CN103429751A - 经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌 - Google Patents

Abstract

本发明的一个方面涉及生物质材料的木糖部分向燃料和化学品的工业生物转化。本发明的另一个方面涉及生物质材料的木聚糖部分向燃料和化学品的工业生物转化。在一个实施方案中，本发明涉及细菌热纤梭菌，一种在联合生物加工配置中具有作为生物催化剂的巨大潜能的高纤维素分解性生物体。在一些实施方案中，本发明是赋予热纤梭菌发酵木糖的能力的遗传修饰和利用该修饰产生的菌株。在一些实施方案中，遗传修饰由来自解糖热厌氧杆菌(T.saccharolyticum)的操纵子中包含的两个基因组成。所述基因表达具有木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的蛋白质。在其它实施方案中，本发明涉及能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞。

Description

经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌

发明背景

发明领域

能量转换、利用和获取是我们时代的许多巨大挑战(包括与持续性、环境质量、安全性和贫困相关的挑战)的起因。需要新兴技术的新型应用来应对这些挑战。生物技术，最强大的新兴技术之一，可产生重要的新能量转换方法。生物质及其衍生物是用于能量至对人类有用的形式的生物转化的来源。

生物质是来自活的或最近活的生物体的生物材料例如木材、废物、(氢)气体和醇燃料。生物质是基于碳、氢和氧的。还可发现氮和少量其它原子，包括碱金属、碱土金属和重金属。金属通常见于功能性分子例如卟啉中，其包括包含镁的叶绿素。植物特别地将水和二氧化碳组合成糖构建块。所需的能量通过基于叶绿素的光合作用从光产生。平均起来，0.1至1%的可获得的光被作为化学能贮存在植物中。糖构建块是陆生植物、木质素、半纤维素和纤维素中发现的所有主要部分的起始点。生物质被公认为用于产生可再生燃料和化学品的原料的有前景的来源。

阻碍从生物质原料广泛产生能量的主要障碍是普遍缺乏用于克服此类材料至有用产物的转化的低成本技术。生物质包含可被转化成乙醇或其它产物例如乙酸盐、丙酮酸盐、乳酸和乙酸的碳水化合物部分(例如，纤维素和半纤维素)以及戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)。为了转化这些部分，最终必须将纤维素、半纤维素、木糖和阿拉伯糖转化或水解成单糖；历史上已证明水解是有问题的。

生物介导的过程有希望用于能量转化。涉及酶促或微生物水解的生物质处理方案通常包括4个生物介导的转化；(1)糖解酶(纤维素酶或半纤维素酶)的产生；(2)存在于预处理的生物质中的碳水化合物组分至糖的水解；(3)己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和(4)戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)的发酵。这4个转化以单个步骤在称为联合生物加工(CBP)的过程配置中进行，所述过程配置与其它集成度不太高的配置区别在于其不包括用于纤维酶和/或半纤维素酶产生的专用处理步骤。

CBP提供了比特征在于专门的纤维素酶生产的方法成本更低且效率更高的潜力。有益之处部分来源于避免了与生产纤维素酶相关的资金成本、底料和其它原材料和设施。此外，使用CBP，数个因素支持实现较高速率的水解，因此减小了反应器的体积和资金投入，包括酶-微生物协同作用，以及使用噬热生物体和/或复合的纤维素酶系统。此外，纤维素粘附性的分解纤维素的微生物可能相对于非粘附性的微生物（例如污染物）成功地竞争纤维素水解的产物，这会增加基于微生物纤维素利用的工业方法的稳定性。通过以下两个策略在开发能够进行CBP的微生物方面取得了进展：对天然存在的分解纤维素的微生物进行工程化改造以改善与产物相关的特征，例如产率和效价；以及对表现出高产物产率和效价的不分解纤维素的生物体进行工程化改造以表达异源纤维素酶和半纤维素酶系统以能够利用纤维素和半纤维素。

满足乙醇产生的需要的一个方法是转化生物质、例如材料例如农业废物、玉米壳、玉米芯、纤维素物质等中发现的糖以产生乙醇或其它产物。在生物质转化中，将微生物用作生物催化剂来将纤维素物质转化成可使用的终产物例如乙醇。大规模工业应用中的高效生物质转化需要能够耐受高浓度的糖和乙醇并且能够同时发酵超过一种糖的微生物。

木糖极其丰富地存在于生物质原料中。其可构成多至40%的木质纤维素材料(Ladisch等人,Biotechnol Bioeng,25:1-2,1983)。通过发酵，木糖可被转化成可用作液体燃料或化学原料的乙醇。通过酶促发酵或作为发酵的副产品，木糖还可被转化成木糖醇，其是有前景的具有减少龋齿的性质的天然甜味剂。木糖醇还可被糖尿病患者使用。

