二醇、异丙醇和丙酮的总产量(g产物/g木糖)。
图12说明使用如在实施例5中所述的木糖酸路径，在大肠杆菌中共生产MEG、异丙醇和丙酮。
图13说明使用如在实施例5中所述的木糖酸路径生产的乙二醇、异丙醇和丙酮的总产量(g产物/g木糖)。
图14显示如在实施例6中所述，测定(a)-(e)的SDS-PAGE的可溶性部分。箭头指示(b)、(c)、(d)和(e)中的LinD表达。
图15说明测定(d)和(e)显示了丙烯和异丙醇在IPA+LinD候选物中的生产。测定(a)显示了pZs*13_IPA的异丙醇生产和少量的丙烯。测定(b)和(c)显示了在补充有3.0g/L异丙醇的培养基中，使用甘油和葡萄糖分别作为碳源的丙烯生产。
序列
SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 120的序列表是本申请的一部分并通过引用并入本文。序列表在本文件的结尾提供。
详细描述
定义
以下定义和缩写被用来解释本公开内容。
如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式"一”、"一个”和"该"包括复数指代，除非文中另外清楚地指明。因此，例如，提及"三碳化合物"包括多个这样的三碳化合物，提及"微生物"包括提及一个或多个微生物，等等。
如本文所用的，术语“包含”、“含有”、“包括”、“包纳”、“具有”、“有”、“含”、“涵盖”或其任何其它变化，意欲涵盖非排他性内含物。包含要素列表的组合物、混合物、过程、方法、物品，或仪器不一定只限于这些要素，但可包括未明确列出的或此种组合物、混合物、过程、方法、物品，或仪器所固有的其它要素。此外，除非有相反的明确说明，“或”指包容性的“或”，而非排他性的“或”。
本文所用的修饰数值的术语“约”、“大约”指明围绕描述值的封闭范围。如果“X”是值，“约X”或“大约X”将表示从0.9X至1.1X的值，或在一些实施方案中，表示从0.95X至1.05X的值。任何对“约X”或“大约X”的提及都明确地表示至少为值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“大约X”旨在讲述和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面说明支持。
如本文所用的，术语“微生物的”、“微生物(microbial organism)”和“微生物(microorganism)”包括任何作为微观细胞存在的生物，其包括在古菌、细菌或真核生物的范围内，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或较高级的原生质(higher Protista)。因此，该术语意欲涵盖原核细胞或真核细胞或具有微观尺寸的生物，并包括所有物种的细菌、古菌和真细菌以及真核微生物如酵母和真菌。还包括可以培养用于生产化学物质的任何物种的细胞培养。
如在此描述的，在一些实施方案中，重组微生物是原核微生物。在一些实施方案中，原核微生物是细菌。"细菌"或"真细菌"指原核生物的领域。细菌包括如下至少11个不同的组：(1) 革兰氏阳性(革兰氏+)菌，其中有两个主要分支：(1) 高G+C组(放线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)、其它) (2) 低G+C组(芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、支原体(Mycoplasmas))；(2) 变形杆菌例如紫色光合+非-光合革兰氏阴性菌(包括大多数"普通"革兰氏阴性菌)；(3) 蓝细菌例如需氧光养生物(oxygenic phototrophs)；(4) 螺旋体和相关物种；(5) 浮霉菌属(Planctomyces)；(6) 拟杆菌属、黄杆菌门(Flavobacteria)；(7) 衣原体；(8) 绿硫细菌(Green sulfurbacteria)；(9) 无硫绿细菌(也即厌氧光合营养菌(anaerobic phototrophs))；(10) 耐辐射微球菌及近缘种群；(11) 栖热袍菌属(Thermotoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)嗜热生物。
"革兰氏阴性菌"包括球菌、非肠道杆菌，和肠道杆菌。革兰氏阴性菌属包括，例如，奈瑟氏球菌属(Neisseria)、螺菌属(Spirillum)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、鲍特菌属(Bordetella)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属、醋菌属(Acetobacter)、产气杆菌属(Aerobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、螺旋状菌属(Spirilla)、沙雷菌属(Serratia)、弧菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、衣原体、克次氏体(Rickettsia)、螺旋体(Treponema)、和梭杆菌属(Fusobacterium)。
"革兰氏阳性菌"包括球菌、非孢子杆菌，和孢子杆菌。革兰氏阳性菌属包括，例如，放线菌属(Actinomyces)、芽孢杆菌、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、乳酸杆菌属、李斯特菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、粘球菌属(Myxococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)，和链霉菌属(Streptomyces)。
术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"在此可交换使用并指已经以整体构建被基因改造来表达或过度表达内源性酶，表达异源酶，如包含在载体中的那些酶，或具有内源性基因的表达变化的微生物。所谓"变化"是指基因的表达，或编码一个或多个多肽或多肽亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平，或一个或多个多肽或多肽亚单元的活性被上调或下调，以致表达、水平，或活性大于或少于在变化的不存在下观察到的。例如，术语"改变"可以指"抑制"，但"改变"一词的使用不限于这一定义。要理解术语"重组微生物"和"重组宿主细胞"不仅指特定的重组微生物，而且指这样一种微生物的后代或潜在后代。因为某些修饰由于或者变异或者环境的影响而可能发生在后代，事实上，这样的后代可能与母细胞不完全相同，但仍包括在如本文所用的该术语的范围内。
涉及基因序列的术语"表达"指基因的转录且在需要时将生成的mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，从上下文可以清楚地看出，蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译产生的。宿主细胞中所需产物的表达水平可以根据存在于细胞中的对应的mRNA的量，或由选定的序列编码所需产物的量来确定。例如，从选定的序列转录的mRNA可通过qRT-PCR或通过RNA杂交(Northern hybridization)定量(见Sambrook et al., 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989))。由选定的序列编码的蛋白可通过各种方法例如通过ELISA，通过测定蛋白的生物活性，或通过使用独立于这样的活性之外的测定，如蛋白质印迹法(westernblotting)或放射免疫测定，使用识别和结合蛋白的抗体来定量。见Sambrook et al.,1989, supra。
术语“多核苷酸”在此可与术语“核酸”互换使用并指包含两种或更多种单体包括核苷酸、核苷或其类似物的有机聚合物，包括但不限于任何长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，适宜时，任何长度的单链或双链、有义或反义核糖核酸(RNA)，包括siRNA。术语“核苷酸”指由核糖或脱氧核糖与嘌呤或嘧啶碱基和磷酸基团结合，和为核酸的基本结构单位组成的几种化合物中的任何一种。术语“核苷”指由嘌呤或嘧啶碱基结合脱氧核糖或核糖组成且尤其存在于核酸中的化合物(如鸟苷或腺苷)。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指其中一个或更多的单个原子已经被不同的原子或被不同的官能团替代的核苷酸或核苷。因此，术语多核苷酸包括任何长度的核酸、DNA、RNA、类似物及其片段。3个或更多个核苷酸的多核苷酸也被称为核苷酸低聚物或寡核苷酸。
要理解在此描述的多核苷酸包括"基因"和在此描述的包括"载体"或"质粒"的核酸分子。因此，术语"基因"，也称为"结构基因"，指编码氨基酸的特定序列的多核苷酸，其包含一个或多个蛋白或酶的全部或部分，并可包括调控的(非-转录的) DNA序列，如启动子序列，其确定例如基因表达的条件。基因的转录区可包括未翻译区，包括内含子、5'-未翻译区(UTR)，和3'-UTR，以及编码序列。
如本文所用的术语"酶"指催化或促进一个或多个化学或生物化学反应的任何物质，其通常包括由全部或部分多肽或多个多肽组成的酶，但可包括由不同的分子包括多核苷酸组成的酶。
如本文所用的，术语“非-天然存在的”当用于指本公开内容的微生物或酶活性时，意欲指微生物或酶具有至少一个通常在参考物种(包括参考物种的野生型菌株)的自然存在的菌株中没有发现的遗传改变。遗传改变包括，例如，对引入可表达的核酸编码代谢多肽的修饰，其它核酸添加、核酸缺失和/或对微生物遗传物质的其它功能破坏。这样的修饰包括，例如，对于参考物种的异源、同源，或异源和同源的多肽编码区及其功能片段。另外的修饰包括，例如，非-编码调控区，其中修饰改变基因或操纵子的表达。示例性非-天然存在的微生物或酶活性包括上述的羟基化活性。
如本文所用的涉及各种分子例如多核苷酸、多肽、酶等的术语“外源性”，指在给定酵母、细菌、生物、微生物，或自然界中的细胞中通常或天然不存在的和/或给定酵母、细菌、生物、微生物，或自然界中的细胞不能产生的分子。
在其它方面，如本文所用的关于各种分子例如多核苷酸、多肽、酶等的术语“内源性”或“天生的”，指在给定酵母、细菌、生物、微生物，或自然界中的细胞中通常或天然存在的和/或由给定酵母、细菌、生物、微生物，或自然界中的细胞产生的分子。
如本文所用的术语“异源的”在关于修饰的宿主细胞的上下文中指各种分子例如多核苷酸, 多肽, 酶等等，其中以下的至少一项是真实的：(a) 所述分子对宿主细胞来说是外来的(“外源性”) (即，不是天然存在的)；(b) 所述分子在给定的宿主微生物或宿主细胞中是天然存在的(如，对宿主微生物或宿主细胞是“内源性的”)，但或者是在非自然位置，或者是在细胞中以非自然量产生的；和/或(c) 所述分子在核苷酸或氨基酸序列方面不同于内源性核苷酸或氨基酸序列，以致在核苷酸或氨基酸序列方面不同于内生发现的内源性核苷酸或氨基酸的分子在细胞中以非自然(如，大于天然存在的)量产生。
如本文所用的关于第一个家族或第一个物种的原始酶或基因的术语“同系物”，指第二个家族或第二个物种的不同酶或基因，其经功能、结构，或基因组分析确定为对应于第一个家族或第一个物种的原始酶或基因的第二个家族或第二个物种的酶或基因。同系物最常见具有功能、结构，或基因组相似性。酶或基因的同系物可使用基因探針和PCR容易地克隆的技术是已知的。作为同系物克隆的序列的识别可以使用功能分析和/或通过基因的基因组映射来确认。
如果通过基因编码的氨基酸序列具有与第二基因相似的氨基酸序列，则该蛋白与第二蛋白具有“同族关系”或为“同源的”。或者，如果两种蛋白具有“相似的”氨基酸序列，则一种蛋白与第二蛋白具有同族关系。因此，术语“同源蛋白”意指两种蛋白具有相似的氨基酸序列。在某些情况下，两种蛋白之间的同源性是其与进化相关的共同祖先的指示。术语"同源序列"或"同系物"被认为，相信，或已知与功能相关。功能关系可以用多种方法中的任何一种来表示，包括，但不限于：(a) 序列同一性的程度和/或(b) 相同或相似的生物功能。优选地，(a)和(b)二者均指示。序列同一性的程度可以变化，但在一个实施方案中，为至少50% (当使用本领域已知的标准序列比对程序时)、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%，或至少98.5%，或至少约99%，或至少99.5%，或至少99.8%，或至少99.9%。同源性可使用本领域容易获得的软件程序，如在分子生物学的最新方案(Current Protocols in Molecular Biology) (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)补充版30, 章节7.718, 表7.71中讨论的那些确定。一些比对程序是MacVector (OxfordMolecular Ltd, Oxford, U.K.)和ALIGN Plus (Scientific and EducationalSoftware, Pennsylvania)。其它非限制性比对程序包括Sequencher (Gene Codes, AnnArbor, Michigan)、AlignX，和Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA)。相似的生物功能可包括，但不限于：催化相同或相似的酶反应；对底物或辅因子具有相同或相似的选择性；具有相同或相似的稳定性；对各种发酵条件(温度、pH等)具有相同或相似的耐受性；和/或对各种代谢底物、产物、副产物、中间体等具有相同或相似的耐受性。生物功能的相似性程度可以变化，但在一个实施方案中，为至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%，或至少98.5%，或至少约99%，或至少99.5%，或至少99.8%，或至少99.9%，根据本领域技术人员已知的一个或多个分析来确定给定的生物功能。
术语"变体"指在此描述的任何多肽或酶。变体也涵盖多聚体的一个或多个成分，包含单一成分的多聚体，包含多个单一成分的多聚体(如，参考分子的多聚体)，化学分解产品，和生物分解产品。在特定的非限制性实施方案中，由于在编码参考芳樟醇脱水酶/异构酶的多肽序列的任何部分中的变化，芳樟醇脱水酶/异构酶可以是相对于参考芳樟醇脱水酶/异构酶的“变体”。参考芳樟醇脱水酶/异构酶的变体在用来测量参考芳樟醇脱水酶/异构酶制剂的酶活性的标准测定中可具有至少10%、至少30%、至少50%、至少80%、至少90%、至少100%、至少105%、至少110%、至少120%、至少130%或更多的酶活性。在一些实施方案中，变体也可指多肽具有与本公开内容的全长，或未处理的芳樟醇脱水酶/异构酶至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%的序列同一性。在一些实施方案中，一个变体也可指具有与本公开内容的成熟的，或处理过的芳樟醇脱水酶/异构酶至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列同一性的多肽。
如本文所用的术语"信号序列"指使肽和多肽靶向细胞位置或细胞外环境的氨基酸序列。信号序列通常是在多肽的N-末端部分并且经酶法除去。具有它们的信号序列的多肽被称为全长和/或未处理的。已使它们的信号序列除去的多肽被称为成熟的和/或经处理的。
本文所用的术语"产量潜力"指得自生物合成路径的产物的产率。在一个实施方案中，产量潜力可表示为每单位重量起始化合物的最终产物的重量百分比。
本文所用的术语"热力学最大产量"指基于产品与原料相比的能量值，从给定的原料(如葡萄糖)的发酵获得的产品最大产量。在正常的发酵中，不使用额外的能源如光、氢气或甲烷或电，例如，产品不能比原料含有更多的能量。热力学最大产量意味着从原料转化为产品的所有能量和质量的产品产量。这种产量可以计算且独立于特定的路径。如果一条通向产品的特定的路径具有比热力学最大产量更低的产量，则它会失去质量，且很有可能被改进或代之以更有效的通向产品的路径。
术语"氧化还原反应平衡"指一组反应，其共同产生与他们消耗的一样多的氧化还原协同因子。设计代谢途径和改造生物工程以使氧化还原协同因子平衡或接近平衡通常导致所需化合物生产的更有效、更高的产率。氧化还原反应总是作为同时发生的两个半反应(half-reactions)出现，一个是氧化反应，而另一个是还原反应。在氧化还原过程中，还原剂将电子转移到氧化剂上。因此，在该反应中，还原剂(reductant)或还原剂(reducingagent)失去电子并被氧化，而氧化剂(oxidant)或氧化剂(oxidizing agent)获得电子并被还原。在一个实施方案中，氧化还原反应参与生物系统。生物能量经常通过氧化还原反应储存和释放。光合作用包括将二氧化碳还原为糖类并将水氧化成分子氧。逆反应、呼吸、氧化糖类生成二氧化碳和水。作为中间步骤，还原碳化合物被用于还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，这从而促成了质子梯度的产生，这推动了三磷酸腺苷(ATP)的合成并通过氧气的减少来维持。术语氧化还原状态常被用来描述生物系统如细胞或器官中GSH/GSSG、NAD+/NADH和NADP+/NADPH的平衡。氧化还原状态反映在几组代谢物(如，乳酸和丙酮酸，β-羟基丁酸，和乙酰乙酸)的平衡中，它们的相互转换取决于这些比率。异常的氧化还原状态可以在各种有害的情况下发展，如缺氧、休克和败血症。
本文所用的术语“C2路径”、“C2支路”或“C2流”指其中MEG可经由乙醇醛产生的生物化学路径。
本文所用的术语“C3路径”、“C3支路”或“C3流”指其中MEG或一种或多种三碳化合物可经由丙酮酸或二羟基丙酮磷酸(DHAP)产生的生物化学路径。
引言
本公开内容合并不同的宿主中一乙二醇(MEG)和一种或多种三碳化合物的产生。在一些实施方案中，三碳化合物是异丙醇(IPA)。本公开内容从而避免了对到目前为止显示的已知MEG和IPA途径的一些最大的路径工程挑战。意外地，MEG产生的路径和三碳化合物产生的路径的组合相互补充且是高度协同的，避免或克服了每个途径单独使用时的最大挑战和缺点，建立了良好的氧化还原平衡，但也传递需要的ATP，而不产生过量的ATP。
一种已证实的从木糖(WO2013126721A1，其以其整体参考并入本文)，经由核酮糖-1-磷酸发酵生产MEG的方法具有高产量潜力(82 wt% = 0.82 g MEG/g木糖)。MEG经由两种平行作用的不同的途径产生，2-碳(C2)流(经由乙醇醛)和3-碳(C3)流(经由二羟基丙酮磷酸(DHAP))。C2流易于高效率的实施，但C3流通过代谢工程高效率地实施是非常困难的。存在几个DHAP → MEG的路径选项，所有这些都难以实施。此外，整个过程是ATP中性的。因此，一些葡萄糖以及由此而来的产量将会损失，以获得细胞生长和维持所需的一些剩余ATP。
一种进一步证实的从木糖(Alkim et al., Microb Cell Fact (2015) 14:127)，经由木酮糖-1-磷酸发酵生产MEG的途径与WO2013126721A1描述的途径非常相似。它具有同样高的产量潜力(82 wt%)，但经由DHAP产生MEG的C3流难以实施并且有ATP短缺。
一种从葡萄糖进一步发酵生产的MEG被证实(Chen et al., Met. Eng. (2016)33:12–18)。它只使用与WO2013126721A1的C3流解决方案之一相同的路径，经由DHAP进行，然后乙醇胺至甘油醛至MEG。只有在这种情况下，DHAP是从葡萄糖，而不是从木糖衍生的。因此，实施例从DHAP至MEG的高效率和高产率路径将遭受甚至更大的技术难度。此外，它具有降低的69 wt%的总产量潜力(对比从葡萄糖衍生的产物MEG的热力学最大产量) (82 wt%)。此外，路径是ATP中性的，不生成细胞需要生长和维持的任何ATP。这种路径也不是氧化还原反应平衡的且具有高过量的2 mol NADH每mol消耗的葡萄糖，所有这些都需要重新氧化才能使细胞存活。在有氧发酵中，这种NADH可用来生成ATP，然而它将是高过量的(2 NADH →6 ATP)，在生产阶段期间导致过量的生物质形成，因而减少产物形成和产量。对从葡萄糖生产MEG的产量潜力损失的唯一描述的解决方案是以高产量潜力从木糖生产MEG。对在从葡萄糖生产MEG过程中过量NADH产生唯一描述的解决方案是从木糖生产MEG，其可以是氧化还原中性的。
一种证实的经由乙酰乙酰-CoA发酵生产IPA的途径(US 2010/0311135，其以其整体参考并入本文)具有过量NADH (2 mol每mol消耗的葡萄糖)和低产量潜力(34 wt%)。这种路径具有过量的ATP (2 mol每mol消耗的葡萄糖)，超过在生产期间为细胞维持所需的，从而有利于生产过程中的生物质形成。如果NADH不通过碳固定利用，那么需要重新氧化才能使细胞存活，在该过程中葡萄糖进一步损失。或者, NADH可通过ATP产生被氧化，这将导致甚至更多的不需要的过量ATP。
存在减少NADH过量和增加IPA产量潜力的其它可能的解决方案(热力学最大产率= 47 wt%)：再捕获在发酵过程中过量产生的CO2，而在这样做的同时，还会对过量的NADH(CO2固定)进行再氧化。或通过将来自糖酵解的一些流量转移到磷酸酮酶(PK)/磷酸转乙酰酶(PTA)路径以生成更多的乙酰-CoA和更少的CO2和NADH，避免过量CO2和NADH总体释放。然而，到目前为止，在IPA生产方面，这些选项都没有得到技术上的证明且通常已知是非常有挑战性的。
本公开内容将用于从木糖生产MEG的3种易于实施的、高产量C2-流之一与易于经由DHAP路径实施的IPA生产流结合。令人惊讶的是，IPA路径的问题，过量的NADH产生，补充MEG产生的C2部分需要的NADH。这些途径的组合导致61 wt%的高总产量潜力，其接近将木糖降解为MEG和IPA的最大能量产率65 wt%，假设这些产品是以2:1的比例生产的。这种高产量潜力来自于IPA路径与从木糖生产MEG的C2-支路联合的协同作用。
基本形式的拟议路径不是氧化还原中性的，但具有小过量的0.5 mol NADH每mol消耗的木糖。在有氧发酵中，NADH的氧化可递送刚刚足够的ATP，以获得足够的，但不过量的、在生产期间为生长和维持所需的ATP，对产品形成没有明显的负面影响。