尽管许多细菌具有发酵简单己糖、戊糖的能力，但木糖和阿拉伯糖是其中在生物质中最难代谢的糖。一些细菌可将戊糖发酵成乙醇和其它副产品，具有改善的从戊糖产生乙醇的能力的细菌已经进行了遗传工程化。参见，例如，Xiao等人,Appl.Environ.Microbiol.,77:7886-7895,2011。然而，此类细菌对低pH和高浓度的乙醇敏感，它们在发酵中的用途与副产品形成相关，并且产生的乙醇水平仍然太低。由于至少这些原因，在大规模乙醇生产中使用此类细菌在经济上是不可行的。因此，本领域需要能够将戊糖发酵成乙醇的纤维素分解性生物体。

生物体例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)天然地能够通过木糖异构酶途径利用木糖。在木糖异构酶途径中，木糖异构酶(XI)将木糖转化成木酮糖。随后木酮糖被利用ATP的激酶木酮糖激酶(XK)磷酸化成木酮糖-5-磷酸，其为戊糖磷酸途径的中间产物。因此，产生木糖发酵纤维素分解性生物体(所述生物体可用作CBP生物体)的一个方法是把将木糖发酵成乙醇所需的来自木糖异构酶途径的基因克隆进入纤维素分解性生物体，以便纤维素分解性生物体可产生代谢木糖所需要的酶。

热纤梭菌(Clostridium-thermocellum)是有很大潜能在联合生物加工配置中作为生物催化剂的高度分解纤维素的生物体。热纤梭菌作为CBP生物体的经济潜力受到其不能发酵木糖的能力的限制。目前不存在已知的能够发酵木糖的热纤梭菌菌株(无论是工程化的还是未工程化的)。因此，能够发酵木糖的热纤梭菌菌株将具有作为CBP生物体的极大工业适用性。

虽然已对热纤梭菌的基因组完全测序，并且已将许多热纤梭菌基因克隆进入其它细菌，但仍未建立用于将外来基因引入该微生物的可靠方法。此类方法的缺乏已成为对目的在于增加基础理解和应用能力的热纤梭菌的研究的重大障碍。由于使得热纤梭菌能够发酵木糖所需的多个且极其可能的基因组修饰,以及转化该生物体的困难和不可预测性，目前不能产生适用于从生物质工业化产生乙醇和其它产物的热纤梭菌菌株。因此，迄今为止，不存在已鉴定的具有发酵木糖的能力的热纤梭菌菌株。因此，在本领域需要开发一个或多个能够发酵木糖的热纤梭菌菌株，所述热纤梭菌菌株可在联合生物加工配置中用作生物催化剂。

本发明第一次提供了包含赋予热纤梭菌发酵木糖的能力的遗传修饰的热纤梭菌菌株。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含异源多核苷酸的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸具有与SEQ ID NO:1-2的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列；或SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及发酵液，其包含：(a)能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和(b)培养基，其中所述培养基包含木糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。

在另一个方面，本发明涉及包含能够发酵木糖的本发明的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞的共培养物。

在另一个实施方案中，本发明涉及发酵木糖的方法，包括温育反应混合物，所述反应混合物包含：(a)生物质，其中生物质包含木糖，和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木糖。

在另一个实施方案中，本发明涉及产生一种或多种木糖发酵产物的方法，包括：温育反应混合物，所述反应混合物包含：(a)生物质，其中生物质包含木糖，和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木糖以产生一种或多种木糖发酵产物。

在另一个实施方案中，本发明涉及能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞。

本发明的另一个方面涉及发酵液，所述发酵液包含：(a)能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和(b)培养基，其中培养基包含木聚糖，并且其中培养基能够支持所述宿主细胞的生长。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含能够发酵木聚糖的本发明的重组热纤梭菌和至少一种其它宿主细胞的共培养物。

在另一个实施方案中，本发明涉及发酵木聚糖的方法，包括：温育反应混合物，所述反应混合物包含包括：(a)生物质，其中生物质包含木聚糖；和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木聚糖。

在另一个实施方案中，本发明涉及产生一种或多种木聚糖发酵产物的方法，包括：温育反应混合物，所述反应混合物包含：(a)生物质，其中所述生物质包含木聚糖；和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木聚糖以产生一种或多种木聚糖发酵产物。

附图概述

图1描述了木糖异构酶/木酮糖激酶在LDH基因座上的整合。

图2描述了质粒pMU1793，其被设计和构建来将XI/XK操纵子整合在包含次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因的缺失的热纤梭菌的染色体中。

图3描述了XI/XK操纵子在乳酸脱氢酶(LDH)基因座上的无缝整合的诊断性PCR确认的图像。野生型对照基因组DNA用于产生在泳道14中观察到的扩增子，观察到预期的2.9KB条带。整合的XI/XK操纵子应当以4966bp(在泳道2-5和8中观察到的大小)运行。