本公开内容解决了与MEG和/或IPA产生有关的许多问题。在一个实施方案中，解决了从木糖生产MEG中难以实施C3路径的问题。在另一个实施方案中，解决了从木糖生产MEG中ATP短缺的问题。在另一个实施方案中，解决了在从葡萄糖生产MEG中产量潜力损失的问题。在另一个实施方案中，解决了在从葡萄糖生产MEG中ATP短缺的问题。在另一个实施方案中，解决了从葡萄糖生产MEG中的过量NADH生产的问题。在另一个实施方案中，解决了从葡萄糖生产IPA中产量潜力损失的问题。在另一个实施方案中，解决了从葡萄糖生产IPA中的过量NADH生产的问题。
在一个实施方案中，用于在大肠杆菌中的MEG + IPA共生产的路径包括用于IPA产生的以下酶：硫解酶、乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶、乙酰乙酸脱羧酶和仲醇脱氢酶。经由核酮糖-1-磷酸的MEG路径包括以下酶：D-塔格糖3-差向异构酶、D-核酮糖激酶、D-核酮糖-磷酸醛缩酶和乙醇醛还原酶。为了增加对所需路径的碳流量，确定并删除了三种可以转移碳通量的特定基因：编码木酮糖激酶(xylulokinase) (这种酶可将碳流量引入磷酸戊糖路径)的xylB基因，编码醛脱氢酶A (可将碳流量从乙醇醛转移至乙醇酸而不是转移至MEG)的aldA基因和编码乳酸脱氢酶(这种酶可将碳流量从丙酮酸转移至乳酸而不是转移至乙酰-CoA)的ldhA基因。
所述路径的第一个步骤(图1)是D-木糖自然转化为D-木酮糖。D-木酮糖通常进入关于能量和生物质生成的磷酸戊糖路径，其受xylB基因的缺失的抑制。在工程设计路径中，所有的碳通过D-塔格糖3-差向异构酶被转移至D-核酮糖。然后D-核酮糖通过天然大肠杆菌酶D-核酮糖激酶被转化为D-核酮糖-1-磷酸。D-核酮糖-1-磷酸通过D-核酮糖-磷酸醛缩酶被分解为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)。DHAP的进一步的降解被称为C3支路，导致IPA产生。乙醇醛的降解(称为C2-支路)可导致乙二醇或乙醇酸形成。乙醇酸是可通过aldA基因产物产生的不需要的副产物。乙二醇可使用酶乙醇醛还原酶从乙醇醛生产。DHAP转化为乙酰-CoA (通过甘油醛-3-磷酸和丙酮酸)是天然大肠杆菌代谢的一部分。乙酰-CoA的一个分子通过酶硫解酶与乙酰-CoA的另一个分子缩合产生乙酰乙酰-CoA。CoA从乙酰乙酰-CoA通过乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶再循环到乙酸分子，生成乙酰-CoA和乙酰乙酸。乙酰乙酸经乙酰乙酸脱羧酶被脱羧为丙酮，其通过仲醇脱氢酶被进一步还原为IPA。IPA可通过脱水酶被进一步转化为丙烯(图4)。
在另一个实施方案中，用于在大肠杆菌中的MEG + IPA共生产的路径包括用于IPA产生的以下酶：硫解酶、乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶、乙酰乙酸脱羧酶和仲醇脱氢酶。经由D-木酮糖-1-磷酸的MEG路径包括以下酶：D-木酮糖1-激酶、D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶和乙醇醛还原酶。为了增加对所需路径的碳流量，确定并删除了三种可以转移碳通量的特定基因：编码木酮糖激酶(这种酶可将碳流量引入磷酸戊糖路径)的xylB基因，编码醛脱氢酶A (可将碳流量从乙醇醛转移至乙醇酸而不是转移至MEG)的aldA基因和编码乳酸脱氢酶(这种酶可将碳流量从丙酮酸转移至乳酸而不是转移至乙酰-CoA)的ldhA基因。
所述路径的第一个步骤(图2)是D-木糖自然转化为D-木酮糖。D-木酮糖通常进入关于能量和生物质生成的磷酸戊糖路径，其受xylB基因的缺失的抑制。在工程设计路径中，所有的碳通过D-木酮糖1-激酶被转移至D-木酮糖-1-磷酸。然后D-木酮糖-1-磷酸通过D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶被分解为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)。从乙醇醛生产MEG和从DHAP生产三碳化合物(例如，丙酮、IPA和/或丙烯)如对图1所述进行。
在另一个实施方案中，用于在大肠杆菌中的MEG + IPA共生产的路径包括用于IPA产生的以下酶：硫解酶、乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶、乙酰乙酸脱羧酶和仲醇脱氢酶。经由D-木糖酸的MEG路径包括以下酶：木糖脱氢酶，任选的木糖内酯酶、木糖酸脱水酶、2-酮-3-脱氧-D-木糖酸醛缩酶和乙醇醛还原酶。为了增加对所需路径的碳流量，确定并删除了三种可以转移碳通量的特定基因：编码D-木糖异构酶(这种酶可将碳流量从D-木糖转移至D-木酮糖而不是转移至D-木糖酸或D-木糖内酯)的xylA基因，编码醛脱氢酶A (可将碳流量从乙醇醛转移至乙醇酸而不是转移至MEG)的aldA基因和编码乳酸脱氢酶(这种酶可将碳流量从丙酮酸转移至乳酸而不是转移至乙酰-CoA)的ldhA基因。
所述路径的第一个步骤(图3)是或者通过一个两-步骤过程，使用木糖脱氢酶将D-木糖转化为D-木糖内酯，接着用木糖内酯酶将D-木糖内酯转化为D-木糖酸，或者通过一-步骤过程，使用木糖脱氢酶将D-木糖直接转化为D-木糖酸，而将D-木糖转化为D-木糖酸。D-木糖转化为D-木酮糖受xylA基因的缺失的抑制。然后通过木糖酸脱水酶将D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸。然后2-酮-3-脱氧-木糖酸用2-酮-3-脱氧-D-木糖酸醛缩酶分解为乙醇醛和丙酮酸。从乙醇醛生产MEG和从丙酮酸生产三碳化合物(例如，丙酮、IPA和/或丙烯)如对图1所述进行。
用于在酿酒酵母中的MEG + IPA共生产的路径(图5)包括用于IPA产生的以下酶：硫解酶、乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶、乙酰乙酸脱羧酶和仲醇脱氢酶。经由D-核酮糖-1-磷酸的MEG路径包括以下酶：D-塔格糖3-差向异构酶、D-核酮糖激酶、D-核酮糖-磷酸醛缩酶和乙醇醛还原酶。除了两种主要的途径，酿酒酵母不能够消耗木糖，所以测试了木糖消耗的两种不同的途径。路径1包括2个基因：Xyl1将D-木糖转化为木糖醇，和Xyl2将D-木糖醇转化为D-木酮糖。路径2仅包括一个基因：直接将D-木糖转化为 D-木酮糖的XylA。为了增加对所需路径的碳流量，确定并删除了可转移碳流量的两个特定基因：编码木酮糖激酶(这种酶可将碳流量引入磷酸戊糖路径)的XKS1基因和编码碱性磷酸酶(可从磷酸戊糖路径转移碳)的PHO13基因。
所述路径的第一个步骤是直接或经由中间体木糖醇将D-木糖转化为D-木酮糖。D-木酮糖通过D-塔格糖3-差向异构酶转化为D-核酮糖。然后D-核酮糖用D-核酮糖激酶转化为D-核酮糖-1-磷酸。D-核酮糖-1-磷酸通过D-核酮糖-磷酸醛缩酶被分解为乙醇醛和DHAP。DHAP进入用于IPA产生的C3支路，乙醇醛可使用乙醇醛还原酶转化为乙二醇。DHAP转化为乙酰-CoA (通过甘油醛-3-磷酸和丙酮酸)是天然酿酒酵母代谢的一部分。乙酰-CoA的一个分子通过硫解酶与乙酰-CoA的另一个分子缩合产生乙酰乙酰-CoA。CoA从乙酰乙酰-CoA通过乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶再循环到乙酸的分子，生成一个分子的乙酰-CoA和一个分子的乙酰乙酸。乙酰乙酸通过乙酰乙酸脱羧酶进一步脱羧为丙酮，其通过仲醇脱氢酶被进一步转化为IPA。IPA可通过脱水酶-异构酶被进一步转化为丙烯(图4)。
意外地，IPA路径的主要问题，过量NADH产生，与通过补充C2支路的NADH需要的MEG生产的C2-流是高度协同的，同时留下刚刚足够的NADH以在有氧过程中生成需要的ATP，而没有过量的ATP产生。
US 2010/0311135和其它申请描述的IPA过程，没有碳固定，可仅获得34 wt% (对比能量最大产量潜力47 wt%)。因此，这种IPA路径，即使完美地执行，仅仅可获得72%的能量最大产量。在本公开内容中，IPA与MEG联合生产的协同是这样的，即不需要CO2固定，61 wt%的合并的产品产量潜力是非常接近(94%)能量(= 理论的，路径独立的)最大产量潜力65wt%。
在进一步的实施方案中，本发明的从木糖开始的共生产路径在具有使用过量还原剂来固定CO2的天然或额外能力的生物体中实施，从而提供甚至更高的产量潜力。各种CO2固定途径是已知的并且已在大肠杆菌中或其它宿主中实施。产乙酸菌，如扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，可天然利用在所提出的木糖发酵途径中生成的过量NADH，特别有效地再捕获在生产中间体乙酰-CoA的Wood-Ljungdahl路径中释放的CO2，其然后可被用来生产更多的丙酮或相关的产物。例如在丙酮酸+CoA +NAD+ →乙酰-CoA +CO2 +2 NADH或乙酰丙酮 →丙酮 +CO2反应中释放CO2。此外，加入第二原料，如氢气(H2)或合成气(H2、CO、CO2的组合物)或甲醇，可提供更多的还原剂，甚至允许产乙酸菌(acetogens)或有类似功能的生物重新捕获在木糖发酵路径中释放的所有CO2或第二原料中存在的CO2。因此，这样一种兼养发酵可进一步增加产量潜力。在从木糖生产MEG +丙酮的情况下，CO2固定可导致25%相对丙酮或8%总MEG+丙酮产品产率的增加。使用外部添加的还原剂，计算所有木糖碳的全捕获量，对于丙酮，产率潜力是+100%，其等于+32%的总产品产率。
无CO2固定的产量潜力：
1木糖→ 1 MEG + 1/2丙酮 +3/2 CO2 +1 NADH
1木糖→ 1 MEG + 1/2 IPA +3/2 CO2 +1/2 NADH
有CO2固定的产量潜力：
1木糖→ 1 MEG + 5/8丙酮 +9/8 CO2
1木糖→ 1 MEG + 10/18 IPA + 4/3 CO2
使用外部添加的还原剂的产量潜力，计算相当于在木糖发酵期间释放的所有CO2的固定CO2。
1木糖→ 1 MEG + 1丙酮
1木糖→ 1 MEG + 1 IPA
虽然本公开内容在理论上是合理和协同的，它也意外地避免了MEG和IPA两种发酵过程的最大的代谢工程和技术挑战：C3-流 MEG 发酵和IPA过程的碳固定。
在一个实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而丙酮通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。在另一个实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而IPA通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。在进一步的实施方案中，MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而丙烯通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。
在一个实施方案中，在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分用作在C-2支路中减少等量物的来源。在另一个实施方案中，在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分被用来生产ATP。
在一个实施方案中，共生产的MEG和丙酮包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。在另一个实施方案中，共生产的MEG和IPA包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。在进一步的实施方案中，共生产的MEG和丙烯包含大于90%的理论最大产量潜力(没有碳固定)的产量潜力。
在一个实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙酮。在另一个实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和IPA。在进一步的实施方案中，尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙烯。
一乙二醇(MEG)
一乙二醇(MEG)是工业应用的一种重要的原料。MEG的主要用途是生产聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)树脂、薄膜和纤维。此外，MEG在生产防冻剂、冷却剂、飞机防冻剂、干燥剂和溶剂中是重要的。MEG也称为乙烷-1,2-二醇。
乙二醇也用作例如，汽车和液体冷却计算机中的对流传热介质。
由于乙二醇的高沸点和对水的亲和性，其是有用的干燥剂。乙二醇被广泛用来在将天然气从偏远的气田输送到天然气加工设施的长多相管道中抑制天然气包合物(水合物)的形成。乙二醇可从天然气回收并在去除水分和无机盐的净化处理后用作抑制剂。
乙二醇的次要用途包括在制造电容器中，作为生产1,4-二氧六环的化学中间体，和作为添加剂，以防止个人电脑的液体冷却系统的腐蚀。乙二醇也用于生产一些疫苗；作为鞋油、油墨和染料的次要成分；作为木材的腐烂和真菌处理剂；以及作为生物标本的防腐剂。
丙酮
丙酮(Acetone) (也称为丙酮(propanone))是具有式(CH3)2CO的有机化合物。它是无色、易挥发、易燃的液体并且是最简单的酮。
丙酮可与水混溶并用作重要的溶剂，一般用于实验室的清洁目的。全世界生产超过6.700,000吨，主要用作溶剂和生产甲基丙烯酸甲酯和双酚A。它是有机化学中常见的基石。丙酮的常见家庭用途是作为指甲油去除剂中的有效成分和作为油漆稀释剂。
异丙醇
异丙醇(IUPAC命名2-丙醇)，也称为异丙醇，是具有化学式C3H8O或C3H7OH或CH3CHOHCH3的化合物。它是有强烈的气味的无色、易燃化学化合物。它是仲醇的最简单的实例，其中醇碳原子连接于两个其它碳原子，有时显示为 (CH3)2CHOH。它是丙醇的结构异构体。它具有广泛的工业和家庭用途。
丙烯，也称为丙烯或甲基乙烯，是具有化学式C3H6的不饱和有机化合物。它具有一个双键，是烯烃类的第二个最简单的成员。
丙烯是由化石燃料-石油、天然气，以及在更小的程度上，由煤产生的。丙烯是炼油和天然气加工的副产物。
丙烯是在石化工业中仅次于乙烯的排第二位的最重要的原料产物。它是广泛种类的产品的原料。塑料聚丙烯的制造商占全部需求的近三分之二。聚丙烯是例如用于生产薄膜、包装材料、盖帽和封口以及其它应用所需要的。丙烯也被用于生产重要的化学品如环氧丙烷、丙烯腈、枯烯、丁醛和丙烯酸。在世界范围内加工了超过85,000,000吨的丙烯。
酶
本文公开的可用于MEG和三碳化合物共生产途径的示例性酶列于表1中。
表1
D-塔格糖3-差向异构酶(EC 5.1.3.31)
本公开内容描述可催化各种酮在C-3位的差向异构作用的酶，互转换D-果糖和D-阿洛酮糖(psicose)、D-塔格糖和D-山梨糖、D-核酮糖和D-木酮糖，和L-核酮糖和L-木酮糖。特异性取决于物种。来自菊苣假单胞菌和类球红细菌的酶需要Mn2+。在一个实施方案中，酶是D-塔格糖3-差向异构酶(dte)。在另一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖。
在一些实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶是来自假单胞菌亚种(Pseudomonasspp.)。在另一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶来自菊苣假单胞菌。在另一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶来自假单胞菌ST-24。在另一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶来自百脉根中生根瘤菌。在另一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶来自类球红细菌(C1KKR1)。
在一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属和红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自菊苣假单胞菌、假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌和类球红细菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是dte和/或FJ851309.1，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由选自SEQ ID NOs: 1、2和4的核酸序列编码。
D-塔格糖3-差向异构酶也可称为L-核酮糖3-差向异构酶或酮糖3-差向异构酶。
D-核酮糖激酶(EC 2.7.1.16)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
L-岩藻酮糖+ ATP → L-岩藻酮糖1-磷酸+ ADP + H+
D-核酮糖+ ATP → D-核酮糖1-磷酸+ ADP + H+
D-核酮糖激酶也可称为L-岩藻酮糖激酶(fuculokinase)、岩藻酮糖激酶、ATP: L-岩藻酮糖1-磷酸转移酶或L-岩藻酮糖激酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在岩藻糖(fucose)降解路径、岩藻糖和鼠李糖降解的超级路径和/或D-阿拉伯糖降解I路径中起作用的酶。
在一些实施方案中，所述酶既可作为L-岩藻糖激酶又可作为D-核酮糖激酶，分别为L-岩藻糖和D-阿拉伯糖降解途径的第二个酶发挥功能。
在特定的实施方案中，所述酶将D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸。在一些实施方案中，D-核酮糖激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-核酮糖激酶由fucK基因编码。在一个实施方案中，D-核酮糖激酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是fucK，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶由选自SEQ ID NOs: 6和7的核酸序列编码。
D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.17)
本公开内容描述可催化以下可逆反应的酶：
L-岩藻酮糖1-磷酸=(S)-乳醛+二羟基丙酮磷酸(DHAP)
D-核酮糖1-磷酸=乙醇醛+二羟基丙酮磷酸(DHAP)
D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶也可称为L-岩藻酮糖-磷酸醛缩酶、L-岩藻酮糖1-磷酸醛缩酶或L-岩藻酮糖-1-磷酸(S)-乳醛-裂解酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在岩藻糖降解路径、岩藻糖和鼠李糖降解的超级路径和/或D-阿拉伯糖降解I路径中起作用的酶。在一个实施方案中，酶可使用Zn2+作为辅因子。在另一个实施方案中，这种酶的抑制剂可以是磷甘醇羟氨酸酯(phosphoglycolohydroxamate)。
在一些实施方案中，所述酶既可作为L-岩藻酮糖-磷酸醛缩酶又可作为D-核酮糖-磷酸醛缩酶，分别为L-岩藻糖和D-阿拉伯糖降解途径第三个酶发挥功能。
酶的底物特异性已用得自大肠杆菌菌株的部分纯化制剂进行测试。
酶的晶体结构和点突变的数量已经得到解析。突变的结构数据和酶促活性的组合允许酶的催化机制建模和改进。已对酶的对映体选择性进行了研究。
在特定的实施方案中，酶将D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP。在一些实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由fucA基因编码。在一个实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是 fucA，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由选自SEQ ID NOs: 9和10的核酸序列编码。
乙醇醛还原酶(EC 1.1.1.77)
本公开内容描述可催化以下可逆反应的酶：
乙二醇+ NAD+ = 乙醇醛+ NADH + H+
(S)-丙烷-1,2-二醇+ NAD+ = (S)-乳醛+ NADH + H+
乙醇醛还原酶也可称为乳醛还原酶、丙二醇氧化还原酶、(R) [或(S)]-丙烷-1,2-二醇:NAD+氧化还原酶或L-1,2-丙二醇氧化还原酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在乙二醇降解路径，二醇代谢的超级路径和降解，厌氧L-乳醛降解路径和/或岩藻糖和鼠李糖降解的超级路径中起作用的酶。在一个实施方案中，所述酶可使用Fe2+作为辅因子。
L-1,2-丙二醇氧化还原酶是铁-依赖性III族脱氢酶。它厌氧性地将L-乳醛(一种L-岩藻糖和L-鼠李糖二者的分解代谢途径的产物)还原为L-1,2-丙二醇，其随后从细胞提取。
酶的晶体结构已得到解析，显示了一个域-交换的二聚体，其中金属、辅因子和底物结合位点可被定位。天冬氨酸和三个保守的组氨酸残基是Fe2+结合和酶促活性需要的。
在体外，所述酶可被高浓度的NAD+激活且被Fe3+和抗坏血酸盐或Fe2+和H2O2的混合物有效地灭活。保守的His277残基的金属-催化的氧化可能是失活的原因。
FucO的表达能产生工程改造的β-氧化循环的一次逆转。FucO活性有助于工程改造菌株中的异丁醛转化为异丁醇。
在特定的实施方案中，所述酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，乙醇醛还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛还原酶由fucO基因编码。在一个实施方案中，乙醇醛还原酶由一个或多个从选自大肠杆菌和酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子选自gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB (dkgB)，和/或yqhE (dkgA)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs: 12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
醛还原酶
许多醛还原酶可被用来将乙醇醛转化为MEG。
NADPH-依赖的醛还原酶(YqhD)可催化以下反应：
丙酮醇+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH + H+ (可逆, EC 1.1.1.-)
醇+ NADP+ = 醛+ NADPH + H+ (未指明可逆性, EC 1.1.1.2)
醛+ NADP+ + H2O → 羧酸+ NADPH + 2 H+ (EC 1.2.1.4)
1,3-丙二醇+ NADP+ = 3-羟基丙醛+ NADPH + H+ (未指明可逆性, EC 1.1.1.-)
D-3,4-二羟基丁醛+ NADPH = 1,3,4-丁三醇+ NADP+ (未指明可逆性)
YqhD是可参与乙二醛解毒和/或为对脂质过氧化的谷胱甘肽-非依赖性反应的一部分的NADPH-依赖的醛还原酶。
一直有报道各种醇、醛、氨基酸、糖和α-羟基酸已被作为YqhD的底物进行了测试。纯化的蛋白仅显示NADP-依赖的醇脱氢酶活性，伴有偏好长于C(3)的醇，但Km值在毫摩尔范围内，提示它们不是生理学底物。相比之下，YqhD不显示出对底物如丙醛、乙醛和丁二醛，以及丙烯醛和丙二醛的短链醛还原酶活性。在代谢工程菌株中，苯乙醛和4-羟基苯乙醛被内源性醛还原酶YqhD、YjgB和YahK还原为2-苯乙醇和2-(4-羟基苯基)乙醇。
YqhD的过度表达增加细胞的1,3-丙二醇氧化还原酶活性。大肠杆菌已被工程改造为表达用于1,3-丙二醇工业生产的YqhD。YqhD活性也有助于异丁醇、1,2-丙二醇、1,2,4-丁三醇和丙酮醇的生产。yqhD的突变通过β-氧化循环的一次逆转工程，使丁醇的生产成为可能。
YqhD具有糠醛还原酶活性，其似乎由于代谢工程菌株中NADPH的消耗而引起生长抑制，所述菌株从木质纤维素生物质生产醇。
YqhD的结晶结构以2 Å的分辨率得到解析。YqhD是二聚体中一种不对称的二聚体，且活性位点含有Zn2+离子。NADPH辅因子被烟酰胺环中5和6位的羟基修饰。
yqhD的过度表达导致提高对活性氧生成化合物如过氧化氢、百草枯(paraquat)、铬酸盐和亚硝酸钾的抗性。yqhD缺失突变体显示出对这些化合物和对乙二醛的增加的敏感性，并含有在脂质过氧化期间生成的活性醛水平的增加。相反地，yqhD缺失导致糠醛耐受性增加。
在特定的实施方案中，NADPH-依赖的醛还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，NADPH-依赖的醛还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，NADPH-依赖的醛还原酶由yqhD基因编码。
多-功能甲基乙二醛还原酶(DkgA)可催化以下反应：
丙酮醇+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH + H+ (反应在生理上以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.-)。
异丁醇+ NADP+ = 异丁醛+ NADPH + H+ (未指明可逆性, EC 1.1.1.-)
乙基-(2R)-甲基-(3S)-羟基丁酸酯 + NADP+ = 乙基-2-甲基乙酰乙酸+ NADPH + H+(未指明可逆性, EC 1.1.1.-)
2-酮基-L-古洛糖酸+ NADP+ ← 2,5-双脱氢-D-葡萄糖酸+ NADPH + H+ (反应以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.346)
DkgA (YqhE)属于醛-酮还原酶(AKR)家族并已显示具有甲基乙二醛还原酶和β-酮酯还原酶活性。
已报道dkgA编码2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(25DKGR) A，在大肠杆菌中的两种25DKG还原酶之一。该酶使用NADPH作为优选的电子供体并被认为参与酮基葡萄糖酸代谢。该酶对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的特异性活性据报道为其对甲基乙二醛的活性的几乎1/1000。
由于其对NADPH的低Km，由DkgA还原呋喃可耗尽NADPH库，从而限制细胞生物合成。醛还原酶的广泛调查显示DkgA是几种有助于降解代谢工程中理想的醛末端产物的内源性醛还原酶中的一种。
DkgA的结晶结构已以2.16 Å的分辨率得到解析。
在特定的实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶由dkgA基因编码。
多功能甲基乙二醛还原酶(DkgB)可催化以下反应：
丙酮醇+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH + H+ (反应在生理上以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.-)
4-硝基苄醇+ NADP+ = 4-硝基苯甲醛+ NADPH + H+ (未指明可逆性, EC 1.1.1.91)
2-酮基-L-古洛糖酸+ NADP+ ← 2,5-双脱氢-D-葡萄糖酸+ NADPH + H+ (反应以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.346)
DkgB (YafB)是醛-酮还原酶(AKR)亚家族3F的成员。已显示DkgB具有2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶、甲基乙二醛还原酶和4-硝基苯甲醛还原酶活性。
有报道dkgB编码2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶(25DKGR) B，在大肠杆菌中的两种25DKG还原酶之一。该酶使用NADPH作为优选的电子供体并被认为参与酮基葡萄糖酸代谢。然而，酶对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的特异性活性据报道为其对甲基乙二醛的活性的几乎1/1000。
在特定的实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，多功能甲基乙二醛还原酶由dkgB基因编码。
甲基乙二醛还原酶(YeaE)可催化以下反应：
丙酮醇+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH + H+ (反应在生理上以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.-)
YeaE已显示具有甲基乙二醛还原酶活性。
YeaE的亚单元结构尚未确定，但其氨基酸序列与醛-酮还原酶DkgA (YqhE)和DkgB(YafB)的相似性提示它可能是单体的。
在特定的实施方案中，甲基乙二醛还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，甲基乙二醛还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，甲基乙二醛还原酶由yeaE基因编码。
L-甘油醛3-磷酸还原酶(yghZ)可催化以下反应：
L-甘油醛3-磷酸+ NADPH + H+ → sn-甘油3-磷酸+ NADP+ (EC 1.1.1.-)
丙酮醇+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH + H+ (反应在生理上以相反方向进行是有利的，EC 1.1.1.-)
YghZ是L-甘油醛3-磷酸(L-GAP)还原酶。该酶也能以较低的速度解毒甲基乙二醛。YghZ定义AKR14 (醛-酮还原酶14)蛋白家族。
L-GAP不是一种天然的代谢产物并且对大肠杆菌有毒。L-GAP是大肠杆菌K-12的甘油-3-磷酸和己糖磷酸转运系统二者的底物。据推测，YghZ的生理作用是解毒L-GAP，后者可通过GAP的非-酶促外消旋作用或通过未知的细胞过程形成。
大肠杆菌酶的结晶结构已得到确定且被认为是一种四聚体。然而，根据凝胶过滤和电子显微镜研究，其它已发现蛋白形成八聚体。
在特定的实施方案中，L-甘油醛3-磷酸还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，L-甘油醛3-磷酸还原酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，L-甘油醛3-磷酸还原酶由yghZ基因编码。
L-1,2-丙二醇脱氢酶/甘油脱氢酶(GldA)可催化以下反应：
(S)-丙烷-1,2-二醇+ NAD+ = 丙酮醇+ NADH + H+ (可逆反应)
氨基丙酮+ NADH + H+ → (R)-1-氨基丙-2-醇+ NAD+ (EC 1.1.1.75)
甘油+ NAD+ = 二羟基丙酮+ NADH + H+ (可逆反应, EC 1.1.1.6)
GldA酶的生理功能长期不甚清楚。该酶被独立地分离为甘油脱氢酶和D-1-氨基-2-丙醇:NAD+氧化还原酶。那时，D-1-氨基-2-丙醇被认为是维生素B12的生物合成的中间体，虽然大肠杆菌不能重新合成维生素B12，但在寻找催化这种化合物的合成的酶。后来发现GldA负责这两种活性。
最近提出GldA在体内的主要作用是将二羟丙酮转化为甘油来去除。然而，甘油发酵过程中的双重作用最近也被证实。在大肠杆菌中的甘油异化可通过两种不同的途径实现。甘油和甘油磷酸二酯降解路径需要终端电子受体的存在并利用Glp系统的ATP-依赖的激酶，其使甘油磷酸化为甘油-3-磷酸。然而，在激酶灭活并选择在甘油上生长后，发现NAD+-连接的脱氢酶，GldA，能够支持甘油发酵。最近，已显示GldA参与甘油发酵，二者作为甘油脱氢酶，产生二羟基丙酮，和作为1,2-丙二醇脱氢酶，通过从丙酮醇生产1,2-丙二醇来再生成NAD+。
所述酶以两种催化活性形式存在， 8个亚单元的大形式和2个亚单元的小形式。大形式似乎是主要的种类。
在特定的实施方案中，L-1,2-丙二醇脱氢酶/甘油脱氢酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，L-1,2-丙二醇脱氢酶/甘油脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，L-1,2-丙二醇脱氢酶/甘油脱氢酶由gldA基因编码。
来自酿酒酵母的NADPH-依赖的甲基乙二醛还原酶(GRE2)可催化以下反应：
(S)-乳醛+ NADP+ = 甲基乙二醛+ NADPH
3-甲基丁醇 + NAD(P)+ = 3-甲基丁醛+ NAD(P)H
Gre2是一种使用NADPH作为辅因子。催化广泛范围的底物的立体选择性还原的多功能酶，所述底物包括脂族和芳族酮、二酮，以及醛。
来自酿酒酵母的呈载脂蛋白形式(apo-form)的Gre2晶体结构以2.00Å分辨率和NADPH-复合形式以2.40Å分辨率已经得到解析。Gre2形成同型二聚体，其各个亚单元含有N-末端Rossmann-折叠域和可变的C-末端域，其参与底物识别。与辅因子NADPH结合的诱导拟合使两个域相互对向移动，产生更适合底物的域间裂缝。与位点-定向突变结合的计算模拟和酶促活性分析能够对潜在的底物-结合袋进行特征描述，所述底物-结合袋确定用于催化的严格的底物立体选择性。
Gre2催化细胞毒性化合物甲基乙二醛(MG)不可逆地还原为(S)-乳醛，作为通过乙二醛酶I Glo1对MG解毒的替代方法。MG由磷酸二羟丙酮通过糖酵解旁路合成并被认为在细胞周期调节和压力适应中起作用。GRE2还催化将异戊醛还原为异戊醇。该酶通过调节异戊醛的水平，起着抑制异戊醇-诱导的丝状化作用，细胞对丝状化的信号作出反应。GRE2也参与麦角固醇代谢。
在特定的实施方案中，NADPH-依赖的甲基乙二醛还原酶将乙醇醛转化为MEG。在一些实施方案中，NADPH-依赖的甲基乙二醛还原酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，NADPH-依赖的甲基乙二醛还原酶由GRE2基因编码。
硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶(EC 2.3.1.9)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
2乙酰-CoA =乙酰乙酰-CoA + 辅酶A (可逆反应)
硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶也可称为乙酰-CoA-C-乙酰转移酶、乙酰乙酰-CoA硫解酶、乙酰-CoA:乙酰-CoA C-乙酰转移酶或硫解酶II。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在乙酰乙酸降解中起作用的酶(为乙酰CoA)。在一个实施方案中，这种酶的抑制剂可以是乙酰乙酰-CoA。
在特定的实施方案中，所述酶将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自梭菌亚种(Clostridium spp)。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自丙酮丁醇梭菌。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自热解糖梭菌。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自蜡样芽胞杆菌。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自除烃海杆菌ATCC 49840。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶由thlA基因编码。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，硫解酶/乙酰辅酶A乙酰基转移酶由atoB基因编码。
在一个实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶(EC 2.8.3.-)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
乙酰乙酸+乙酰-CoA =乙酰乙酰-CoA +乙酸(可逆反应, EC 2.8.3.-)
乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶也可称为乙酰乙酰-CoA转移酶或乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在乙酰乙酸降解中起作用的酶(为乙酰CoA)。在一个实施方案中，这种酶的抑制剂可包括乙酰-CoA和辅酶A。
短链脂肪酸(C3-C6)上的大肠杆菌的生长需要激活酸成为它们各自的硫酯。这种激活由乙酰乙酰-CoA转移酶催化。反应以涉及共价酶-CoA的两个半-反应发生。酶在反应过程中经历两次可检测到的构象变化。据认为，反应可能是由乒乓球机制(ping-pongmechanism)进行的。酶可利用各种短链酰基-CoA和羧酸底物，但显示具有正常和3-酮基底物的最大活性。
在特定的实施方案中，所述酶将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶来自梭菌亚种。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶来自丙酮丁醇梭菌。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶由atoA和atoD基因编码。在另一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA转移酶的亚单元组合物是[(AtoA)2][(AtoD)2]，其中(AtoA)2是β复合物和(AtoD)2是α复合物。在一个实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶是稠合的乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶: α 亚单元/β 亚单元。在另一个实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶由ydiF基因编码。
乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶(EC 3.1.2.11)
本公开内容描述可催化以下反应的酶:
乙酰乙酰-CoA + H2O = CoA +乙酰乙酸
乙酰乙酰-CoA水解酶也可称为乙酰乙酰辅酶A水解酶、乙酰乙酰CoA脱酰基酶或乙酰乙酰辅酶A脱酰基酶。
这种酶属于水解酶家族，尤其是作用于硫酯键的那些。
在特定的实施方案中，所述酶将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶来自梭菌亚种。在一些实施方案中，乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶来自丙酮丁醇梭菌。在另一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA水解酶由ctfA (亚单元A)和/或ctfB (亚单元B)基因编码。
在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
乙酰乙酸脱羧酶(EC 4.1.1.4)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
乙酰乙酸+ H+ →丙酮+ CO2
乙酰乙酸脱羧酶也可称为ADC、AADC或乙酰乙酸羧基-裂解酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在异丙醇生物合成、丙酮酸发酵为丙酮，丙酮丁醇梭菌引起酸化的和溶剂产生的发酵的超级路径和/或丙酮丁醇梭菌溶剂产生的发酵的超级路径中起作用的酶。
乙酰乙酸脱羧酶(ADC)在丙酮丁醇梭菌的溶剂生产中起关键作用。在引起酸化的生长阶段，酸积聚导致代谢转移到溶剂生产。在这一阶段，酸被重新吸收和代谢，生成丙酮、丁醇和乙醇。
酶的初步纯化和结晶表明，赖氨酸残基与活性位点有关。所述酶是一个由单一类型亚单元的12个拷贝组成的大型复合物。
丙酮丁醇梭菌ATCC 824的酶已被纯化且编码它的adc基因被克隆。该酶也已从相关的菌株丙酮丁醇梭菌DSM 792被纯化且基因被克隆和测序。脱羧反应通过形成希夫碱(Schiff base)中间体进行。
ADC是酸吸收中的关键酶，有效的拉动在乙酰乙酸形成方向上的CoA-转移酶反应。
在特定的实施方案中，所述酶将乙酰乙酸转化为丙酮。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自梭菌亚种。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自丙酮丁醇梭菌。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自拜氏梭菌。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自解纤维梭菌。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自多粘芽孢杆菌。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自青紫色素杆菌。在一些实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶来自恶臭假单胞菌。在另一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由adc基因编码。
在一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属(Pseudomonas sp)的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
醇脱氢酶(EC 1.1.1.-)
本公开内容描述可催化伯醇或仲醇可逆地分别氧化为醛或酮的酶。在一个实施方案中，所述酶是仲醇脱氢酶(S-ADH)并催化酮如丙酮还原为仲醇如2-丙醇(异丙醇)。
在一些实施方案中，S-ADH是来自伯克霍尔德氏菌属。在一些实施方案中，S-ADH是来自伯克霍尔德氏菌AIU 652。在一些实施方案中，S-ADH是来自产碱杆菌属。在一些实施方案中，S-ADH是来自真养产碱杆菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自梭菌属。在一些实施方案中，S-ADH是来自拉氏梭菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自拜氏梭菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自嗜热厌氧杆菌属。在一些实施方案中，S-ADH是来自布氏嗜热厌氧杆菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自嗜热厌氧乙醇杆菌(嗜热硫化氢梭菌)。在一些实施方案中，S-ADH由adhB基因编码。在一些实施方案中，S-ADH是来自锥虫植体吸虫(trypanosomatid Phytomonas sp)。在一些实施方案中，S-ADH是来自红球菌属。在一些实施方案中，S-ADH是来自赤红球菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自发光甲烷杆菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自产甲烷古菌泥游产甲烷菌。在一些实施方案中，S-ADH是来自寄生原生动物溶组织内阿米巴(EhAdh1)。在一些实施方案中，S-ADH是来自寄生原生动物阴道毛滴虫。在一些实施方案中，S-ADH是来自人类寄生虫阴道滴虫.