图4描述了在利用热纤梭菌菌株T2(Δldh::XI/XK)接种的培养基中在156小时时的木糖浓度的终点分析。

图5描述了T2菌株的终产物HPLC分析。

图6显示在48小时时在T3培养物中观察到的孢子形成的证据。

图7显示了T3培养物在72小时时的显微镜检查。

图8描述了T6培养物在10和20g/l木糖上的生长的终点分析。

图9显示了T6培养物在10g/l微晶粉末纤维素(avicel)上的生长。

图10显示了M2236培养物在包含木糖作为唯一糖源的CM3培养基上的生长。木糖被M2236菌株消耗并且M2236菌株产生乙醇，而M1570菌株不能将大量木糖转化成乙醇。

发明详述

本说明书公开了一个或多个整合本发明的特征的实施方案。公开的实施方案仅举例说明本发明。本发明的范围不限于公开的实施方案。本发明由其所附带的权利要求界定。

在下列说明中，为了解释目的，显示了具体的数字、材料和配置以提供完全彻底地理解本发明。然而，对于本领域技术人员来说很显然的是可在这些具体的详细内容不存在的情况下实施本发明。在一些情况下，可省略或简化公知的特征以使本发明明了。

描述的实施方案和以及本说明书中提及的"一个实施方案"、"一个示例性实施方案"等，表示描述的实施方案可包括具体的特征、结构或特性，但每一个实施方案可以不一定包括该具体的特征、结构或特性。此外，此类短语不一定是指同一个实施方案。此外，当结合实施方案描述具体特征、结构或特性时，应理解，结合其它实施方案(无论是否明确地描述过)实现这样的特征、结构或特性在本领域技术人员员的知识范围内。

本文中“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”的描述可指单数项或复数项。应理解，在本文中无论何处利用词语“包含”描述实施方案，也提供了以“由……组成的”和/或“基本上由……组成的”的术语描述的另外的类似实施方案。

定义

术语"异源的"，当用于指多核苷酸、基因、多肽或酶时，是指通常不是在宿主生物体中发现的多核苷酸、基因、多肽或酶。"异源的"还包括从来源生物体取出并且随后以与对应的天然基因不同的形式(例如，不在该生物体基因组的其天然位置中)引入来源生物体的天然编码区或其部分。可通过例如基因转移将异源多核苷酸或基因引入宿主生物体。异源基因可包括作为嵌合基因(包含被引入天然宿主的非天然调控区)的一部分的天然编码区。外来基因可包含插入非天然生物体或嵌合基因的天然基因。异源多核苷酸、基因、多肽或酶可来源于任何来源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成的多核苷酸片段。如本文中所用，术语"异源的"是指来源于除内源来源外的来源的载体、质粒或宿主细胞的元件。因此，例如，异源序列可以是来源于来自相同宿主，来自宿主细胞的不同菌株或来自不同分类群(例如，不同界、门、纲、目、科、属或种或这些分类之一内的任何亚组)的生物体的不同基因或质粒的序列。术语"异源的"在本文中也与术语"外源的"同义地使用。

"启动子"意指帮助特定基因转录的DNA的区域。启动子通常位于它们调控的基因附近，在相同的链上和上游(朝向有义链的5'区域)。术语"启动子"或"替代启动子"意欲包括可转录地控制其在天然状态不转录地控制的目标基因的多核苷酸。在某些实施方案中，替代启动子的转录控制导致目标基因表达的增加。在某些实施方案中，将替代启动子置于目标基因的5'。替代启动子可用于替代天然启动子或除了天然启动子外还可使用替代启动子。替代启动子相对于其中使用其的宿主细胞是内源的，或其可以是被引入宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如相对于其中使用其的宿主细胞是外源的。

如本文中所用，术语"终止子"或"转录终止子"是在基因组DNA上标记基因或操纵子转录结束的遗传序列的部分。

如本文中所用，术语"操纵子"是指包含一簇在单个调控信号或启动子的控制之下基因的基因组材料的功能单位。所述基因被一起转录成mRNA链，并且在细胞质中被一起翻译或经历反式剪接以产生单独翻译的单顺反子mRNA，即各自编码单个基因产物的mRNA的几条链。这样的结果是操纵子中包含的基因可一起表达或根本不表达。最初操纵子被认为仅存在于原核生物中，但自1990年代早期在真核生物中发现首个操纵子以来，已出现更多的证据表明它们比先前假定的更常见。操纵子主要存在于原核生物中，但也存在于一些真核生物中，包括黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫。

"嗜热"或"耐热"细菌是其最适生长温度高于约45℃的细菌。嗜热细菌为生物技术方法提供了许多有利方面，所述生物技术方法中有许多在高温下运行得更快和更高效。更高的温育温度增加扩散速率和非气态目标化合物的可溶性，并且倾向于阻止非嗜热微生物污染。在高温下进行的细胞培养还消除或极大减少了冷却成本。