在一些实施方案中，S-ADH从同族关系预测并可来自油藏嗜热厌氧杆菌、藤黄微球菌、阿尔巴拟诺卡菌、幼龄林菌株分枝杆菌、猪螺杆菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母、拟平滑念珠菌、热带假丝酵母、Grosmannia clavigera和Scheffersomyces stipitis。
在进一步的实施方案中，醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。在又一个实施方案中，醇脱氢酶由选自SEQ ID NOs: 104, 105和107的核酸序列编码。
脱水酶(EC 4.2.1.-)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
异丙醇=丙烯 + H20
D-木酮糖1-激酶(EC 2.7.1.-)
本公开内容描述可催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的酶。在一些实施方案中，转化可由人己酮糖激酶C (khk-C)，也称为果糖激酶催化。
己酮糖激酶，或果糖激酶，将果糖磷酸化果糖-1-磷酸。该酶参与果糖代谢，这是碳水化合物代谢的一部分。它存在于肝、肠和肾皮质中。
在人肝中，纯化的果糖激酶，当与醛缩酶偶合时，已被发现有助于一种从木糖醇生产草酸的替代机制。在偶联序列中，果糖激酶和醛缩酶产生乙醇醛，一种从D-木酮糖经由D-木酮糖1-磷酸至草酸的前体。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸。在一些实施方案中，D-木酮糖1-激酶是己酮糖激酶C。在一些实施方案中，己酮糖激酶C来自智人。在一些实施方案中，人己酮糖激酶C由khk-C基因编码。
在一个实施方案中，D-木酮糖1-激酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子是己酮糖激酶C (khk-C)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子包含在SEQID NO: 55中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列编码。
D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.-)
本公开内容描述可催化D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP的酶。在一些实施方案中，转化可由人醛缩酶B催化，该酶也称为果糖-双磷酸醛缩酶B或肝-型醛缩酶。
醛缩酶B是I类果糖1,6-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)的3个同功酶(A、B和C)之一，并在糖酵解和糖异生过程中起关键作用。一般的果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化可逆地将果糖1,6-二磷酸(FBP)分解为甘油醛3-磷酸和二羟基丙酮磷酸(DHAP)以及可逆地将果糖1-磷酸(F1P)分解为甘油醛和二羟基丙酮磷酸。在哺乳动物中，醛缩酶B优先在肝中表达，而醛缩酶A在肌肉和红细胞中表达，醛缩酶C在脑中表达。同工酶结构中的微小差异导致对于两种底物分子的不同的活性：FBP和果糖1-磷酸。醛缩酶B未表现出偏好，因此催化了两种反应，而醛缩酶A和C更偏好FBP。
醛缩酶B是一种由四个亚基组成的同四聚体酶。每个亚单元具有36 kDa的分子量并含有8-股α/β桶状物(barrel)，其包住赖氨酸229 (形成对催化关键的氨基酸的席夫碱)。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和DHAP。在一些实施方案中，D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶是醛缩酶B。在一些实施方案中，醛缩酶B是来自智人。在一些实施方案中，人醛缩酶B由ALDOB基因编码。
在一个实施方案中，D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是醛缩酶B (ALDOB)，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 56和57的核酸序列编码。
D-木糖异构酶(EC 5.3.1.5)
本公开内容描述可催化以下可逆反应的酶：
D-吡喃木糖= D-木酮糖
D-木糖异构酶也可称为木糖异构酶或D-木糖酮醇-异构酶。
因此，在一些实施方案中，本公开内容提供在木糖降解中起作用的酶。
木糖异构酶催化D-木糖的代谢中的第一反应。
两个保守的组氨酸残基，H101和H271，显示出是对催化活性至关重要的。两种保守的色氨酸残基(W49和W188)的荧光在木糖结合期间被猝灭，而W49显示出是对催化活性重要的。Mg2+、Mn2+或Co2+的存在防止酶避免受热变性的影响。
亚单元组合物尚未在实验中得到证实。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木糖转化为D-木酮糖。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。
在一个实施方案中，重组微生物包含内源性或外源性木糖异构酶，其催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
D-木酮糖-5-激酶/木酮糖激酶
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
D-木酮糖+ ATP → D-木酮糖5-磷酸+ ADP + H+ (EC 2.7.1.17)
ATP + 1-脱氧-D-木酮糖→ 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸+ ADP + H+ (EC 2.7.1.-)
D-木酮糖-5-激酶也可称为木酮糖激酶(xylulose kinase)或木酮糖激酶(xylulokinase)。
木酮糖激酶催化在木糖降解路径中第二步骤的D-木酮糖的磷酸化，产生D-木酮糖-5-磷酸，一种磷酸戊糖路径的中间体。
在底物的不存在下，木酮糖激酶具有弱的ATPase活性。木酮糖激酶也可催化1-脱氧-D-木酮糖的磷酸化。这将允许一个生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸的潜在的回收途径，用于类萜、硫胺和吡哆醛的生物合成。1-脱氧-D-木酮糖的磷酸化速率是D-木酮糖的磷酸化速率的1/32。
已研究细菌酶的动力机制，提出一种占优势的有序的反应机制。所述酶在底物和ATP结合时经受显著的构象变化。两种保守的天冬氨酸残基，D6和D233，被发现对催化活性是重要的，并提出了催化机制。
载脂蛋白形式和结合于D-木酮糖的细菌木酮糖激酶的晶体结构已分别以2.7和2.1 Å的分辨率确定。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XKS1基因编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XYL3基因编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，而代之以将反应转向D-木酮糖向D-木酮糖-1-磷酸的转化。
木糖脱氢酶(EC 1.1.1.175或EC 1.1.1.179)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
醛基-D-木糖+ NAD+ + H2O → D-木糖酸+ NADH + 2 H+
α-D-吡喃木糖+ NAD+ = D-木糖内酯+ NADH + H+ (未指明可逆性, EC 1.1.1.175)
木糖脱氢酶也可称为D-木糖脱氢酶、D-木糖1-脱氢酶、(NAD+)-连接的D-木糖脱氢酶、NAD+-D-木糖脱氢酶、D-木糖:NAD+ 1-氧化还原酶。
D-木糖脱氢酶催化NAD+-依赖的D-木糖氧化为D-木糖内酯。这是氧化、非磷酸化途径中的第一反应，用于D-木糖在新月柄杆菌中的降解。这种路径类似于巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的L-阿拉伯糖降解路径。新月柄杆菌(C. crescentus)酶的氨基酸序列与来自古生菌(archaeon)死海盐盒菌的木糖脱氢酶，或巴西固氮螺菌的L-阿拉伯糖1-脱氢酶的氨基酸序列无关。
D-木糖是用于来自新月柄杆菌的重组D-木糖脱氢酶的优选底物。该酶可使用L-阿拉伯糖，但它是一种较差的底物。关于L-阿拉伯糖的Km是166 mM。其它底物如D-阿拉伯糖、L-木糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-葡萄糖-6-磷酸在测定中显示出很少或没有活性，如通过NADH产生所测量的。新月柄杆菌D-木糖脱氢酶可将D-木糖直接转化为D-木糖酸。
来自新月柄杆菌的部分地、天生的D-木糖脱氢酶具有对D-木糖的70 μM的Km。这个值低于对于重组、His-标记的酶的760 μM的Km。
在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶来自嗜盐古细菌沃氏富盐菌。沃氏富盐菌D-木糖脱氢酶催化嗜盐古细菌沃氏富盐菌的氧化木糖降解路径的第一反应。沃氏富盐菌(H. volcanii) D-木糖脱氢酶显示出与从死海盐盒菌功能鉴定的木糖脱氢酶的59%氨基酸序列同一性和与Halorubrum lacusprofundi的直向同源的56%同一性，但与来自新月柄杆菌CB15的细菌NAD+-依赖性木糖脱氢酶仅有11%的同一性。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木糖转化为D-木糖内酯。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶来自新月柄杆菌。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶由xylB基因编码。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶来自沃氏富盐菌。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶来自死海盐盒菌。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶来自Halorubrum lacusprofundi。在一些实施方案中，D-木糖脱氢酶由xdh基因编码。
在一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh1(HVO_B0028)和/或xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
木糖内酯酶(3.1.1.68)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
D-木糖-1,4-内酯+ H2O = D-木糖酸
这种酶属于水解酶家族，尤其是作用于羧酸酯键的那些。这种酶参与戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换。
木糖内酯酶也可称为D-木糖内酯酶、木糖-1,4-内酯酶, 木糖-γ-内酯酶或D-木糖-1,4-内酯内酯水解酶(lactone lactonohydrolase)。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木糖内酯转化为D-木糖酸。在一些实施方案中，D-木糖内酯酶来自富盐菌属。在一些实施方案中，D-木糖内酯酶来自沃氏富盐菌。在一些实施方案中，D-木糖内酯酶来自吉氏富盐菌。在一些实施方案中，D-木糖内酯酶来自新月柄杆菌。在一些实施方案中，D-木糖内酯酶由xylC基因编码。
在一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子由在SEQ ID NO: 66中提出的核酸序列编码。
木糖酸脱水酶(EC 4.2.1.82)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
D-木糖酸 = 2-酮-3-脱氧-D-木糖酸+ H2O
这种酶属于裂解酶家族，特别是水解酶，其裂解碳-氧键。这种酶参与戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换。
木糖酸脱水酶也可称为D-木糖酸水解酶、D-木糖-醛糖酸脱水酶或D-木糖酸脱水酶。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-D-木糖酸。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶来自新月柄杆菌。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶由xylD基因编码。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶由yjhG基因编码。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶由yagF基因编码。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶来自沃氏富盐菌。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶由xad基因编码。在一些实施方案中，木糖酸脱水酶来自硫磺矿硫叶菌。
在一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、硫磺矿硫叶菌和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG和/或yagF，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs:69、72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶(4.1.2.28)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸=乙醇醛+丙酮酸(未指明可逆性)
这种酶属于裂解酶家族，特别是醛-裂解酶，其裂解碳-碳键。这种酶参与戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换。
2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶也可称为2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸乙醇醛-裂解酶(丙酮酸-形成), 2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶、3-脱氧-D-pentulosonic acid醛缩酶，和2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸乙醇醛-裂解酶。
YjhH似乎是2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶。遗传证据表明YagE也可用作2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶。yagE是前噬菌体(prophage) CP4-6的部分。
yjhH yagE双突变体不能使用D-木糖酸作为碳的唯一来源，粗细胞提取物 不包含2-脱氢-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶活性。两个表型都通过在质粒上提供yjhH来补充。
ArcA在厌缺氧生活下似乎激活yjhH基因表达。两种假定的ArcA结合位点被确定在这种基因的211和597 bp上游，但其启动子上游尚未得到确认。
YagE的结晶结构提示蛋白是同四聚体。在丙酮酸和2-酮-3-脱氧半乳糖酸的存在下，YagE的Co-晶体结构已经得到解析。
在特定的实施方案中，酶将2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸。在一些实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶来自假单胞菌属。在一些实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由yjhH基因编码。在一些实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由yagE基因编码。
在一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和/或yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
乙醇醛脱氢酶(1.2.1.21)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
乙醇醛+ NAD+ + H2O = 乙醇酸+ NADH + 2 H+
这种酶属于氧化还原酶家族，特别是作用于具有NAD+或NADP+作为受体的供体的醛或氧代基团的那些。这种酶参与乙醛酸和双羧酸代谢。
乙醇醛脱氢酶也可称为乙醇醛:NAD+氧化还原酶或乙二醇醛脱氢酶。
在大肠杆菌中，醛脱氢酶A (AldA)是一种对小α-羟醛底物具有较广泛底物特异性的酶。因此它被用于多种代谢途径。
L-岩藻糖和L-鼠李糖通过平行途径代谢，其在相应的醛缩酶反应产生相同的产物后聚集：二羟基-丙酮磷酸和L-乳醛。以有氧的方式，醛脱氢酶A将L-乳醛氧化为L-乳酸。
在利用相同酶的平行途径中，D-阿拉伯糖和L-木糖可被代谢为二羟基-丙酮磷酸和乙醇醛，其通过醛脱氢酶A被氧化为乙醇酸。
单独酶和三元和二元配合物的晶体结构已经得到解析。
醛脱氢酶A只有在有氧条件下才存在且最易被岩藻糖、鼠李糖或谷氨酸的存在所诱导。酶被NADH抑制，其可通过丙二醇氧化还原酶，用作一个开关，使乳醛氧化转变为其还原形式。AldA在短期适应葡萄糖限制的过程中上调。
基于序列相似性，AldA被预测为琥珀酸-半醛脱氢酶。
已调查aldA表达的调节。所述基因受分解代谢物抑制，在厌氧条件下经由ArcA的抑制，和碳源的诱导作用的调节。
在特定的实施方案中，所述酶将乙醇醛转化为乙醇酸。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，而代之以将反应转向乙醇醛向MEG的转化。
乳酸脱氢酶(1.1.1.28)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
(R)-乳酸+ NAD+ ←丙酮酸+ NADH + H+
乳酸脱氢酶(LDH)是在几乎所有的活细胞例如动物、植物和原核生物中发现的酶，LDH催化乳酸转化为丙酮酸并返回，如同它将NADH转化为NAD+并返回。脱氢酶是将氢化物从一个分子转移到另一个分子的酶。
LDH以4类不同的酶存在。最常见的一个是NAD(P)-依赖的L-乳酸脱氢酶。其它LDHs作用于D-乳酸和/或依赖于细胞色素c：D-乳酸脱氢酶(细胞色素)和L-乳酸脱氢酶(细胞色素)。
LDH具有重要的医学意义，因为它广泛存在于人体组织，如血细胞和心脏肌肉中。因为它在组织损伤期间释放，它是常见损伤和疾病如心脏衰竭的标志。
乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase)也可称为乳酸脱氢酶(lactic aciddehydrogenase)、(R)-乳酸:NAD+氧化还原酶或D-乳酸脱氢酶—促发酵的。
在大肠杆菌中、乳酸脱氢酶(LdhA)是可溶性NAD-连接的乳酸脱氢酶(LDH)，其特别用于生产D-乳酸。LdhA是同四聚体并在pH值较高的条件下显示正同向协作性。
大肠杆菌含有两种其它乳酸脱氢酶： D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶。二者均为乳酸上需氧生长所需的膜-相关的黄素蛋白。
LdhA在有氧条件下存在，但当大肠杆菌在厌氧条件、酸性pH下，在各种糖上生长时，就会被诱导。与大多数与厌氧呼吸有关的基因不同，ldhA不被Fnr激活；相反，ArcAB系统和几个与控制碳水化合物代谢有关的基因(csrAB和mlc)似乎调节表达。ldhA的表达受到转录调节因子ArcA的负面影响。ldhA属于σ32调节子。
ldhA基因是代谢工程中常见的突变靶点，最常见的是消除不良发酵副产物的产生，但还特别地生产D-乳酸。
在特定的实施方案中，所述酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，而代之以转向产生三碳化合物的反应。
木糖还原酶或醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
α-D-木糖+ NADPH + H+ = 木糖醇+ NADP
糖醛(alditol) + NAD(P)+ = NAD(P)H +醛糖
醛糖还原酶也可称为糖醛:NAD(P)+ 1-氧化还原酶，多羟基化合物脱氢酶或醛还原酶。
醛糖还原酶是细胞溶质的氧化还原酶，其催化各种醛和羰基的还原，包括单糖。
醛糖还原酶可被认为是醛-酮还原酶超家族的原型酶。该酶包含315个氨基酸残基并折叠成一个由8条平行的β股组成的β/α-桶状结构基序。相邻的股由8条以反平行于β片延伸的外围α-螺旋段连接。催化的活性位点位于桶的核心。NADPH辅因子位于β/α桶的顶部，把烟酰胺环投射在桶的中心并使焦磷酸横跨桶嘴。
在醛还原方向上的醛糖还原酶的反应机理遵循一个顺序有序的路径，其中NADPH结合在一起，接着是底物。NADPH的结合诱导包括表面环(残基213-217)的绞盘样运动的构象变化(酶•NADPH –> 酶*•NADPH)，以致以类似于安全带的方式覆盖一部分NADPH。醇产品通过NADPH的pro-R氢化物转移到底物的羰基碳表面上形成。醇产物释放后，另一个构象变化发生(E*•NAD(P)+ –> E•NAD(P)+)以释放NADP+。动力研究已表明，允许NADP+释放的这种环的重新定向似乎代表在醛还原方向上的速率限制步骤。因为辅酶释放的速率限制催化的速率，可以见到稳定辅酶结合的相互作用的微扰可具有对最大速度(Vmax)的巨大影响。
已显示D-木糖-发酵树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母产生一种与NADPH和NADH二者一起为活性的单醛糖还原酶(ALR)。其它酵母如嗜鞣管囊酵母和热带假丝酵母(C. tropicalis)合成多种形式的具有不同辅酶特异性的ALR。明显的双辅酶特异性将树干毕赤酵母(P. stipitis)和休哈塔假丝酵母(C. shehatae)酶与迄今为止从哺乳动物或微生物来源分离的大多数其它ALRs区分开来。酵母纤细假丝酵母CBS 4435在D-木糖上生长期间产生可比得上的NADH-和NADPH-连接的醛-还原活性。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木糖转化为木糖醇。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自红褐肉座菌。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由xyl1基因编码。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由GRE3基因编码。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自嗜鞣管囊酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自毕赤酵母属。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶是来自栎柱毕赤酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自假丝酵母属(Candida sp)。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自休哈塔假丝酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自纤细假丝酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自热带假丝酵母。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶是来自黑曲霉。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自粗糙脉孢菌。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶来自嗜乳酸隐球酵母。
在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自肉座菌、Scheffersomyces sp.、酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、曲霉属、脉孢菌属，和隐球酵母属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自红褐肉座菌、Scheffersomyces stipitis、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母、栎柱毕赤酵母、休哈塔假丝酵母、纤细假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、粗糙脉孢菌和嗜乳酸隐球酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1和/或GRE3或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 84和87的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 82、83、85和86的核酸序列编码。
木糖醇脱氢酶(1.1.1.9)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
木糖醇+ NAD+ = D-木酮糖+ NADH + H+
木糖醇脱氢酶也可称为D-木酮糖还原酶、NAD+-依赖性木糖醇脱氢酶、赤藓糖醇脱氢酶、2,3-顺式-多元醇(DPN)脱氢酶(C3-5)、戊糖醇-DPN脱氢酶、木糖醇-2-脱氢酶或木糖醇:NAD+ 2-氧化还原酶(D-木酮糖-形成)。
木糖醇脱氢酶(XDH)是负责将木糖同化到真核生物代谢中的几种酶之一并且可用于农业副产品中含有的木糖的发酵来生产乙醇。对于高流量速率的有效的木糖利用，共底物(cosubstrates)应该在NAD+-特异性的XDH和NADPH-偏好的木糖还原酶(在该路径中的另一种酶)之间循环利用。
在特定的实施方案中，所述酶将木糖醇转化为D-木酮糖。在一些实施方案中，木糖醇脱氢酶是来自酵母。在一些实施方案中，木糖醇脱氢酶是来自毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属或沙雷菌属。在一些实施方案中，木糖醇脱氢酶是来自树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌或粘质沙雷氏菌。在一些实施方案中，木糖醇脱氢酶由xyl2或xdh1编码。
在一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces sp.、木霉属、毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属，和沙雷菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces stipitis、里氏木霉、树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2和/或xdh1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 88、89和91的核酸序列编码。
碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)
碱性磷酸酶是负责从许多类型的分子，包括核苷酸、蛋白，和生物碱除去磷酸基团的水解酶。如名称所暗示的，碱性磷酸酶在碱性环境中是最有效的。它有时被用作碱性的磷酸酶(basic phosphatase)的同义词。
酿酒酵母Pho13碱性磷酸酶是具有60 kDa的分子量并在pH 8.2具有水解对-硝基苯基磷酸的最大活性的单体蛋白，其对Mg2+离子具有强烈的依赖性和3.6 x 10(-5) M的表观米氏常数(apparent Km)。除磷酸化组蛋白II-A和酪蛋白外，没有其它的测试的底物以任何明显的速度水解。这些数据提示对-硝基苯基磷酸-特异性磷酸酶的生理作用可包括参与可逆蛋白磷酸化。
在特定的实施方案中，所述酶将D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。在一些实施方案中，碱性磷酸酶来自酵母。在一些实施方案中，碱性磷酸酶来自酵母属。在一些实施方案中，碱性磷酸酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，碱性磷酸酶由PHO13基因编码。
在一些实施方案中，产生MEG和三碳化合物的重组微生物包含编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
可溶性吡啶核苷酸转氢酶(EC 1.6.1.1.)