"嗜温"意指在约20-45℃的温度下旺盛生长的生物体。

术语"基因"或"多核苷酸"或"多核苷酸序列"意欲包括核酸分子，例如多核苷酸，其包括编码多肽的开放阅读框，并且还可包括非编码调控序列和内含子。此外，该术语意欲包括映射至功能基因座的一个或多个基因。此外，该术语意欲包括用于选择目的的特定基因。基因对于宿主细胞可以是内源的或可被重组地引入宿主细胞，例如作为游离地维持的质粒或稳定地整合进入基因组的质粒(或其片段)。除了质粒形式以外，基因可以例如以线性DNA的形式存在。在某些实施方案中，基因或多核苷酸参与乙酸盐至不带电荷的溶剂、包括但不限于丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或乙醇的生物转化的至少一个步骤。因此，该术语意欲包括编码多肽例如醋酸盐激酶(ACK)、磷酸乙酰转移酶(PTA)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、醛脱氢酶(ADH)和/或醇脱氢酶(ADH)、乙酰-CoA转移酶(ACS)、乙醛脱氢酶、乙醛/醇脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)、乙酰-CoA合成酶、硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、D-木糖途径中的酶例如木糖异构酶和木酮糖激酶，L-阿拉伯糖途径中的酶例如L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸4差向异构酶的任何基因。术语基因还意欲包括所有拷贝的特定基因，例如细胞中编码特定基因产物的所有DNA序列。

术语"表达"意欲包括基因至少在mRNA产生的水平上的表达。

术语"表达产物"意欲包括表达的基因的所得的产物，例如多肽。

术语"纤维素分解活性"意欲包括水解寡己糖或多己糖的糖苷键的能力。纤维素分解活性还可包括使纤维素和半纤维素解聚合或脱支的能力。

术语"木聚糖分解活性"意欲包括水解寡戊糖和多戊糖中的糖苷键的能力。

如本文中所用，术语"乳酸脱氢酶"或"LDH"意欲包括能够将丙酮酸盐转化成乳酸盐的酶。应理解，LDH还可催化羟基丁酸盐的氧化。LDH包括对应于酶委员会编号1.1.1.27的那些酶。

如本文中所用，术语"醇脱氢酶"或"ADH"意欲包括能够将乙醛转化成醇例如乙醇的酶。ADH还包括能够将丙酮转化成异丙醇的酶。ADH包括对应于酶委员会编号1.1.1.1的那些酶。

如本文中所用，术语"磷酸乙酰转移酶"或"PTA"意欲包括能够通过从5-磷酸核糖基1-焦磷酸转移5-磷酸核糖基，将次黄嘌呤转化成肌苷一磷酸和将鸟嘌呤转化成鸟苷一磷酸的酶。该酶在通过嘌呤补救途径产生嘌呤核苷酸中起着中心作用。HPT包括对应于酶委员会编号2.4.2.8的那些酶。

如本文中所用，术语"次黄嘌呤转磷酸核糖基酶"或"HPT"意欲包括能够将乙酰-磷酸转化成乙酰-CoA的酶。PTA包括对应于酶委员会编号2.3.1.8的那些酶。

"木糖代谢酶"可以是参与木糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶蛋白。参见例如Gu等人,BMCGenomics,11:255-268,2010。

"木酮糖激酶"(XK)意指催化化学反应：ATP+D-木酮糖ADP+D-木酮糖5-磷酸的酶。因此，该酶的两种底物为ATP和D-木酮糖，而其两种产物为ADP和D-木酮糖5-磷酸。该酶属于转移酶的家族，特别是以醇基团作为受体的转移含磷基团的那些转移酶(磷酸转移酶)。该酶种类的系统名为ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。常用的其它名称包括木酮糖激酶(磷酸化)和D-木酮糖激酶。该酶参与戊糖和葡糖醛酸的互变。XK包括对应于酶委员会编号2.7.1.17的那些酶。

"木糖异构酶"(XI)意指催化化学反应：D-木糖

D-木酮糖的酶。该酶属于异构酶的家族，特别是使醛糖与酮糖互变的那些分子内氧化还原酶。该酶种类的系统名为D-木糖醛糖酮糖异构酶。常用的其它名称包括D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶和D-木糖酮醇-异构酶。该酶参与戊糖与葡糖醛酸互变以及果糖和甘露糖代谢。该酶在工业上用于在高果糖玉米糖浆的制造中将葡萄糖转化成果糖。其有时被称为"葡萄糖异构酶"。XI包括对应于酶委员会编号5.3.1.5的那些酶。

如本文中所用，术语"木糖转运蛋白质"或"木糖转运蛋白"意欲包括参与木糖横穿生物膜的运动(从而促进宿主生物体利用木糖)的膜蛋白。参见，例如Gu等人,BMC Genomics,11:255-268,2010。如本文中所用，术语"木糖转运蛋白基因"意欲包括编码木糖转运蛋白质的基因。

本发明的某些实施方案在微生物内提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“灭活”或“缺失”，基因或特定多核苷酸序列的“灭活”或“缺失”可被理解为包括“遗传修饰”或“转化”，以便所述微生物的所得菌株可被理解为“遗传修饰的”或“转化的”。在某些实施方案中，微生物的菌株可来源于细菌、真菌或酵母。