本公开内容描述可催化以下反应的酶：
NADH + NADP+ = NAD+ + NADPH
可溶性吡啶核苷酸转氢酶也可被称为NAD(P)+转氢酶(B-特定)、STH、吡啶核苷酸转氢酶，或转氢酶。
大肠杆菌既含有可溶性吡啶核苷酸转氢酶，又含有膜-结合的吡啶核苷酸转氢酶。可溶性吡啶核苷酸转氢酶是sthA或udhA基因产品；其主要生理作用似乎是NADPH的再次氧化(Canonaco F. et al. (2001) 对在大肠杆菌中的磷酸葡萄糖异构酶敲除的代谢流量反应和可溶性转氢UdhA的过度表达的影响(Metabolic flux response to phosphoglucoseisomerase knock-out in Escherichia coli and impact of overexpression of thesoluble transhydrogenase UdhA). FEMS Microbiol Lett 204(2): 247-252; Sauer U.et al. (2004) 可溶性和膜-结合的转氢酶UdhA和PntAB具有在大肠杆菌的NADPH代谢中的不同的功能(The soluble and membrane-bound transhydrogenases UdhA and PntABhave divergent functions in NADPH metabolism of Escherichia coli) . J BiolChem 279(8): 6613-6619)。膜-结合的质子-易位转氢酶是pntAB基因产品(The membrane-bound proton-translocating transhydrogenase is the pntAB gene product); PntAB是NADPH的主要来源(Sauer et al. 2004)。
UdhA含有非共价结合的FAD并以7或8个单体组成的形式存在(Boonstra B. etal. (1999) 大肠杆菌的udhA基因编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶(The udhA gene ofEscherichia coli encodes a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase). JBacteriol 181(3): 1030-1034)。
UdhA (SthA)的适当的过度表达允许磷酸葡萄糖异构酶突变体的最大生长速率增加(Canonaco et al. 2001)，pgi sthA双突变体不是活的(Sauer et al. 2004)。这些表型可能是由于UdhA在过量NADPH形成的条件下恢复细胞氧化还原平衡的能力的缘故(Canonaco et al. 2001; Sauer et al. 2004)。在sthA中的突变在pgi突变株适应在葡萄糖基础培养基(glucose minimal medium)中生长期间出现(Charusanti P. et al.(2010) 在pgi，一种主要代谢基因缺失后，大肠杆菌的生长适应的基因基础(Geneticbasis of growth adaptation of Escherichia coli after deletion of pgi, a majormetabolic gene)." PLoS Genet 6(11): e1001186)。
sthA的转录通过在甘油上生长而下调(Sauer et al. 2004)。
在一些实施方案中，转氢酶的表达可增加NADPH-依赖的醇脱氢酶的活性，导致改进的丙酮向2-丙醇的转化。在一个实施方案中，可溶性吡啶核苷酸转氢酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶的核酸分子是udhA，或其同系物。在一些实施方案中，编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶的一个或多个核酸分子包含在SEQ ID NO: 110中提出的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码可溶性吡啶核苷酸转氢酶的一个或多个核酸分子由在SEQ ID NO: 109中提出的核酸序列编码。
使用重组微生物的MEG和一种或多种三碳化合物的生物合成
如上讨论的，本申请提供一种共生产一乙二醇(MEG)和一种或多种三碳化合物的重组微生物。在一个实施方案中，MEG和一种或多种三碳化合物是从木糖共产生的。在另一个实施方案中，重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因和/或编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变。在一些实施方案中，编码D-木酮糖-5-激酶的基因是xylB。在一些实施方案中，编码乙醇醛脱氢酶的基因是aldA。
在一个实施方案中，MEG经由核酮糖-1-磷酸从木糖生产。在另一个实施方案中，MEG经由木酮糖-1-磷酸从木糖生产。在进一步的实施方案中，MEG经由木糖酸从木糖生产。
在一个实施方案中，一种或多种三碳化合物从DHAP或丙酮酸生产。在一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙酮。在另一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是异丙醇。在进一步的实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙烯。
在一个优选的实施方案中，使用关于木糖转化为MEG和二羟基丙酮-磷酸(DHAP)的核酮糖-1-磷酸路径，和使用将DHAP转化为一种或多种三碳化合物的C3支路，从木糖生产MEG和一种或多种三碳化合物。
如上讨论的，在第一个方面，本公开内容涉及一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属和红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自菊苣假单胞菌、假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌和类球红细菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是dte和/或FJ851309.1，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由选自SEQ ID NOs: 1、2和4的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-核酮糖激酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码.在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是fucK，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶由选自SEQ ID NOs: 6和7的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是fucA，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由选自SEQ ID NOs: 9和10的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
在一个优选的实施方案中，使用关于木糖转化为MEG的木酮糖-1-磷酸路径和关于二羟基丙酮-磷酸(DHAP)转化为丙酮的C3支路，从木糖共产生MEG和丙酮。
如上讨论的，在第二方面，本公开内容涉及一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，D-木酮糖1-激酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子是己酮糖激酶C (khk-C)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子包含在SEQID NO: 55中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是醛缩酶B (ALDOB)，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 56和57的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码脱水酶-异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸并代之以转向D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的反应。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因，或其同系物编码。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸并代之以转向乙醇醛转化为MEG的反应。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
如上讨论的，在第三方面，本申请涉及一种能够从外源性D-木糖和葡萄糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子；
(b) 至少一个编码D-木糖异构酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖，和
其中微生物还表达以下的一种或多种：
(c) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)或(b)的D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(d) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(e) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶或甲基乙二醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自肉座菌、Scheffersomyces sp.、酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属, 假丝酵母属、曲霉属、脉孢菌属，和隐球酵母属的微生物获得的核酸分子编码 。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自红褐肉座菌、Scheffersomyces stipitis、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母、栎柱毕赤酵母、休哈塔假丝酵母、纤细假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、粗糙脉孢菌和嗜乳酸隐球酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1和/或GRE3或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 84和87的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 82、83、85和86的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces sp.、木霉属、毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属，和沙雷菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces stipitis、里氏木霉、树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2和/或xdh1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子由选自SEQID NOs: 88、89和91的核酸序列编码。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子编码木糖异构酶是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(i)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；和
(b) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XKS1基因，或其同系物编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XYL3基因，或其同系物编码。
在进一步的实施方案中，微生物是真菌。
在一个优选的实施方案中，MEG和丙酮是使用关于木糖转化为MEG的木糖酸路径和关于二羟基丙酮-磷酸(DHAP)转化为丙酮的C3支路从木糖共产生的。
如上讨论的，在第四方面，本申请涉及一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分，所述酶催化得自(b)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(d) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(e) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙醇醛转化为MEG；
(f) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(g) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(h) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh1(HVO_B0028)和/或xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子由在SEQ ID NO: 66中提出的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、硫磺矿硫叶菌和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG和/或yagF，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs:69, 72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和/或yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，并代之以转向将乙醇醛转化为MEG的反应。在一个实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，所述酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
如上讨论的，在第五方面，本申请涉及一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
(b) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(c) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh1(HVO_B0028)和/或xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、硫磺矿硫叶菌和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG和/或yagF，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs:69, 72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和/或yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，并代之以转向将乙醇醛转化为MEG的反应。在一个实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中，生产MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物包含编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙醇醛还原酶由一个或多个从选自大肠杆菌和酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子选自gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB (dkgB)，和/或yqhE (dkgA)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs:12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs:35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶的核酸分子是atoA和/或atoD，或其同系物。在另一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个从丙酮丁醇梭菌获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子是ctfA和/或ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，催化丙酮转化为异丙醇的酶是仲醇脱氢酶(S-ADH)。在另一个实施方案中，所述酶是仲醇脱氢酶，其由从选自伯克霍尔德氏菌属、产碱杆菌属、梭菌属、嗜热厌氧杆菌属、植物单胞菌属、红球菌属、甲烷杆菌属、产甲烷菌属、内阿米巴属、毛滴虫属，和三毛滴虫属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，编码仲醇脱氢酶的核酸分子从选自伯克霍尔德氏菌AIU 652、真养产碱杆菌、拉氏梭菌、拜氏梭菌、Clostridium carboxidivorans、布氏嗜热厌氧杆菌、嗜热厌氧乙醇杆菌(嗜热硫化氢梭菌)、赤红球菌、发光甲烷杆菌、产甲烷古菌泥游产甲烷菌、寄生原生动物溶组织内阿米巴、寄生原生动物阴道毛滴虫和人类寄生虫阴道滴虫的微生物获得。在一些实施方案中，一个或多个编码仲醇脱氢酶的核酸分子是adh、adhB、EhAdh1，或其同系物。在一些实施方案中，预测S-ADH来自同族关系并可来自油藏嗜热厌氧杆菌、藤黄微球菌、阿尔巴拟诺卡菌、幼龄林菌株分枝杆菌、猪螺杆菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母、拟平滑念珠菌、热带假丝酵母、Grosmannia clavigera和Scheffersomyces stipitis。在进一步的实施方案中，醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。在又一个实施方案中，醇脱氢酶由选自SEQ ID NOs: 104, 105和107的核酸序列编码。
重组微生物
本公开内容提供可被工程改造以表达各种内源性或外源性酶的微生物。
在此描述的各个实施方案中，重组微生物是真核微生物。在一些实施方案中，真核微生物是酵母。在示例性实施方案中，酵母是选自耶氏酵母(Yarrowia)、假丝酵母(Candida)、酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、伊萨酵母(Issatchenkia)、结合酵母(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、管囊酵母(Pachysolen)、隐球酵母(Cryptococcus)、毛孢子菌(Trichosporon)、红酵母(Rhodotorula)，和Myxozyma的属的成员。
在一些实施方案中，重组微生物是原核微生物。在示例性实施方案中，原核微生物是选自埃希氏菌、梭菌、发酵单孢菌(Zymomonas)、沙门氏菌、红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、肠球菌(Enterococcus)、产碱菌(Alcaligenes)、克雷伯氏菌、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、节杆菌(Arthrobacter)、棒杆菌，和短杆菌(Brevibacterium)的属的成员。
在一些实施方案中，重组微生物被用来生产本文公开的一乙二醇(MEG)。
因此，在另一个方面，本发明提供一种使用在此描述的重组微生物生产MEG和一种或多种三碳化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物，直至产生MEG和一种或多种三碳化合物。在进一步的实施方案中，MEG和一种或多种三碳化合物被回收。回收可采用本领域已知的方法，如蒸馏、膜-基分离气体剥离、溶剂提取，和扩张床吸附。在示例性实施方案中，三碳化合物选自丙酮、异丙醇，和丙烯。
在一些实施方案中，原料包含碳源。在各个在此描述的实施方案中，碳源可选自糖、甘油、醇、有机酸、烷烃、脂肪酸、木质纤维素、蛋白、二氧化碳、和一氧化碳。在示例性实施方案中，碳源是糖。在进一步的示例性实施方案中，所述糖是D-木糖。在备选的实施方案中，所述糖选自葡萄糖、果糖和蔗糖。
生成产生或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法
如上讨论的，本申请提供一种生成产生或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法。在一个实施方案中，MEG和一种或多种三碳化合物是从木糖共产生的。在另一个实施方案中，生成从外源性D-木糖产生或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法，包括将编码D-木酮糖-5-激酶的基因和/或编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物中。在一些实施方案中，编码D-木酮糖-5-激酶的基因是xylB。在一些实施方案中，编码乙醇醛脱氢酶的基因是aldA。
在一个实施方案中，MEG经由核酮糖-1-磷酸从木糖产生。在另一个实施方案中，MEG经由木酮糖-1-磷酸从木糖产生。在进一步的实施方案中，MEG经由木糖酸从木糖产生。
在一个实施方案中，一种或多种三碳化合物从DHAP或丙酮酸产生。在一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙酮。在另一个实施方案中，一种或多种三碳化合物是异丙醇。在进一步的实施方案中，一种或多种三碳化合物是丙烯。
如上讨论的，在一个方面，本公开内容提供一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属和红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自菊苣假单胞菌假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌和类球红细菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是dte和/或FJ851309.1，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-塔格糖3-差向异构酶由选自SEQ ID NOs: 1、2和4的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-核酮糖激酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是fucK，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖激酶由选自SEQ ID NOs: 6和7的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是fucA，或其同系物。在进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由选自SEQ ID NOs: 9和10的核酸序列编码。
在一个实施方案中，所述方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
如上讨论的，在另一个方面，本公开内容提供一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，D-木酮糖1-激酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子是己酮糖激酶C (khk-C)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子包含在SEQID NO: 55中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 53和54的核酸序列编码。
在一个实施方案中，D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是醛缩酶B (ALDOB)，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 56和57的核酸序列编码。
在一个实施方案中，所述方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化得自(f)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法包括将编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，并代之以转向将D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸的反应。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因，或其同系物编码。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法包括将编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，并代之以转向将乙醇醛转化为MEG的反应。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些以上公开的任何方面的实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法包括将编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
如上讨论的，在另一个方面，本公开内容提供一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖和葡萄糖生产或积聚MEG和丙酮，其包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子；
(b) 至少一个编码D-木糖异构酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖，和
其中该方法还包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(c) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，其催化得自(a)或(b)的D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(d) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，其催化得自(c)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(e) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，其催化得自(d)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶或甲基乙二醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，其催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自肉座菌、Scheffersomyces sp.、酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属, 假丝酵母属、曲霉属、脉孢菌属，和隐球酵母属的微生物获得的核酸分子编码 。在一些实施方案中，木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自红褐肉座菌、Scheffersomyces stipitis、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母、栎柱毕赤酵母、休哈塔假丝酵母、纤细假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、粗糙脉孢菌和嗜乳酸隐球酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1和/或GRE3或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 84和87的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 82、83、85和86的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces sp.、木霉属、毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属，和沙雷菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自Scheffersomyces stipitis、里氏木霉、树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2和/或xdh1，或其同系物。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 88、89和91的核酸序列编码。
在一个实施方案中，内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一个实施方案中，木糖异构酶是外源性的。在另一个实施方案中，木糖异构酶由一个或多个从Pyromyces sp获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA，或其同系物。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 93和94的核酸序列编码。
在一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化得自(i)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；和
(b) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
在一个实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XKS1基因，或其同系物编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XYL3基因，或其同系物编码。
在进一步的实施方案中，所述微生物是真菌。
如上讨论的，在另一个方面，本申请提供一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(d) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(e) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙醇醛转化为MEG；
(f) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(g) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(h) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh1(HVO_B0028)和/或xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖内酯酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子包含在SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子由在SEQ ID NO: 66中提出的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、硫磺矿硫叶菌和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG和/或yagF，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs:69, 72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和/或yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 76, 77, 79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化得自(h)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