本发明的某些实施方案在嗜热或嗜温微生物内提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“插入”(例如，添加、整合、引入或导入)，基因或特定多核苷酸序列的插入可被理解为包括“遗传修饰”或“转化”，以便所述嗜热或嗜温微生物的所得菌株可被理解为“遗传修饰的”或“转化的”。在某些实施方案中，微生物的菌株可来源于细菌、真菌或酵母。

术语"CBP生物体"意欲包括本发明的微生物，例如具有适合于CBP的性质的微生物。

术语"发酵(fermenting)"和"发酵(fermentation)"意欲包括籍以从碳水化合物产生乙醇(特别地作为发酵的产物)的酶促过程(例如，细胞或无细胞，例如，裂解物或纯化的多肽混合物)。

如本文中所用，术语发酵的"不期望的终产物"意欲包括除乙醇和二氧化碳外的发酵产物。不期望的终产物可包括但不限于醋酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐和甘油醛。

如本文中所用，"选择"或"选择法"或"选择方案"是指用于对给定的菌株施加压力(或攻击)以适合新的条件的方法。选择法有利于原始菌株的零星发生的“变体”，其中变体经历一些遗传或表观遗传改变，所述改变赋予适合于实施方案的培养条件的生长有利方面。

在本发明的一个方面，插入基因或特定多核苷酸序列以激活它们编码的活性例如酶的表达。在某些实施方案中，可将编码乙醇的代谢产生中的酶，例如代谢戊糖和/或己糖的酶的基因添加至嗜温或嗜热生物体。在本发明的某些实施方案中，酶可赋予代谢戊糖的能力以及参与例如D-木糖途径和/或L-阿拉伯糖途径。在本发明的某些实施方案中，可将编码将醋酸盐转化成不带电荷的溶剂(包括但不限于丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或乙醇)的酶的基因添加至嗜温或嗜热生物体。

在本发明的一个方面，可部分、大体上或完全地缺失、沉默、灭活或下调基因或特定多核苷酸序列，以使它们编码的活性例如酶的表达失活。缺失提供了最大稳定性，因为不存在使突变回复以恢复功能的机会。或者，可通过插入破坏基因的功能和/或表达的核酸序列(例如，P1转导或本领域已知的其它方法)，部分、大体上或完全地缺失、沉默、灭活或下调基因。术语"消除(eliminate)"、"消除(elimination)"和"敲除"可与术语"缺失"、"部分缺失"、"大体上缺失"或"完全缺失"互换使用。在某些实施方案中，可通过定点同源重组以敲除特定基因来工程化目标微生物的菌株。在其它实施方案中，可将RNAi或反义DNA(asDNA)用于部分、大体上或完全沉默、灭活或下调特定目标基因。

在某些实施方案中，本文中描述的被靶向缺失或灭活的基因对于微生物的天然菌株可以是内源的，从而可被理解为称为"天然基因"或"内源基因"。如果生物体未曾被遗传工程化或未曾另外地通过人工以有意改变生物体的基因和/或表型构造的方式进行操作，则该生物体以“天然状态”存在。例如，野生型生物体可被认为以天然状态存在。在其它实施方案中，被靶向缺失或灭活的基因对于生物体可以是非天然的。

类似地，本文中描述的本发明的酶对于微生物的天然菌株可以是内源的，从而可被理解为称为“天然的”或“内源的”。

如本文中所用，术语"表达"是指来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可指mRNA至多肽的翻译。

术语"木质纤维素"是指由木质素和纤维素组成的材料。

"糖解酶"可以是参与碳水化合物降解、代谢和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解和淀粉分解辅助酶(accessory enzyme)、菊糖酶、左聚糖酶和戊糖水解酶。

"戊糖利用酶"可以是参与戊糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖异构酶、核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和/或木糖转醛醇酶。

"纤维素分解酶"可以是参与纤维素降解、代谢和/或水解的任何酶。术语"纤维素酶"是指主要由真菌、细菌和原生动物产生的、催化纤维素的溶纤作用(即水解)的一类酶。然而，还存在由其它类型的生物体例如植物和动物产生的纤维素酶。已知几种在结构和机理上不同的不同类型的纤维素酶。该组酶的EC编号是EC3.2.1.4。存在基于催化的反应的类型的一般类型的纤维素酶：内切纤维素酶断裂内部键以破坏纤维素的晶体结构并且暴露单个纤维素多糖链；外切纤维素酶从由内切纤维素酶产生的暴露的链的末端切割2-4个单位，从而产生四糖或二糖例如纤维二糖。存在两个主要类型的外切纤维素酶(或纤维二糖水解酶，缩写为CBH)–从纤维素的还原末端向前作用的一个类型，和从纤维素的非还原末端向前作用的一个类型；纤维二糖酶或β-葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖；通过自由基反应使纤维素解聚的氧化纤维素酶，例如纤维二糖脱氢酶(受体)；使用磷酸盐而非水使纤维素解聚的纤维素磷酸化酶。在最熟悉的纤维素酶活性的案例中，酶复合物将纤维素断裂成β-葡萄糖。"纤维素酶"可以是参与纤维素降解、代谢和/或水解的任何酶，包括内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、内切木聚糖酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、swollenin、葡糖醛酸基酯酶、棒曲霉素和阿魏酸酯酶蛋白。