在一些实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法，其包括将编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法包括将编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，并代之以转向将乙醇醛转化为MEG的反应。在一个实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法包括将编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，该酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
如上讨论的，在另一个方面，本申请提供一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
(b) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(c) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
在一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖脱氢酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprofundi和里氏木霉的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh1(HVO_B0028)和/或xyd1，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 59、60、62和64的核酸序列编码。
在一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，木糖酸脱水酶由一个或多个从选自新月柄杆菌、硫磺矿硫叶菌和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG和/或yagF，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子包含选自SEQ ID NOs:69, 72和75的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 68、70、71、73和74的核酸序列编码。
在一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和/或yagE，或其同系物。在进一步的实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。在又一个实施方案中，一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子由选自SEQ ID NOs: 76、77、79和80的核酸序列编码。
在一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
在另一个实施方案中，该方法还包括将至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子引入重组微生物和/或过度表达，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
在另一个实施方案中，该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖;
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸；
在一些实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法，其包括将编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止D-木糖转化为D-木酮糖，并代之以转向D-木糖转化为D-木糖酸的反应。在一个实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中, 一种生成从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物重组微生物的方法，其包括将编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从乙醇醛产生乙醇酸，并代之以转向将乙醇醛转化为MEG的反应。在一个实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因，或其同系物编码。
在一些实施方案中, 一种产生从外源性D-木糖生产或积聚MEG和一种或多种三碳化合物的重组微生物的方法，其包括将编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变引入重组微生物，以防止从丙酮酸产生乳酸，并代之以转向生产一种或多种三碳化合物的反应。在一个实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在特定的实施方案中，该酶将丙酮酸转化为乳酸。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因，或其同系物编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙醇醛还原酶由一个或多个从选自大肠杆菌和酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子选自gldA、GRE2、GRE3、yqhD、ydjG、fucO、yafB (dkgB)，和/或yqhE (dkgA)，或其同系物。在另一个实施方案中，一个或多个核酸分子是yqhD。在一些实施方案中，yqhD包含G149E突变。在进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙醇醛还原酶由选自SEQ ID NOs:12、14、16、18、19、21、22、24、26、27、29和31的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、酵母属和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和除烃海杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个核酸分子是thlA、atoB和/或ERG10，或其同系物。在进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶包含选自SEQ ID NOs:35、37和40的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，硫解酶或乙酰辅酶A乙酰基转移酶由选自SEQ ID NOs: 33、34、36、38和39的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个从选自梭菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶的核酸分子是atoA和/或atoD，或其同系物。在另一个实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由一个或多个从丙酮丁醇梭菌获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子是ctfA和/或ctfB，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97、99、101和103的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶或乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶由选自SEQ ID NOs: 41、42、44、45、96、98、100和102的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。在另一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌的微生物获得的核酸分子编码。在一些实施方案中，一个或多个编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc，或其同系物。在进一步的实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs: 49和52的氨基酸序列。在又一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶由选自SEQ ID NOs: 47、48、50和51的核酸序列编码。
在以上公开的任何方面的一个实施方案中，催化丙酮转化为异丙醇的酶是仲醇脱氢酶(S-ADH)。在另一个实施方案中，所述酶是仲醇脱氢酶，其由从选自伯克霍尔德氏菌属、产碱杆菌属、梭菌属、嗜热厌氧杆菌属、植物单胞菌属、红球菌属、甲烷杆菌属、产甲烷菌属、内阿米巴属、毛滴虫属，和三毛滴虫属的微生物获得的核酸分子编码编码。在一些实施方案中，编码仲醇脱氢酶的核酸分子从选自伯克霍尔德氏菌AIU 652、真养产碱杆菌、拉氏梭菌、拜氏梭菌、Clostridium carboxidivorans、布氏嗜热厌氧杆菌、嗜热厌氧乙醇杆菌(嗜热硫化氢梭菌)、赤红球菌、发光甲烷杆菌、产甲烷古菌泥游产甲烷菌、寄生原生动物溶组织内阿米巴、寄生原生动物阴道毛滴虫和人类寄生虫阴道滴虫获得。在一些实施方案中，一个或多个编码仲醇脱氢酶的核酸分子是adh、adhB、EhAdh1，或其同系物。在一些实施方案中，预测S-ADH 是来自同族关系且可来自油藏嗜热厌氧杆菌、藤黄微球菌、阿尔巴拟诺卡菌、幼龄林菌株分枝杆菌、猪螺杆菌、白色念珠菌、近平滑假丝酵母、拟平滑念珠菌、热带假丝酵母、Grosmannia clavigera和Scheffersomyces stipitis。在进一步的实施方案中，醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。在又一个实施方案中，醇脱氢酶由选自SEQID NOs: 104, 105和107的核酸序列编码。
酶工程
重组微生物中的酶可经工程改造以改进底物向产品转化的一个或多个方面。可经进一步工程改造以用于本公开内容的方法的酶的非限制性实例包括醛缩酶、醛还原酶、乙酰乙酰辅酶A水解酶、木糖异构酶、木糖醇脱氢酶及其组合。这些酶可经工程改造以提高催化的活性，提高选择性，提高稳定性，提高对各种发酵条件(温度、pH等)的耐受性，或提高对各种代谢底物、产物、副产物、中间体等的耐受性。如本文所用的关于特定酶促活性的术语“提高催化活性”指比相对于可比较的非-工程改造的酶测定的酶促活性更高水平的酶促活性。
例如，已使用工程方法改变醛缩酶的稳定性、底物特异性和立体特异性，以产生用于生物催化过程的优良的酶。使用来自大肠杆菌和鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的fda基因的家族DNA体外同源重组技术(family DNA shuffling)增加果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBP-醛缩酶)的热稳定性和溶剂耐受性。已鉴定显示于53℃比父母任何一方高出280倍的平均半衰期的第四代变体。相同变体也显示出在各种极性和非-极性有机溶剂中提高的活性(Hao和Berry 2004 Protein Eng Des Sel 17:689-697)。
作为另一个实例，乙酰乙酰辅酶A水解酶可将乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸。然而，该水解酶是非特异性的，因为它也与乙酰-CoA以相同的数量级反应，其是通过酶硫解酶形成乙酰乙酰-CoA所需的底物。因此，为创立更有效的乙酰乙酰-CoA水解酶，这些酶已通过替代酶β亚单元中的几个谷氨酸残基，经工程改造为对于乙酰乙酰-CoA底物比对于乙酰-CoA底物具有至少10x 更高的活性，所述酶β亚单元对于催化是重要的(WO 2015/042588)。
作为另一个实例，大肠杆菌YqhD酶是一种对于超过10个醛底物具有NADPH-依赖性还原酶活性的广泛的底物醛还原酶，并且是生产生物可再生燃料和化学物质的有用的酶(Jarboe 2010 Applied Microbiology and Biotechnology 89: 249)。虽然YqhD酶通过其清除有毒的醛的活性是有益的，该酶也是NADPH-依赖性的并对有机体的NADPH消耗和生长抑制有影响。进行YqhD的易错PCR (Error-prone PCR)以改进从3-羟基丙醛(3-HPA)生产1,3-丙二醇。这种定向工程改造产生了两种突变体，D99QN147H和Q202A，对某些醛，特别是3-HPA，则有减少的Km和增加的kcat (Li et al. 2008 Prog. Nat. Sci. 18 (12):1519-1524)。提高D99QN147H突变体的催化活性与已知的关于YqhD的结构是一致的(Sulzenbacher et al. 2004 J. Mol. Biol. 342 (2):489-502)，因为残基Asp99和Asn147二者与NADPH相互作用。使用D99QN147H突变体使从3-HPA生产1,3-丙二醇增加了1倍。具有对NADPH的增加的催化效率(增加Kcat/Km)的突变体YqhD酶也已在WO 2011012697A2中有描述，其以其整体结合到本文中。
作为另一个实例，木糖异构酶是催化醛糖和酮糖，主要是木糖至木酮糖和葡萄糖至果糖之间的相互转化的金属-依赖性酶。它对来苏糖、阿拉伯糖和甘醣醇糖的亲和力较低。糖的羟基可限定糖异构酶的底物偏好。嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)木糖异构酶的残基256的天冬氨酸被精氨酸替代(Patel et al. 2012 Protein Engineering,Design & Selection vol. 25 no. 7 pp. 331–336)。这种突变木糖异构酶显示出对D-来苏糖、L-阿拉伯糖和D-甘露醇糖的特异性增加。D256R木糖异构酶突变体对这3个底物的催化效率也比野生型酶更高。推测在突变体酶中残基256的精氨酸可在催化反应中起作用或影响取向的变化。
作为另一个实例，酶木糖醇脱氢酶与木糖还原酶一起在木糖的利用中发挥作用。木糖还原酶(XR)将木糖还原为木糖醇，然后木糖醇脱氢酶(XDH)再氧化木糖醇以形成木酮糖。然而，因为XR偏爱NADPH作为共底物，而XDH只使用NAD+作为共底物，遇到了共底物回收问题。一种解决方案是工程改造XDH，以致其共底物特异性从NAD+改变为NADP+(Ehrensberger et al. 2006 Structure 14: 567-575)。氧化葡萄糖杆菌全酶的结晶结构揭示Asp38是导致对XDH的NAD+特异性的主要原因。Asp38与腺苷核糖的羟基相互作用，而Met39在嘌呤环下堆叠并且也位于2’羟基附近。双突变体(D38S/M39R) XDH是专门用来使用NADP+构建，而不失去酶活性。
增加路径流量的代谢工程–酶过度表达或酶下调/缺失
在此描述的各个实施方案中，在参与在此描述的生物合成途径的重组微生物中的外源性和内源性酶可过度表达。
术语“过度表达的”或“过度表达”指蛋白的mRNAs编码的水平升高(如，异常水平)，和/或指与表达mRNAs基础水平或具有蛋白基础水平的相似的对应未修饰细胞比较，细胞中蛋白的水平升高。在特定的实施方案中, mRNA或蛋白可在工程改造以显示出基因mRNA、蛋白，和/或活性增加的微生物中过度表达至少2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、8-倍、10-倍、12-倍、15-倍或更多倍。
在一些实施方案中，本公开内容的重组微生物从具有对合成底物如D-木酮糖、D-核酮糖、D-核酮糖-1-磷酸、D-木酮糖-1-磷酸、D-木糖内酯、D-木糖酸、2-酮-3-脱氧-木糖酸、乙醇醛、DHAP、丙酮酸、乙酰乙酰-CoA或乙酰乙酸的酶促能力的宿主生成。在一些实施方案中，它可用来增加，例如，D-木酮糖、D-核酮糖、D-核酮糖-1-磷酸、D-木酮糖-1-磷酸、D-木糖内酯、D-木糖酸、2-酮-3-脱氧-木糖酸、乙醇醛、DHAP、丙酮酸、乙酰乙酰-CoA或乙酰乙酸的合成或积聚，以增加MEG和一种或多种三碳化合物的产生。
在一些实施方案中，它可用来增加参与MEG和三碳化合物生物合成途径的内源性或外源性酶的表达，以增加来自例如D-木酮糖、D-核酮糖、D-核酮糖-1-磷酸、D-木酮糖-1-磷酸、D-木糖内酯、D-木糖酸、2-酮-3-脱氧-木糖酸、乙醇醛、DHAP、丙酮酸、乙酰乙酰-CoA或乙酰乙酸的流量，从而导致MEG和一种或多种三碳化合物的合成或积聚增加。
增加的合成或积聚可通过例如编码一个或多个上述MEG和三碳化合物生物合成路径酶的核酸的过度表达来实现。MEG和三碳化合物生物合成路径酶的过度表达可例如通过增加内源性基因的表达，或通过增加外源性基因的表达发生。因此，可容易地修饰天然存在的生物以通过过度表达一个或多个编码MEG和三碳化合物生物合成路径酶的核酸分子，以生成产生非-天然的、MEG和三碳化合物的微生物。此外，非-天然存在的生物可通过导致MEG和三碳化合物生物合成途径中酶的活性增加的内源性基因诱变来生成
借助于本公开内容，技术人员将能够容易地构建在此描述的重组微生物，作为本公开内容的重组微生物可使用本领域熟知的方法(如上文举例说明的)构建，以足以产生MEG和一种或多种三碳化合物的量外源性表达至少一个编码MEG和三碳化合物生物合成路径酶的核酸。
构建和测试非-天然存在的MEG和三碳化合物-生产宿主的表达水平的方法可例如通过重组和检测本领域熟知的方法执行。这样的方法可在例如，Sambrook et al., 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第三版, Cold SpringHarbor Laboratory, New York (2001); Ausubo et al., 分子生物学的最新方案(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley and Sons, Baltimore, Md.(1999)的描述中找到。
本领域已知的各种机制可被用来表达，或过度表达外源性或内源性基因。例如，可构建表达载体以包含一个或多个编码如本文举例说明的核酸的MEG和三碳化合物生物合成路径酶，所述酶可操作地连接于宿主生物中的功能表达控制序列。适合用于本发明的微生物宿主生物的表达载体包括，例如，质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体(episomes)和人工染色体，包括载体和选择序列或可操作用于稳定融入宿主染色体的标记。也可包括可选择的标记基因，例如，提供对抗生素或毒素提供抗性，补充营养缺陷型(auxotrophic)缺乏，或提供培养基中没有的关键营养素。表达控制序列可包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子，转录增强子、转录终止子等。当两种或更多种外源性编码核酸被共同表达时，两种核酸都可以插入例如到单一表达载体或分开的表达载体中。对于单一载体表达，编码核酸可操作地连接于一个通用的表达控制序列或连接于不同的表达控制序列，如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。参与代谢或合成途径中的外源性核酸序列的转化可使用本领域熟知的方法证实。
如由本领域技术人员所理解的，修饰一种编码序列以提高其在特定宿主中的表达可能是有利的。有64个可能的密码子的遗传密码是多余的，但大多数生物通常使用这些密码子的亚组。在一个物种中最常使用的密码子被称为最优密码子，而那些不经常使用的被归类为稀有或低使用量密码子。密码子可以被替换以反映宿主偏好的密码子用法，一个有时称为"密码子优化"或"控制物种密码子偏爱"的过程。
例如，可准备含有特定原核生物或真核生物宿主所偏爱的密码子的优化编码序列(也见, Murray et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:477-508)，以增加翻译的速率或产生具有理想性能的重组RNA转录物，如较长的半衰期，如与未优化序列产生的转录物比较的。翻译终止密码子也可以修饰以反映宿主偏好。例如，对于酿酒酵母和哺乳动物的典型的终止密码子分别是UAA和UGA。对于单子叶植物(monocotyledonous plants)的典型的终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌通常使用UAA作为终止密码子(Dalphin et al. (1996)Nucl. Acids Res. 24: 216-218)。
本领域技术人员将能识别，由于遗传密码的退化性质，多种核酸序列可被用来编码本公开内容的给定的酶。编码生物合成酶的核酸序列在此引用仅仅是为了说明本公开内容的实施方案，本公开内容包括任何编码本公开内容的酶的多肽和蛋白的氨基酸序列的核酸序列。以相似的方式，多肽一般能耐受在其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失，和插入，而不失去或显著失去所需的活性。本公开内容包括具有与本文描述的特定蛋白质不同的氨基酸序列的此类多肽，只要修饰的或变异的多肽具有参考多肽的酶促合成代谢或分解代谢的活性。此外，本文所示的由核酸序列编码的氨基酸序列仅仅说明本公开内容的实施方案。
表达控制序列是本领域已知的并包括，例如，启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、转录终止子、核糖体内部进入位点(IRES)等，其提供多核苷酸序列在宿主细胞中的表达。表达控制序列特别地与参与转录的细胞蛋白相互作用(Maniatis et al., Science, 236:1237-1245 (1987))。示例性表达控制序列被描述于，例如Goeddel, 基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology: Methods in Enzymology), Vol. 185, AcademicPress, San Diego, Calif. (1990)中。
在各个实施方案中，表达控制序列可操作地连接于多核苷酸序列。所谓“可操作地连接”意指多核苷酸序列和表达控制序列以这样一种方式连接，即当适宜的分子(如，转录激活蛋白)结合于表达控制序列时允许基因表达。可操作地连接的启动子位于按转录和翻译方向选定的多核苷酸序列的上游。可操作地连接的增强子可位于选定的多核苷酸的上游、多核苷酸内，或多核苷酸下游。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以在路径中删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个催化反应的内源性酶的活性，所述路径与生物合成路径竞争用于生产MEG和一种或多种三碳化合物。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸。在一些这样的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由xylB基因或其同系物编码。在一些实施方案中，所述操纵防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸并代之以将反应转向使D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化将乙醇醛转化为乙醇酸。在一些这样的实施方案中，催化乙醇醛转化为乙醇酸的酶是乙醇醛脱氢酶。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乙醇醛脱氢酶由aldA基因或其同系物编码。在一些实施方案中，操纵防止从乙醇醛生产乙醇酸并代之以将反应转向使乙醇醛转化为MEG。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。在一些这样的实施方案中，催化丙酮酸转化为乳酸的酶是乳酸脱氢酶。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，乳酸脱氢酶由ldhA基因或其同系物编码。在一些实施方案中，操纵防止从丙酮酸产生乳酸并代之以将反应转向生产三碳化合物。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸。在一些这样的实施方案中，催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的酶是D-木酮糖-5-激酶。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶是来自酿酒酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XKS1基因或其同系物编码。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶来自树干毕赤酵母。在一些实施方案中，D-木酮糖-5-激酶由XYL3基因或其同系物编码。在一些实施方案中，操纵防止D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸并代之以将反应转向使D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。在一些这样的实施方案中，催化D-木酮糖-5-磷酸的酶转化为D-木酮糖是碱性磷酸酶。在一些实施方案中，碱性磷酸酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，碱性磷酸酶由PHO13基因或其同系物编码。在一些实施方案中，操纵防止D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
在一些实施方案中，重组微生物被操纵以删除，破坏，变异，和/或减少一个或多个内源性酶的活性，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。在一些这样的实施方案中，催化D-木糖转化为D-木酮糖的酶是D-木糖异构酶。在一些实施方案中，D-木糖异构酶来自大肠杆菌。在一些实施方案中，D-木糖异构酶由xylA基因或其同系物编码。在一些实施方案中，操纵防止D-木糖转化为D-木酮糖并代之以转向将D-木糖转化为D-木糖酸的反应。
实施例
实施例1a. 乙二醇在大肠杆菌中的生产
大肠杆菌K12株MG1655被用作缺失两个可将碳流量从MEG+IPA路径转移的基因的宿主：aldA和xylB。基因被成功地删除，而缺失通过测序确认。含有编码路径的第一个酶(D-塔格糖3-差向异构酶，SEQ ID NO: 3，由核酸序列SEQ ID NO: 2编码)的dte基因的质粒，在pUC载体骨架中的proD启动子的控制下表达。质粒使用MoClo系统构建并通过测序确认。经确认的质粒在缺失的菌株中被转化。为了预培养，在3mL LB培养基中接种了转化产生的菌落。在培养16小时后，将10%预培养物转移至含有15g/L木糖的50 mL LB培养基中。于37℃、250rpm下温育烧瓶，直至完全消耗木糖。培养的初始OD是0.4。在培养96小时后木糖被完全消耗。在培养27小时后检测到少量MEG。最高MEG浓度在培养100小时后测量，达到2.1 g/L。MEG生产的总产量是13.7 wt% (图7)。
实施例1b. 改进乙二醇在大肠杆菌中的生产
aldA和xylB基因缺失的大肠杆菌K12株MG1655 (与实施例1a相同的菌株)被用作实施完全MEG路径的宿主。含有dte (D-塔格糖3-差向异构酶，SEQ ID NO: 3，由核酸序列SEQ IDNO: 2编码)、fucA (D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶，SEQ ID NO: 11，由核酸序列SEQ ID NO: 10编码)、fucO (醛还原酶、SEQ ID NO: 28, 由核酸序列SEQ ID NO: 27编码)和fucK (D-核酮糖激酶，SEQ ID NO: 8, 由核酸序列SEQ ID NO: 7编码)基因的操纵子在proD启动子的控制下，在pET28a骨架中构建。质粒是使用In-fusion商业试剂盒构建的并通过测序确认。经确认的质粒在MG1655突变菌株中转化。为了预培养，在3 mL LB培养基中接种了转化的菌落。培养16小时后，将预培养物转移至含有15 g/L木糖的50 mL LB培养基中，使初始OD为0.3。于37℃、250 rpm下温育烧瓶，直至完全消耗木糖。培养4小时后，可检测到大约100 mg/L MEG。培养144小时后，产生4.3 g/L MEG并消耗全部木糖(图8)。总产量和生产率分别是0.3 g/g和0.03 g/L.h。
实施例2：乙二醇和异丙醇在酿酒酵母中的共生产
酿酒酵母实验室株BY4730，从S288c衍生，被用作表达MEG+IPA途径的宿主。第一个步骤是将IPA路径整合到酿酒酵母的基因组中。每个基因的一个拷贝在以下启动子的控制下通过同源重组整合：对于thl基因为ADH1 (硫解酶，SEQ ID NO: 35，由核酸序列SEQ ID NO:34编码)；对于atoA基因为TEF1，对于atoD基因为PGK1 (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶，SEQ IDNOs: 43和46，分别由核酸序列SEQ ID NOs: 42和45编码)；对于adc基因为TDH3 (乙酰乙酸脱羧酶，SEQ ID NO: 49, 由核酸序列SEQ ID NO: 48编码)；和对于adh基因为TPI1 (仲醇脱氢酶，SEQ ID NO: 106, 由核酸序列SEQ ID NO: 105编码)。整合通过PCR和测序确认。第二个步骤是引入能够消耗酵母基因组中的木糖的基因。为木糖消耗选择的途径由两个基因组成：Xyl1和Xyl2。Xyl1基因的3个拷贝(SEQ ID NO: 84，由核酸序列SEQ ID NO: 83编码)在TEF1启动子的控制下和Xyl2基因的3个拷贝(SEQ ID NO: 90, 由核酸序列SEQ ID NO:89编码)也在TEF1启动子的控制下通过同源重组被整合到酵母基因组中。整合通过PCR和测序确认。第三个步骤是MEG路径的整合。D-塔格糖3-差向异构酶的两个拷贝(dte基因, SEQID NO: 3, 由核酸序列SEQ ID NO: 2编码)分别在TEF1和TDH3启动子的控制下，与以下基因一起被整合到基因组中：fucO基因的1个拷贝(乙醇醛还原酶、SEQ ID NO: 28, 由核酸序列SEQ ID NO: 27编码)在PGK1启动子的控制下；fucA基因的1个拷贝(D-核酮糖-磷酸醛缩酶，SEQ ID NO: 11，由核酸序列SEQ ID NO: 10编码)使用PGK1启动子和fucK基因的1个拷贝(D-核酮糖激酶，SEQ ID NO: 8，由核酸序列SEQ ID NO: 7编码)在PGK1启动子的控制下。最终菌株通过PCR和测序确认。在含有20 g/L葡萄糖的YPD培养基中接种菌株并于30℃、200rpm温育。在生长16小时后，在含有30 g/L葡萄糖和10 g/L木糖的YPDX培养基中接种预培养物至OD 2.0。于30℃、100 rpm下温育烧瓶。在酵母中的C5和C6消耗的典型行为被观察到。在不到60小时内消耗了30g/L葡萄糖，而90%的初始木糖仅在200小时后被消耗。在培养200小时后，OD达到55的值。在培养的初始60小时内已产生异丙醇，而MEG仅在培养160小时后才被检测到。最高的共生产在培养183小时时获得，伴有58 mg/L MEG和2.81 g/L异丙醇。从葡萄糖和木糖共生产的总产量是7.4% (图6)。
实施例3. 在大肠杆菌中使用核酮糖-1-磷酸路径共生产乙二醇(MEG)、丙酮和异丙醇(IPA)
大肠杆菌K12株MG1655被用作缺失两个可将碳流量从MEG+IPA路径转移的基因的宿主：aldA和xylB。基因被成功地删除，而缺失通过测序确认。用于MEG生产的核酮糖-1-磷酸路径是由3个不同的载体骨架组装的：pZA31、pZS*13和pET28a。通过核酮糖-1-磷酸路径生产MEG需要表达4个基因：dte (D-塔格糖3-差向异构酶)、fucA (D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶)、fucO(醛还原酶)和fucK (D-核酮糖激酶)。dte基因是对大肠杆菌(在SEQ ID NO: 3中提出的Dte氨基酸序列)优化并合成的密码子。所有其它基因均天然来源于大肠杆菌，并且利用以下引物进行PCR扩增：fucA和fucO (正向引物：CCTTTAATAAGGAGATATACCATGGAACGAAATAAACTTGC(SEQ ID NO: 111)和负向引物：GGTTATTCCTCCTTATTTAGAGCTCTAAACGAATTCTTACCAGGCGGTATGGTAAA (SEQ ID NO: 112))和fucK (正向引物：GAATTCGTTTAGAGCTCTAAATAAGGAGGAATAACCATGATGAAACAAGAAGTTAT (SEQ ID NO: 113)和负向引物：GAGCT CGGTACCCGGGGATCCAAAAAACCCCTCAAGACCC (SEQ ID NO: 114))。含有dte (D-塔格糖3-差向异构酶)、fucA (D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶)、fucO (醛还原酶)、fucK (D-核酮糖激酶)基因和T7终止子的操纵子在proD启动子(组成型启动子)的控制下在pET28a骨架中构建。对于每个基因，使用特异性RBS序列。质粒使用In-fusion商业试剂盒构建并通过测序确认。在proD启动子的控制下，使用限制性结扎方法，在pZA31和pZS*13骨架中对整个操纵子进行亚克隆。
异丙醇路径也以3个不同的载体骨架组装：pZA31、pZS*13和pET28a。生产异丙醇需要表达5个基因：thl (硫解酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)和adh (仲醇脱氢酶)。AtoA/D基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 115)和负向引物：TATATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQ ID NO: 116))。thl (在SEQ ID NO: 35中提出的Thl氨基酸序列)、adc (在SEQ ID NO: 49中提出的Adc氨基酸序列)，和adh (在SEQ ID NO: 106中提出的Adh氨基酸序列)是对大肠杆菌优化并合成的密码子。含有thl (硫解酶)、adh (仲醇脱氢酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)基因和T1终止子的操纵子在诱导型启动子pLLacO的控制下在pET28a骨架中构建。对于每个基因，使用特异性RBS序列。质粒使用In-fusion商业试剂盒和限制性结扎方法，在几个步骤中构建。正确的装配通过测序确认。在诱导型启动子pLLacO的控制下，使用限制性结扎方法在pZA31和pZS*13骨架中对整个操纵子进行亚克隆.