"淀粉分解酶"可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶。术语"淀粉酶"是指将淀粉断裂成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中其开始降解的化学过程。包含大量淀粉但少量糖的食物例如大米和马铃薯，当咀嚼它们时味道有点甜，因为淀粉酶将其淀粉的一些淀粉在嘴里转化成糖。胰脏也使淀粉酶(α-淀粉酶)将饮食淀粉水解成二糖和三糖，所述二糖和三糖被其它酶转化成葡萄糖以给身体提供能量。植物和一些细菌也产生淀粉酶。所有淀粉酶都是糖苷水解酶并且作用于α-1,4-糖苷键。一些淀粉酶，例如γ-淀粉酶(葡糖淀粉酶)，还作用于α-1,6-糖苷键。淀粉酶包括α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC3.2.1.3)。淀粉酶可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶。α-淀粉酶是钙金属酶，在钙不存在的情况下不能发挥作用。通过在沿着淀粉链的随机位置上作用，α-淀粉酶分解长链碳水化合物，最终从直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖或从支链淀粉产生麦芽糖、葡萄糖和“极限糊精”。因为其可作用于底物的任何位置，因此α-淀粉酶倾向于比β-淀粉酶更快速地作用。在动物中，其是主要的消化酶并且其最适pH为约6.7-7.0。淀粉酶的另一种形式β-淀粉酶也可由细菌、真菌和植物合成。通过从非还原末端作用，β-淀粉酶催化第二α-1,4糖甘键水解，一次切除两个葡萄糖单位(麦芽糖)。许多微生物产生降解细胞外淀粉的淀粉酶。除了切割直链淀粉和支链淀粉的非还原末端上的最后一个α(1-4)糖苷键，从而产生葡萄糖外，γ-淀粉酶还切割α(1-6)糖苷键。另一种淀粉分解酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶是一个特殊类型的葡聚糖酶，是一种淀粉分解性的外酶，其降解支链淀粉。支链淀粉被当作通过α-1,6-糖苷链连接的麦芽三糖单位的链。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)也被称为支链淀粉-6-葡聚糖水解酶(脱支酶)。另一种淀粉分解酶，异支链淀粉酶，将支链淀粉水解成异葡糖基麦芽糖(6-α-麦芽糖基葡萄糖)。异支链淀粉酶(EC3.2.1.57)也被称为支链淀粉4-葡聚糖水解酶。"淀粉酶"可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。

术语"木聚糖"包括众多种在植物细胞壁和一些藻类中发现的高度复杂的多糖。木聚糖是从木糖的单位产生的多糖。

术语"木聚糖酶"是给予一类将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖，从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的酶的名称。这样，其在以植物资源旺盛生长的微生物中起着主要作用(哺乳动物，相反地，不产生木聚糖酶)。此外，木聚糖酶存在于真菌中以将植物物质降解成可用的营养物。木聚糖酶包括对应于酶委员会编号3.2.1.8的那些酶。"木糖代谢酶"可以是参与木糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和木糖转醛醇酶蛋白。

"戊糖水解酶"可以是参与戊糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖异构酶、核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和/或木糖转醛醇酶。

生物质

生物质可包括本领域已知的或本文中描述的任何类型的生物质。术语"木质纤维材料"、"木质纤维底物"和"纤维质生物质"意指包含纤维素、半纤维素、木质素或其组合的任何类型的生物质，例如但不限于木质生物质、牧草、草本能源作物、非木质植物生物质、农业废物和/或农业残渣、林业残渣和/或林业废物、造纸污泥和/或废纸污泥、废水处理污泥、城市固体废物、来自湿法及干法破碎玉米乙醇植物的玉米纤维和糖加工残渣。术语"半纤维素质"、"半纤维素质部分"和"半纤维素质级分"意指木质纤维材料的非木质素、非纤维素组成部分，例如但不限于半纤维素(即，包含木糖葡聚糖、木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖)、果胶(例如，同型聚半乳糖醛酸、鼠李聚糖半乳糖醛酸I和II及木糖聚半乳糖醛酸)和蛋白聚糖(例如，阿拉伯半乳聚糖-蛋白、伸展蛋白和富含脯氨酸的蛋白质)。生物质还包括淀粉以及己糖和戊糖。