在xylB和aldA缺失的菌株中对MEG和IPA质粒进行多次共转化，以生成包含所有可能的质粒组合的菌株。表2描述构建的菌株。
表2
菌株 质粒和途径
1 在pET28a中的MEG和在pZA31中的IPA
2 在pET28a中的MEG和在pZS*13中的IPA
3 在pZA31中的MEG和在pZS*13中的IPA
4 在pZA31中的MEG和在pET28a1中的IPA
5 在pZS*13中的MEG和在pZA31中的IPA
6 在pZS*13中的MEG和在pET28a中的IPA
转化产生的菌落被接种在3mL TB培养基中进行预培养，培养16小时后，将100%的预培养物转移至含有15g/L木糖的100 mL TB培养基中。于37℃、250 rpm下温育烧瓶，直至完全消耗木糖。培养的初始OD是0.3。为了pLLacO启动子的诱导，2小时后将1mM IPTG加入到培养物中(OD= 1)。
对于菌株1-4，培养32小时后木糖完全消耗。只有菌株5在55小时后完全消耗木糖，而菌株6在144小时后仍不能消耗全部木糖。
考虑每克木糖消耗所产生的乙二醇、异丙醇和丙酮的量来计算共生产的总产量。48小时发酵后，获得了最佳的产量。所有的菌株的产量(g产品/g木糖)列于图9中。
菌株2和3共生产MEG、异丙醇和丙酮，而菌株1和4仅共生产MEG和丙酮。菌株5和6仅生产MEG。
菌株2显示了最高总产量(0.28 g/g)，以及对乙二醇(0.25 g/g)和异丙醇(0.03g/g)产生的最高产量。菌株4显示了对丙酮生产的最高产量(0.01 g/g)。
实施例4. 在大肠杆菌中使用木酮糖-1-磷酸路径共生产乙二醇(MEG)、丙酮和异丙醇(IPA)
大肠杆菌K12株MG1655被用作表达MEG+IPA途径的宿主。可从MEG+IPA路径转移碳流量的两个基因被确定为缺失的靶标：aldA和xylB基因。MEG路径在xylB基因座被整合，使得能够在xylB 缺失的同时实现稳定的整合。通过木酮糖-1-磷酸路径生产MEG需要表达3个基因：khkC (D-木酮糖-1-激酶)、aldoB (D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶)和fucO (醛还原酶)。khkC(在SEQ ID NO: 55中提出的KhkC氨基酸序列)和aldoB (在SEQ ID NO: 58中提出的AldoB氨基酸序列)基因是对大肠杆菌优化并合成的密码子。FucO基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：ATGGCTAACAGAATGATTCTG (SEQ ID NO: 117)和负向引物：TTACCAGGCGGTATGGTAAAGCT (SEQ ID NO: 118))。
MEG整合盒在与xylB基因上游和下游同源的区域侧接的proD启动子(组成型启动子)的控制下，由含有khkC (D-木酮糖-1-激酶)、aldoB (D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶)、fucO(醛还原酶)基因和rplM终止子的操纵子组成。对于每个基因，使用特异性RBS序列。还在盒中添加了抗生素标记，用于选择转化突变型。盒使用In-fusion商业试剂盒构建，通过测序确认并在大肠杆菌K12 MG1655菌株中转化。MEG路径在xylB基因座的合适的整合，产生具有整合的MEG路径的缺失xylB株，已通过测序确认。
在xylB基因座包含MEG路径的菌株被用作IPA路径在aldA基因座整合的宿主，使得能够在aldA 缺失的同时实现稳定的整合。生产异丙醇需要表达5个基因：thl (硫解酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)和adh (仲醇脱氢酶)。atoA/ D基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 119)和负向引物：TATATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQID NO: 120))。thl (在SEQ ID NO: 35中提出的Thl氨基酸序列)、adc (在SEQ ID NO: 49中提出的Adc氨基酸序列)和adh (在SEQ ID NO: 106中提出的Adh氨基酸序列)是对大肠杆菌优化并合成的密码子。
IPA整合盒在与aldA基因上游和下游同源的区域侧接的中等强度组成型启动子(从RecA修饰的)控制下，由含有thl (硫解酶)、adh (仲醇脱氢酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)基因和T1终止子的操纵子组成。对于每个基因，使用特异性RBS序列。盒中包含了抗生素标记，用于选择转化突变型。盒使用In-fusion商业试剂盒构建，通过测序确认并在大肠杆菌K12 MG1655菌株中转化。IPA路径在aldA基因座的合适的整合，产生具有整合的IPA路径的缺失aldA株，已通过测序确认。
为了预培养，在基因组中具有整合的MEG和IPA途径的xylB aldA缺失株在3mL TB培养基中接种。培养16小时后，将100%的预培养物转移至含有15g/L木糖的100 mL TB培养基中。于37℃、250 rpm温育烧瓶，直至完全消耗木糖。培养的初始OD是0.3。
在培养30小时后木糖完全消耗 (图10)。乙二醇、丙酮和异丙醇分别达到3.5 g/L、70 mg/L和400 mg/L的最大滴度。
考虑每克木糖消耗所产生的乙二醇、异丙醇和丙酮的量来计算共生产的总产量。MEG是具有最高产量0.237 g/g的产品，接着是异丙醇0.029 g/g和丙酮0.006 g/g (图11)。48小时的发酵后，获得了最佳的共生产产量，为0.27 g产品/g木糖(44%的最大理论产率)。
实施例5. 在大肠杆菌中使用木糖酸路径共生产乙二醇(MEG)、丙酮和异丙醇(IPA)
大肠杆菌K12株MG1655被用作表达MEG+IPA途径的宿主。可从MEG+IPA路径转移碳流量的两个基因被确定为缺失的靶标：aldA和xylA基因。MEG路径在xylA基因座被整合，使得能够在xylA缺失的同时实现稳定的整合。通过木糖酸路径生产MEG需要表达两种基因：来自新月柄杆菌的xdh (在SEQ ID NO: 61中提出的Xdh氨基酸序列)是对大肠杆菌优化并合成的密码子。FucO基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：ATGGCTAACAGAATGATTCTG(SEQ ID NO: 117)和负向引物：TTACCAGGCGGTATGGTAAAGCT (SEQ ID NO: 118))。两个其它的天然酶可过度表达以通过木糖酸路径改进MEG产生：D-木糖酸脱水酶(yjhG、yagF，或其同系物)和醛缩酶(yjhH、yagE，或其同系物)。
MEG整合盒在与xylA基因上游和下游同源的区域侧接的proD启动子(组成型启动子)的控制下，由含有xdh (D-木糖脱氢酶)、fucO (醛还原酶)基因和rnpB终止子的操纵子组成。对于每个基因，使用特异性RBS序列。也向盒中加入了抗生素标记，用于选择转化突变型。盒使用In-fusion商业试剂盒构建，通过测序确认并在大肠杆菌K12 MG1655菌株中转化。MEG路径在xylA基因座的合适的整合，产生具有整合的MEG路径的缺失xylA株，已通过测序确认。
在xylA基因座包含MEG路径的菌株被用作在aldA基因座整合IPA路径的宿主，使得能够在aldA缺失的同时实现稳定的整合。生产异丙醇需要表达5个基因：thl (硫解酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)和adh (仲醇脱氢酶)。AtoA/ D基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 119)和负向引物：TATATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQID NO: 120))。thl (在SEQ ID NO: 35中提出的Thl氨基酸序列)、adc (在SEQ ID NO: 49中提出的Adc氨基酸序列)和adh (在SEQ ID NO: 106中提出的Adh氨基酸序列)是对大肠杆菌优化并合成的密码子。
IPA整合盒在与aldA基因上游和下游同源的区域侧接的中等强度组成型启动子(从RecA修饰的)的控制下，由含有thl (硫解酶)、adh (仲醇脱氢酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)基因和T1终止子的操纵子组成。对于每个基因，使用特异性RBS序列。盒中包含了抗生素标记，用于选择转化突变型。盒使用In-fusion商业试剂盒构建，通过测序确认并在大肠杆菌K12 MG1655菌株中转化。IPA路径在aldA基因座的合适的整合，产生具有整合的IPA路径的缺失aldA株，已通过测序确认。
为了预培养，将在基因组中具有整合的MEG和IPA途径的xylA aldA缺失株在3mLTB培养基中接种。培养16小时后，将100%的预培养物转移至含有15g/L木糖的100 mL TB培养基中。于37℃、250 rpm下温育烧瓶，直至完全消耗木糖。培养的初始OD是0.3。
在培养24小时前木糖完全消耗(图12)。乙二醇、丙酮和异丙醇分别达到5 g/L、170mg/L和420 mg/L的最大滴度。
考虑每克木糖消耗所产生的乙二醇、异丙醇和丙酮的量来计算共生产的总产量。MEG是具有最高产量0.339 g/g的产品，接着是异丙醇0.028 g/g和丙酮0.008 g/g (图13)。48小时的发酵后，获得了最佳的共生产产量，为0.375 g产品/g木糖(61%的最大理论产量)。
实施例6. 从葡萄糖直接生产丙烯
在操纵子中含有IPA路径的载体pZs*13在plLacO启动子和含有LinD基因的pET28a存在下，使用电穿孔共转化为BL21Star (DE3)。生产异丙醇需要表达5个基因：thl (硫解酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)和adh (仲醇脱氢酶)。atoA/ D基因天然来自大肠杆菌，并经PCR扩增(正向引物：CTGTTGTTATATTGTAATGATGTATGCAAGAGGGATAAA (SEQ ID NO: 119)和负向引物：TATATCTCCTTCTTAAAGTTCATAAATCACCCCGTTGC (SEQID NO: 120))。thl (在 SEQ ID NO: 35中提出的Thl氨基酸序列)、adc (在SEQ ID NO: 49中提出的Adc氨基酸序列)和adh (在SEQ ID NO: 106中提出的Adh氨基酸序列)是对大肠杆菌优化并合成的密码子。在诱导型启动子pLLacO的控制下，在pZS*13骨架中构建含有thl(硫解酶)、adh (仲醇脱氢酶)、adc (乙酰乙酸脱羧酶)、atoA/D (乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶)基因和T1终止子的操纵子。候选物选择使用卡那霉素和氨苄西林在LB培养基中进行。菌株在此被称为IPA+LinD。质粒的这种组合提供能够从葡萄糖生产异丙醇并且也表达芳樟醇异构酶脱水酶的菌株。
于37℃、220rpm下，将IPA+LinD、pZs*13_IPA和pET28a_LinD的一个单一菌落在含有补充有卡那霉素(50 µg/mL)和氨苄西林(100 µg/mL)的10g/L甘油的TB培养基中接种。20小时后，于37℃、220rpm下，在含有补充有适宜的抗生素的1.5g/L甘油的TB培养基中，使用0.2的光密度进行新的接种。3小时后，OD在600nm达到1.0并加入IPTG至1mM的最终浓度。于18℃、220rpm温育烧瓶。
16小时后，测量OD并浓缩培养物，使用如对每个测定描述的以下培养基以达到OD20：
(a) 在TB 20g/L葡萄糖中的pZs*13_IPA (异丙醇产生的对照)，
(b) 在TB 10g/L甘油和3g/L异丙醇中的IPA+LinD (丙烯产生的对照)，
(c) 在TB 20g/L葡萄糖和3g/L异丙醇中的IPA+LinD (丙烯产生的对照)，
(d) 在TB 20g/L葡萄糖中的IPA+LinD (丙烯产生的候选物1)，
(e) 在TB 20g/L葡萄糖中的IPA+LinD (丙烯产生的候选物2)
将所有的培养物的一个等分试样溶解以供表达分析，于4℃，将细胞通过以5000 rpm离心20 min收集。于-80℃保持沉淀1小时，然后在冰上融化并再悬浮于Tris-HCl 50mM (pH7.5)中的10%原始体积中。通过在冰上超声处理(3-5个循环，10/10分钟，25%振幅)进行溶解，在此之后分离可溶性部分，于4℃以5000 rpm离心30 min。于95℃将样品加热10分钟并在SDS-PAGE中分析(图14)。
按一式三份将每个培养物的1.0 mL等分试样置于2mL顶空小瓶中并于37℃、225rpm下温育。在温育116小时结束后，从振荡恒温培养箱移出小瓶，丙烯和异丙醇浓度以GC-MS分析。建立仅含有TB培养基 20g/L葡萄糖的对照品以在温育期结束时核实污染情况。将1.0 mL的顶空相注入配备有电子撞击质谱仪探测器(ISQ – Thermo)的气相色谱仪(FocusGC - Thermo)中。氦被用作载体气体，流速为1.5 mL/min，使用的拆分率为10，伴有15 mL/min的拆分流。挥发性化合物在HP-Plot/Q柱(Agilent)中分离，初始温度保持在90℃ 1.0min，接着以13.3℃/min首次爬升至130℃和以45℃/min的第二次爬升至200℃，保持1 min。丙烯在这些条件下的保留时间是1.51 min，而异丙醇的保留时间是4.3 min。产品反应通过与丙烯和异丙醇标准品比较和通过与质谱裂解数据库比较来确定。
在测定(a)、(d)和(e)中异丙醇的生产是0.5 g/L，而在(b)和(c)中预期为3.0g/L。4 10-5 mM丙烯的产生在对丙烯的测定(b)阳性对照中被观察到并在测定(d)和(e)中观察到具有IPA+LinD共转化的候选物的明显产生(图15)。在仅含有TB培养基的对照反应中没有观察到丙烯的含量。
序列表
前面详细的描述仅给予清楚的理解，而不应理解为不必要的限制，因为从这些修饰，本领域技术人员将更加明了。
虽然本公开内容已联系其特定实施方案进行了描述，应该理解它能够被进一步修饰，一般来说，在遵循了本公开内容的原理并包括从本公开内容的此类偏离后，本申请意欲覆盖本公开内容的任何变化、使用，或修改，它们都落入本公开内容所属领域已知或惯常实践范围内，并且可适用于前面所述和在所附权利要求书范围内遵循的基本特征。
本公开内容，包括本文引用的各个和每个专利、专利申请，和出版物的权利要求书、数值和/或附图，通过参考以其整体并入本文。
本公开内容的编号实施方案
本公开内容涵盖的具体主题列于以下编号的实施方案中。
1. 一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
2. 权利要求1的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
3. 权利要求2的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
4. 权利要求1-3的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
5. 权利要求1-4的任一项的重组微生物，其中内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
6. 一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
7. 权利要求6的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的丙酮转化为异丙醇。
8. 权利要求7的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
9. 权利要求6-8的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
10. 权利要求6-9的任一项的重组微生物，其中内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
11. 一种能够从外源性D-木糖和葡萄糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子;
(b) 至少一个编码D-木糖异构酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖，和
其中微生物还表达以下的一种或多种：
(c) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)或(b)的D-木酮糖转化为D-核酮糖;
(d) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(e) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶或甲基乙二醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
12. 权利要求11的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(i)的丙酮转化为异丙醇。
13. 权利要求12的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
14. 权利要求11-13的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；和
(b) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
15. 权利要求11-14的任一项的重组微生物，其中微生物是真菌。
16. 一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(d) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(e) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙醇醛转化为MEG；
(f) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(g) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(h) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
17. 权利要求16的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的丙酮转化为异丙醇。
18. 权利要求17的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
19. 权利要求16-18的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
20. 一种能够从外源性D-木糖共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
(b) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(c) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
21. 权利要求20的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
22. 权利要求21的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
23. 权利要求20-22的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
24. 权利要求1或权利要求11的重组微生物，其中D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属或红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。
25. 权利要求24的重组微生物，其中微生物选自菊苣假单胞菌、假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌或类球红细菌。
26. 权利要求24的重组微生物，其中一个或多个核酸分子是dte和/或C1KKR1。
27. 权利要求1或权利要求11的重组微生物，其中D-核酮糖激酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
28. 权利要求27的重组微生物，其中一个或多个核酸分子是fucK。
29. 权利要求1或权利要求11的重组微生物，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
30. 权利要求29的重组微生物，其中一个或多个核酸分子是fucA。
31. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中乙醇醛还原酶由一个或多个从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。
32. 权利要求31的重组微生物，其中一个或多个核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA(yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA和/或GRE2。
33. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中硫解酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、大肠杆菌和海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。
34. 权利要求33的重组微生物，其中微生物选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌和除烃海杆菌。
35. 权利要求33的重组微生物，其中一个或多个核酸分子是thlA和/或atoB。
36. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶由一个或多个从选自梭菌属或大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
37. 权利要求36的重组微生物，其中微生物是丙酮丁醇梭菌。
38. 权利要求36的重组微生物，其中一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子是atoA和/或atoD。
39. 权利要求36的重组微生物，其中一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子是ctfA和/或ctfB。
40. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。
41. 权利要求40的重组微生物，其中微生物选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌。
42. 权利要求40的重组微生物，其中一个或多个编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc。
43. 权利要求2、7、12、17或21的任一项的重组微生物，其中仲醇脱氢酶由一个或多个从选自伯克霍尔德氏菌属、产碱杆菌属、梭菌属、嗜热厌氧杆菌属、植物单胞菌属、红球菌属、甲烷杆菌属、产甲烷菌属、内阿米巴属、毛滴虫属，和三毛滴虫属的微生物获得的核酸分子编码。
44. 权利要求43的重组微生物，其中微生物选自伯克霍尔德氏菌AIU 652、真养产碱杆菌、拉氏梭菌、拜氏梭菌、布氏嗜热厌氧杆菌、嗜热厌氧乙醇杆菌(嗜热硫化氢梭菌)、赤红球菌、发光甲烷杆菌、产甲烷古菌泥游产甲烷菌、寄生原生动物溶组织内阿米巴、寄生原生动物阴道毛滴虫和人类寄生虫阴道滴虫。
45. 权利要求43的重组微生物，其中一个或多个编码仲醇脱氢酶的核酸分子是adhB或EhAdh1。
46. 权利要求6的重组微生物，其中D-木酮糖1-激酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。
47. 权利要求46的重组微生物，其中一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子是己酮糖激酶C (khk-C)。
48. 权利要求6的重组微生物，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。
49. 权利要求48的重组微生物，其中一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是醛缩酶B (ALDOB)。
50. 权利要求11的重组微生物，其中木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自肉座菌属、酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、曲霉属、脉孢菌属，和隐球酵母属的微生物获得的核酸分子编码。
51. 权利要求50的重组微生物，其中微生物选自红褐肉座菌、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母、栎柱毕赤酵母、休哈塔假丝酵母、纤细假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、粗糙脉孢菌和嗜乳酸隐球酵母。
52. 权利要求50的重组微生物，其中一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1或GRE3。
53. 权利要求11的重组微生物，其中木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属，和沙雷菌属的微生物获得的核酸分子编码。
54. 权利要求53的重组微生物，其中微生物选自树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌。
55. 权利要求53的重组微生物，其中一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2或xdh1。
56. 权利要求11的重组微生物，其中木糖异构酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
57. 权利要求56的重组微生物，其中一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA。
58. 权利要求16或权利要求20的重组微生物，其中木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。
59. 权利要求58的重组微生物，其中微生物选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprodundi和里氏木霉。
60. 权利要求58的重组微生物，其中一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh或xyd1。
61. 权利要求16的重组微生物，其中木糖内酯酶由一个或多个从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码。
62. 权利要求61的重组微生物，其中微生物选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌。
63. 权利要求61的重组微生物，其中一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC。
64. 权利要求16或权利要求20的重组微生物，其中木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、富盐菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
65. 权利要求64的重组微生物，其中微生物选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌、大肠杆菌和硫磺矿硫叶菌。
66. 权利要求64的重组微生物，其中一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG、yagF和xad。
67. 权利要求16或权利要求20的重组微生物，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
68. 权利要求67的重组微生物，其中微生物是大肠杆菌。
69. 权利要求67的重组微生物，其中一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和yagE。
70. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产而丙酮通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。
71. 权利要求2、7、12、17或21的任一项的重组微生物，其中MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而IPA通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。
72. 权利要求3、8、13、18或22的任一项的重组微生物，其中MEG通过在C-2支路中转化乙醇醛来生产，而丙烯通过在C-3支路中转化DHAP或丙酮酸来生产。
73. 权利要求70-72的任一项的重组微生物，其中在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分用作在C-2支路中减少等量物的来源。
74. 权利要求70-72的任一项的重组微生物，其中在C-3支路中生产的过量NADH的至少一部分被用来生产ATP。
75. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中共生产的MEG和丙酮包含大于90%的无碳固定的热力学最大产量潜力的产量潜力。
76. 权利要求2、7、12、17或21的任一项的重组微生物，其中共生产的MEG和IPA包含大于90%的无碳固定的热力学最大产量潜力的产量潜力。
77. 权利要求3、8、13、18或22的任一项的重组微生物，其中共生产的MEG和丙烯包含大于90%的无碳固定的热力学最大产量潜力的产量潜力。
78. 权利要求1、6、11、16或20的任一项的重组微生物，其中尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙酮。
79. 权利要求2、7、12、17或21的任一项的重组微生物，其中尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和IPA。
80. 权利要求3、8、13、18或22的任一项的重组微生物，其中尽量减少过量的生物质形成并最大限度地生产MEG和丙烯。
81. 一种使用前述权利要求任一项的重组微生物生产MEG和三碳化合物的方法，其中该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物，直至产生MEG和三碳化合物。
82. 一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1P醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
83. 权利要求82的方法，其中该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
84. 权利要求83的方法，其中该方法还包括将至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
85. 权利要求82-84的任一项的方法，其中方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
86. 权利要求82-85的任一项的方法，其中内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
87. 一种产生重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
88. 权利要求87的方法，其中方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化得自(f)的丙酮转化为异丙醇。
89. 权利要求88的方法，其中方法还包括将至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
90. 权利要求87-89的任一项的方法，其中该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
91. 权利要求87-89的任一项的方法，其中内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
92. 一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖和葡萄糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子；
(b) 至少一个编码D-木糖异构酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖，和
其中该方法还包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(c) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)或(b)的D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(d) 至少一个编码D-核酮糖激酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(e) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶或甲基乙二醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
93. 权利要求92的方法，其中该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化得自(i)的丙酮转化为异丙醇。
94. 权利要求93的方法，其中该方法还包括将至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
95. 权利要求92-94的任一项的方法，其中该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；和
(b) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖。
96. 权利要求92-95的任一项的方法，其中微生物是真菌。
97. 一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(d) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(e) 至少一个编码乙醇醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙醇醛转化为MEG；
(f) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(g) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(h) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
98. 权利要求97的方法，其中该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化得自(h)的丙酮转化为异丙醇。
99. 权利要求98的方法，其中该方法还包括将至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
100. 权利要求97-99的任一项的方法，其中该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
101. 一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括将以下的一种或多种引入重组微生物和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
(b) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(c) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共产生的。
102. 权利要求101的方法，其中该方法还包括将至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化得自(g)的丙酮转化为异丙醇。
103. 权利要求102的方法，其中该方法还包括将至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子引入重组微生物，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
104. 权利要求101-103的任一项的方法，其中该方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖;
(b) 编码乙醇醛脱氢酶A的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶A的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸。
105. 权利要求82或权利要求92的方法，其中D-塔格糖3-差向异构酶由一个或多个从选自假单胞菌属、中慢生根瘤菌属或红细菌属的微生物获得的核酸分子编码。
106. 权利要求105的方法，其中微生物选自菊苣假单胞菌假单胞菌菌种ST-24、百脉根中生根瘤菌或类球红细菌。
107. 权利要求105的方法，其中一个或多个核酸分子是dte和/或C1KKR1。
108. 权利要求82或权利要求92的方法，其中D-核酮糖激酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
109. 权利要求108的方法，其中一个或多个核酸分子是fucK。
110. 权利要求82或权利要求92的方法，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
111. 权利要求110的方法，其中一个或多个核酸分子是fucA。
112. 权利要求82、87、92、97或101的任一项的方法，其中乙醇醛还原酶由一个或多个从选自大肠杆菌或酿酒酵母的微生物获得的核酸分子编码。
113. 权利要求112的方法，其中一个或多个核酸分子选自fucO、yqhD、dkgA(yqhE)、dkgB (yafB)、yeaE、yghZ、gldA和/或GRE2。
114. 权利要求82、87、92、97或101的任一项的方法，其中硫解酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属或海杆菌属的微生物获得的核酸分子编码。
115. 权利要求114的方法，其中微生物选自丙酮丁醇梭菌、热解糖梭菌、蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌和除烃海杆菌。
116. 权利要求114的方法，其中一个或多个核酸分子是thlA和/或atoB。
117. 权利要求82、87、92、97或101的任一项的方法，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶由一个或多个从选自梭菌属或大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
118. 权利要求117的方法，其中微生物是丙酮丁醇梭菌。
119. 权利要求117的方法，其中一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶的核酸分子是atoA和/或atoD。
120. 权利要求117的方法，其中一个或多个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA水解酶的核酸分子是ctfA和/或ctfB。
121. 权利要求82、87、92、97或101的任一项的方法，其中乙酰乙酸脱羧酶由一个或多个从选自梭菌属、芽孢杆菌属、色素杆菌属和假单胞菌属的微生物获得的核酸分子编码。
122. 权利要求121的方法，其中微生物选自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纤维梭菌、多粘芽孢杆菌、青紫色素杆菌和恶臭假单胞菌。
123. 权利要求121的方法，其中一个或多个编码乙酰乙酸脱羧酶的核酸分子是adc。
124. 权利要求83、88、93、98或102的任一项的方法，其中仲醇脱氢酶由一个或多个从选自伯克霍尔德氏菌属、产碱杆菌属、梭菌属、嗜热厌氧杆菌属、植物单胞菌属、红球菌属、甲烷杆菌属、产甲烷菌属、内阿米巴属、毛滴虫属，和三毛滴虫属的微生物获得的核酸分子编码。
125. 权利要求124的方法，其中微生物选自伯克霍尔德氏菌AIU 652、真养产碱杆菌、拉氏梭菌、拜氏梭菌、布氏嗜热厌氧杆菌、嗜热厌氧乙醇杆菌(嗜热硫化氢梭菌)、赤红球菌、发光甲烷杆菌、产甲烷古菌泥游产甲烷菌、寄生原生动物溶组织内阿米巴、寄生原生动物阴道毛滴虫和人类寄生虫阴道滴虫。
126. 权利要求124的方法，其中一个或多个编码仲醇脱氢酶的核酸分子是adhB或EhAdh1。
127. 权利要求87的方法，其中D-木酮糖1-激酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。
128. 权利要求127的方法，其中一个或多个编码D-木酮糖1-激酶的核酸分子是己酮糖激酶C (khk-C)。
129. 权利要求87的方法，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶由一个或多个从智人获得的核酸分子编码。
130. 权利要求129的方法，其中一个或多个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的核酸分子是醛缩酶B (ALDOB)。
131. 权利要求92的方法，其中木糖还原酶或醛糖还原酶由一个或多个从选自肉座菌属、酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、曲霉属、脉孢菌属和隐球酵母属的微生物获得的核酸分子编码。
132. 权利要求131的方法，其中微生物选自红褐肉座菌、酿酒酵母、嗜鞣管囊酵母、树干毕赤酵母、栎柱毕赤酵母、休哈塔假丝酵母、纤细假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、粗糙脉孢菌和嗜乳酸隐球酵母。
133. 权利要求131的方法，其中一个或多个编码木糖还原酶或醛糖还原酶的核酸分子是xyl1或GRE3。
134. 权利要求92的方法，其中木糖醇脱氢酶由一个或多个从选自毕赤酵母属、酵母属、葡萄糖杆菌属、产半乳糖假丝酵母属、脉孢菌属，和沙雷菌属的微生物获得的核酸分子编码。
135. 权利要求134的方法，其中微生物选自树干毕赤酵母、酿酒酵母、氧化葡萄糖杆菌、代谢木糖产半乳糖假丝酵母、粗糙脉孢菌和粘质沙雷氏菌。
136. 权利要求134的方法，其中一个或多个编码木糖醇脱氢酶的核酸分子是xyl2或xdh1。
137. 权利要求92的方法，其中木糖异构酶由一个或多个得自大肠杆菌的核酸分子编码。
138. 权利要求137的方法，其中一个或多个编码木糖异构酶的核酸分子是xylA。
139. 权利要求97或权利要求101的方法，其中木糖脱氢酶由一个或多个从选自柄杆菌属、盐盒菌属(Haloarcula sp.)、富盐菌属(Haloferax sp.)、嗜盐菌属(Halorubrum sp.)和木霉属的微生物获得的核酸分子编码。
140. 权利要求139的方法，其中微生物选自新月柄杆菌、死海盐盒菌、沃氏富盐菌、Halorubrum lacusprodundi和里氏木霉。
141. 权利要求139的方法，其中一个或多个编码木糖脱氢酶的核酸分子选自xylB、xdh或xyd1。
142. 权利要求97的方法，其中木糖内酯酶由一个或多个从选自柄杆菌属和富盐菌属的微生物获得的核酸分子编码。
143. 权利要求142的方法，其中微生物选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌和吉氏富盐菌。
144. 权利要求142的方法，其中一个或多个编码木糖内酯酶的核酸分子是xylC。
145. 权利要求97或权利要求101的方法，其中木糖酸脱水酶由一个或多个从选自柄杆菌属、富盐菌属、硫叶菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
146. 权利要求145的方法，其中微生物选自新月柄杆菌、沃氏富盐菌、大肠杆菌和硫磺矿硫叶菌。
147. 权利要求145的方法，其中一个或多个编码木糖酸脱水酶的核酸分子选自xylD、yjhG、yagF和xad。
148. 权利要求97或权利要求101的方法，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶由一个或多个从选自假单胞菌属和大肠杆菌的微生物获得的核酸分子编码。
149. 权利要求148的方法，其中微生物是大肠杆菌。
150. 权利要求148的方法，其中一个或多个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的核酸分子选自yjhH和yagE。
151. 一种共生产一乙二醇(MEG)和三碳化合物的重组微生物。
152. 权利要求151的方法，其中三碳化合物是丙酮。
153. 权利要求151的方法，其中三碳化合物是异丙醇。
154. 权利要求151的方法，其中三碳化合物是丙烯。

Claims (91)

1.一种共生产一乙二醇(MEG)和三碳化合物的重组微生物。
2.权利要求1的重组微生物，其中三碳化合物是丙酮。
3.权利要求1的重组微生物，其中三碳化合物是异丙醇。
4.权利要求1的重组微生物，其中三碳化合物是丙烯。
5.一种能够从包含外源性D-木糖的原料共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
6.权利要求5的重组微生物，其中所述原料包含外源性葡萄糖。
7.一种能够从包含外源性D-木糖的原料共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
8.权利要求5或7的重组微生物，其中内源性或外源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
9.权利要求5或7的重组微生物，其中重组微生物还表达至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子。
10.一种能够从包含外源性D-木糖的原料共生产一乙二醇(MEG)和丙酮的重组微生物，其中重组微生物表达以下从(a)至(c)的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
其中重组微生物还表达以下从(d)至(i)的一种或多种：
(d) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)或(c)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(e) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
11.权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码仲醇脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化丙酮转化为异丙醇。
12.权利要求11的重组微生物，其中重组微生物还包含至少一个编码脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
13.权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中重组微生物还包含一个或多个选自以下的修饰：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸；
(d) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖；和
(e) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
14. 权利要求5的重组微生物，其中D-塔格糖3-差向异构酶是菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii) DTE和/或类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides) C1KKR1。
15. 权利要求5的重组微生物，其中D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。
16. 权利要求5的重组微生物，其中D-核酮糖激酶是大肠杆菌(E. coli) fucK。
17. 权利要求5的重组微生物，其中D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。
18.权利要求5的重组微生物，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶是大肠杆菌fucA。
19. 权利要求5的重组微生物，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。
20. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙醇醛还原酶是大肠杆菌gldA、酿酒酵母(S. cerevisiae) GRE2、酿酒酵母GRE3、大肠杆菌yqhD、大肠杆菌ydjg、大肠杆菌fucO、大肠杆菌yafB (dkgB)、大肠杆菌yqhE (dkgA)、大肠杆菌yeaE和/或大肠杆菌yghZ。
21. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙醇醛还原酶包含选自SEQ IDNOs: 13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。
22. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中硫解酶是丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) thlA、大肠杆菌atoB，和/或酿酒酵母ERG10。
23. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中硫解酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和39的氨基酸序列。
24.权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶是大肠杆菌atoA、大肠杆菌atoD、丙酮丁醇梭菌ctfA和/或丙酮丁醇梭菌ctfB。
25. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97和99的氨基酸序列。
26. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙酰乙酸脱羧酶是丙酮丁醇梭菌adc和/或拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii) adc。
27. 权利要求5、7或10的任一项的重组微生物，其中乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ IDNOs: 49和52的氨基酸序列。
28. 权利要求7的重组微生物，其中D-木酮糖1-激酶是智人(Homo sapiens) khk-C。
29. 权利要求7的重组微生物，其中D-木酮糖1-激酶包含在SEQ ID NO: 55中提出的氨基酸序列。
30.权利要求7的重组微生物，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶是智人aldoB。
31. 权利要求7的重组微生物，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。
32.权利要求8的重组微生物，其中木糖异构酶由从大肠杆菌xylA获得的一个或多个核酸分子编码。
33. 权利要求8的重组微生物，其中木糖异构酶包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。
34. 权利要求9的重组微生物，其中木糖还原酶或醛糖还原酶是Scheffersomyces stipitis xyl1和/或酿酒酵母GRE3。
35. 权利要求9的重组微生物，其中木糖还原酶或醛糖还原酶包含选自SEQ ID NOs:84和87的氨基酸序列。
36. 权利要求9的重组微生物，其中木糖醇脱氢酶是Scheffersomyces stipites xyl2和/或里氏木霉(Trichoderma reesei) xdh1。
37. 权利要求9的重组微生物，其中木糖醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。
38. 权利要求10的重组微生物，其中木糖脱氢酶是新月柄杆菌(Caulobacter crescentus) xylB、沃氏富盐菌(Haloferax volcanii) xdh1和/或里氏木霉xyd1。
39. 权利要求10的重组微生物，其中木糖脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。
40.权利要求10的重组微生物，其中木糖内酯酶是新月柄杆菌xylC。
41. 权利要求10的重组微生物，其中木糖内酯酶包含SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。
42.权利要求10的重组微生物，其中木糖酸脱水酶是新月柄杆菌xylD、大肠杆菌yjhG和/或大肠杆菌yagF。
43. 权利要求10的重组微生物，其中木糖酸脱水酶包含选自SEQ ID NOs: 69、72和75的氨基酸序列。
44.权利要求10的重组微生物，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶是大肠杆菌yjhH和/或大肠杆菌yagE。
45. 权利要求10的重组微生物，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶包含选自SEQ IDNOs: 78和81的氨基酸序列。
46. 权利要求11的重组微生物，其中仲醇脱氢酶是拜氏梭菌adh和/或Clostridium carboxidivorans adh。
47. 权利要求11的重组微生物，其中仲醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。
48.一种使用前述权利要求的任一项的重组微生物生产MEG和三碳化合物的方法，其中该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物，直至产生MEG和三碳化合物。
49.一种生产重组微生物的方法，所述微生物从包含外源性D-木糖的原料生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括在重组微生物中引入和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-塔格糖3-差向异构酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-核酮糖；
(b) 至少一个编码D-核酮糖激酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-核酮糖转化为D-核酮糖-1-磷酸；
(c) 至少一个编码D-核酮糖-1P醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的D-核酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(d) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(c)的乙醇醛转化为MEG；
(e) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(f) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(g) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(f)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
50.权利要求49的方法，其中所述原料包含外源性葡萄糖。
51.一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括在重组微生物中引入和/或过度表达以下的一种或多种：
(a) 至少一个编码D-木酮糖1-激酶的外源性核酸分子，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-1-磷酸；
(b) 至少一个编码D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木酮糖-1-磷酸转化为乙醇醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)；
(c) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)的乙醇醛转化为MEG；
(d) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(e) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(f) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体DHAP通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
52.权利要求49或51的方法，其中内源性D-木糖异构酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
53.权利要求49或51的方法，其中该方法还包括在重组微生物中引入和/或过度表达至少一个编码催化D-木糖转化为木糖醇的木糖还原酶或醛糖还原酶的外源性核酸分子和至少一个编码催化木糖醇转化为D-木酮糖的木糖醇脱氢酶的外源性核酸分子。
54.一种生产重组微生物的方法，所述微生物从外源性D-木糖生产或积聚MEG和丙酮，该方法包括在重组微生物中引入和/或过度表达以下从(a)至(c)的一种或多种：
(a) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖内酯；
(b) 至少一个编码木糖内酯酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(a)的D-木糖内酯转化为D-木糖酸；
(c) 至少一个编码木糖脱氢酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化D-木糖转化为D-木糖酸；
其中该方法还包括在重组微生物中引入和/或过度表达以下从(d)至(i)的一种或多种：
(d) 至少一个编码木糖酸脱水酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(b)或(c)的D-木糖酸转化为2-酮-3-脱氧-木糖酸；
(e) 至少一个编码2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(d)的2-酮-3-脱氧-木糖酸转化为乙醇醛和丙酮酸；
(f) 至少一个编码乙醇醛还原酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(e)的乙醇醛转化为MEG；
(g) 至少一个编码硫解酶的外源性核酸分子，所述酶催化乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA；
(h) 至少一个编码乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶的内源性或外源性核酸分子，所述酶催化得自(g)的乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸；和/或
(i) 至少一个编码乙酰乙酸脱羧酶的外源性核酸分子，所述酶催化得自(h)的乙酰乙酸转化为丙酮；
其中产生的中间体丙酮酸通过微生物中的内源性糖酵解途径转化为乙酰-CoA，且其中MEG和丙酮是共同产生的。
55.权利要求49、51或54的方法，其中所述方法还包括在重组微生物中引入和/或过度表达至少一个编码仲醇脱氢酶的外源性核酸分子，所述酶催化丙酮转化为异丙醇。
56.权利要求55的方法，其中所述方法还包括在重组微生物中引入和/或过度表达至少一个编码脱水酶的外源性核酸分子，所述酶催化异丙醇转化为丙烯。
57.权利要求49、51或54的方法，其中所述方法还包括将一个或多个选自以下的修饰引入重组微生物：
(a) 编码D-木酮糖-5-激酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸；
(b) 编码乙醇醛脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化乙醇醛转化为乙醇酸；和
(c) 编码乳酸脱氢酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化丙酮酸转化为乳酸；
(d) 编码碱性磷酸酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖；和
(e) 编码D-木糖异构酶的基因中缺失、插入或功能丢失突变，所述酶催化D-木糖转化为D-木酮糖。
58.权利要求49的方法，其中D-塔格糖3-差向异构酶是菊苣假单胞菌DTE和/或类球红细菌C1KKR1。
59. 权利要求49的方法，其中D-塔格糖3-差向异构酶包含选自SEQ ID NOs: 3和5的氨基酸序列。
60.权利要求49的方法，其中D-核酮糖激酶是大肠杆菌fucK。
61. 权利要求49的方法，其中D-核酮糖激酶包含在SEQ ID NO: 8中提出的氨基酸序列。
62.权利要求49的方法，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶是大肠杆菌fucA。
63. 权利要求49的方法，其中D-核酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 11中提出的氨基酸序列。
64. 权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙醇醛还原酶是大肠杆菌gldA、酿酒酵母GRE2、酿酒酵母GRE3、大肠杆菌yqhD、大肠杆菌ydjg、大肠杆菌fucO、大肠杆菌yafB(dkgB)、大肠杆菌yqhE (dkgA)、大肠杆菌yeaE和/或大肠杆菌yghZ。
65. 权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙醇醛还原酶包含选自SEQ ID NOs:13、15、17、20、23、25、28、30和32的氨基酸序列。
66.权利要求49、51或54的任一项的方法，其中硫解酶是丙酮丁醇梭菌thlA、大肠杆菌atoB，和/或酿酒酵母ERG10。
67. 权利要求49、51或54的任一项的方法，其中硫解酶包含选自SEQ ID NOs: 35、37和39的氨基酸序列。
68.权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶是大肠杆菌atoA、大肠杆菌atoD、丙酮丁醇梭菌ctfA和/或丙酮丁醇梭菌ctfB。
69. 权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙酸:乙酰乙酰-CoA转移酶或水解酶包含选自SEQ ID NOs: 43、46、97和99的氨基酸序列。
70.权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙酰乙酸脱羧酶是丙酮丁醇梭菌adc和/或拜氏梭菌adc。
71. 权利要求49、51或54的任一项的方法，其中乙酰乙酸脱羧酶包含选自SEQ ID NOs:49和52的氨基酸序列。
72.权利要求51的方法，其中D-木酮糖1-激酶是智人khk-C。
73. 权利要求51的方法，其中D-木酮糖1-激酶包含在SEQ ID NO: 55中提出的氨基酸序列。
74.权利要求51的方法，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶是智人aldoB。
75. 权利要求51的方法，其中D-木酮糖-1-磷酸醛缩酶包含在SEQ ID NO: 58中提出的氨基酸序列。
76.权利要求52的方法，其中木糖异构酶由从大肠杆菌xylA获得的一个或多个核酸分子编码。
77. 权利要求52的方法，其中木糖异构酶包含在SEQ ID NO: 95中提出的氨基酸序列。
78. 权利要求53的方法，其中木糖还原酶或醛糖还原酶是Scheffersomyces stipites xyl1和/或酿酒酵母GRE3。
79. 权利要求53的方法，其中木糖还原酶或醛糖还原酶包含选自SEQ ID NOs: 84和87的氨基酸序列。
80. 权利要求53的方法，其中木糖醇脱氢酶是Scheffersomyces stipites xyl2和/或里氏木霉xdh1。
81. 权利要求53的方法，其中木糖醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 90和92的氨基酸序列。
82.权利要求54的方法，其中木糖脱氢酶是新月柄杆菌xylB、沃氏富盐菌xdh1和/或里氏木霉xyd1。
83. 权利要求54的方法，其中木糖脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 61、63和65的氨基酸序列。
84.权利要求54的方法，其中木糖内酯酶是新月柄杆菌xylC。
85. 权利要求54的方法，其中木糖内酯酶包含在SEQ ID NO: 67中提出的氨基酸序列。
86.权利要求54的方法，其中木糖酸脱水酶是新月柄杆菌xylD、大肠杆菌yjhG和/或大肠杆菌yagF。
87. 权利要求54的方法，其中木糖酸脱水酶包含选自SEQ ID NOs: 69、72和75的氨基酸序列。
88.权利要求54的方法，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶是大肠杆菌yjhH和/或大肠杆菌yagE。
89. 权利要求54的方法，其中2-酮-3-脱氧-D-戊糖酸醛缩酶包含选自SEQ ID NOs: 78和81的氨基酸序列。
90. 权利要求55的方法，其中仲醇脱氢酶是拜氏梭菌adh和/或Clostridium carboxidivorans adh。
91. 权利要求55的方法，其中仲醇脱氢酶包含选自SEQ ID NOs: 106和108的氨基酸序列。
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