在非限定性实例中，木质纤维材料可包括但不限于木质生物质，例如再循环木浆纤维、锯屑、硬木材、软木材及其组合；草，例如柳枝稷、大米草、黑麦草、利甘草、芒草或其组合；糖加工残渣例如但不限于甘蔗渣；农业废物例如但不限于稻草、稻壳、大麦秸、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸,油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳和玉米纤维；秸秆例如但不限于大豆秸杆,玉米秸秆；肉质植物(succulent),例如但不限于龙舌兰；和林业废物例如但不限于再循环木浆纤维、锯屑、硬木材(例如，白杨木、橡木、枫木、桦木、柳树)、软木材或其任意组合。木质纤维材料可包含一种纤维；或者，木质纤维材料可包含源自不同木质纤维材料的纤维的混合物。其它木质纤维材料是农业废物例如谷类秸秆，包括小麦秸杆、大麦秸杆、油菜秸杆和燕麦秸杆；玉米纤维；秸杆例如玉米秸杆和大豆秸杆；草，例如柳枝稷、草芦、大米草和细叶芒；或其组合。

纸污泥也是用于乳酸盐或醋酸盐产生的活性的原料。纸污泥是从打浆和造纸产生的固体残渣，并且通常从初沉池中的处理废水中取出。

联合生物加工

联合生物加工(CBP)是用于纤维质生物质的加工策略，包括将如下4个生物介导的事件合并入单个过程步骤中：酶产生、水解、己糖发酵和戊糖发酵。实施此策略需要开发利用纤维素、半纤维素和其它生物质组分例如己糖和戊糖，同时还以足够高的产率和浓度产生目标产物的微生物。CBP的可行性得到动力学和生物能量分析支持。参见van Walsum和Lynd(1998)Biotech.Bioeng.58:316。

醋酸

在两个通过磷酸转乙酰酶(PTA)和醋酸盐激酶(ACK)催化的反应步骤中从乙酰-CoA产生醋酸盐。由这些酶介导的反应示于下面：

PTA反应：乙酰-CoA+磷酸=CoA+乙酰磷酸(EC2.3.1.8)

ACK反应：ADP+乙酰磷酸=ATP+醋酸(EC2.7.2.1)

热纤梭菌在标准发酵条件下产生醋酸并且具有良好注释的编码PTA和ACK的基因。

丙酮酸

丙酮酸是重要的代谢中间化合物。例如，在好氧条件下，丙酮酸可被氧化成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，随后乙酰辅酶A进入三羧酸循环(TCA)，该循环继而产生合成的前体、CO₂和还原的辅因子。随后通过一系列酶促步骤将氢等同物提供给氧来氧化辅因子，从而导致水和ATP的形成。该能量生成过程称为氧化磷酸化。

木糖代谢

木糖是可被多种生物体代谢为有用的产物的五碳单糖。存在两个主要的木糖代谢途径，每一个途径在它们利用的特征酶中是独特的。一个途径称为"木糖还原酶-木糖醇脱氢酶"或XR-XDH途径。木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)是用于该木糖降解法中的两个主要的酶。由XYL1基因编码的XR负责木糖至木糖醇的还原，并且得到辅因子NADH或NADPH的帮助。木糖醇随后被通过XYL2基因表达的XDH氧化成木酮糖，并且专门地利用辅因子NAD⁺来实现。由于该途径中需要的不同辅因子以及它们可得以使用的程度的原因，不平衡可导致木糖醇副产品的过度生产以及期望的产物的产生不足。已在实验室中测试了XR和XDH酶水平的不同表达以试图最优化木糖代谢途径的效率。

木糖代谢的另一途径称为"木糖异构酶"(XI)途径。酶XI负责将木糖直接转化成木酮糖，并且不通过木糖醇中间产物进行。两个途径都产生木酮糖，虽然使用的酶不同。在木酮糖产生后，XR-XDH和XI途径都通过木酮糖激酶(XK)(基因XKS1编码)继续进行，以进一步将木酮糖修饰成木酮糖-5-P，随后其进入戊糖磷酸途径以进行进一步分解代谢。

除了上述两个主要途径外，木糖还可通过两个氧化途径(称为Weimberg途径和Dahms途径)来进行分解代谢，所述两个途径在原核微生物中是共有的。Weimberg途径是这样的氧化途径：其中D-木糖被D-木糖脱氢酶氧化成D-xylono-内酯，随后内酯酶将所述内酯水解成D-木糖酸。木糖酸脱水酶分离出水分子，从而产生2-酮3-脱氧-木糖酸。第二脱水酶形成2-酮戊二酸半醛，其随后被氧化成2-酮戊二酸。Dahms途径的起始与Weimberg途径一样，但2-酮-3脱氧-木糖酸被醛缩酶分裂成丙酮酸和乙醇醛。

关于在木糖代谢过程中通过戊糖磷酸途径的流动的研究已显示限制该步骤的速度可有益于至乙醇的发酵的效率。可提高乙醇产量的对该流动的修饰包括a)降低磷酸葡糖异构酶活性，b)使GND1基因缺失，和c)使ZWF1基因缺失(Jeppsson等人,Appl Environ Microbiol.68:1604-1609,2002)。由于戊糖磷酸途径在代谢过程中产生额外的NADPH，因此限制该步骤将帮助修正NAD(P)H与NAD⁺辅因子之间的已明显的不平衡并且减少木糖醇副产物。比较两个木糖代谢途径的另一个实验显示XI途径最能够代谢木糖以产生最大的乙醇产率，而XR-XDH途径达到快得多的乙醇生产速率(Karhumaa等人,MicrobCell Fact.2007Feb5;6:5)。也参见国际公布号WO2006/009434，将其通过引用整体并入本文。

宿主细胞

用于本发明的宿主细胞包括任何原核或真核细胞；例如，选自细菌、藻类和酵母细胞的微生物。其中适合用于本发明的宿主细胞是微生物例如，梭菌属(Clostridium)的微生物。

在一些实施方案中，宿主细胞是微生物。在一个实施方案中，微生物是耐热或嗜热微生物。

在一个实施方案中，宿主细胞可包含抗生素标记或可以不包含抗生素标记。在另一个实施方案中，宿主细胞是选自梭菌属的细菌和具有与梭菌属种类的特征相似的特征的其它细菌。

纤维素分解和木聚糖分解性微生物

在文献中报导为具有纤维素分解性和木聚糖分解性的几种微生物已通过多种方式表征，包括它们在微晶纤维素和桦木木聚糖以及多种其它糖上的生长的能力。此外，还可通过其它方式、包括但不限于它们使纤维素和半纤维素解聚和脱支的能力，来表征此类微生物。在一个实施方案中，目标纤维素分解性生物体是热纤梭菌。

表1概述了热纤梭菌在

上的生长

某些微生物，包括例如热纤梭菌，不能代谢戊糖例如木糖或阿拉伯糖，但能够代谢己糖。木糖和阿拉伯糖都是生物质中丰富存在的糖，木糖在软和硬木材中占据约16-20%，L-阿拉伯糖在玉米纤维中占据约25%。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了具有代谢戊糖例如木糖和阿拉伯糖的能力的遗传修饰的纤维素分解性微生物，从而增强它们在生物质至醋酸或乳酸或乙醇工业中作为用于发酵的生物催化剂的用途。因此，在一个实施方案中，宿主细胞是热纤梭菌菌株。在另一个实施方案中，宿主细胞是选自DSM1313、DSM1237和DSM2360的热纤梭菌菌株。

在一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃或42℃的温度生长。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃或约43℃或约44℃或约45℃或约50℃的温度将木糖发酵成乙醇和其它产物。

在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度生长。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度将木糖发酵成乙醇或其它产物。

本发明提供了表达允许微生物发酵木糖的酶的纤维素分解性微生物。当将编码参与乳酸或醋酸的代谢途径(包括例如，木糖、阿拉伯糖和/或木聚糖)的酶的基因引入缺乏此类基因的一个或多个的微生物例如热纤梭菌时，可选择转化的菌株以在木糖上生长或在阿拉伯糖上生长或在木聚糖上生长。热纤梭菌可缺乏木糖至乙醇途径和/或阿拉伯糖利用途径中的一种或多种已知基因或酶。图2描述了在热纤梭菌的木糖至乙醇途径中丢失的两个至关重要的酶。热纤梭菌不能代谢木酮糖，这可反映木糖异构酶(在图2中称为“XI”或5.3.1.5)(其将木糖转化成木酮糖)和木酮糖激酶(在图2中也被称为“XK”或2.7.1.1)(其将木酮糖转化成木酮糖-5-磷酸)的基因不存在。

在一个实施方案中，利用编码本发明的木糖代谢酶(该酶在下文中进行了更详细地描述)的多核苷酸遗传工程化(转导或转化或转染)了宿主细胞。在另一个实施方案中，利用编码本发明木聚糖酶的多核苷酸遗传工程化了宿主细胞。可将编码木糖代谢酶或木聚糖酶的多核苷酸(在载体上)引入宿主细胞，所述载体可以例如是包含编码异源木糖代谢酶的序列的克隆性载体或表达载体。宿主细胞可以以整合的拷贝或质粒拷贝包含本发明的多核苷酸。

在某些方面，本发明涉及包含下文中描述的多核苷酸构建体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可表达一种或多种表达木糖代谢酶的异源多肽。在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞可表达一种或多种表达木聚糖酶的异源多肽。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码异源木糖代谢酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的组合。在其它实施方案中，宿主细胞包含编码异源木聚糖酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸的组合。宿主细胞可以例如包含多个拷贝的相同核酸序列，例如，以增加表达水平，或宿主细胞可包含独特的多核苷酸的组合。在其它实施方案中，宿主细胞包含编码异源木糖代谢酶或其片段、变体或衍生物的单个多核苷酸。在其它实施方案中，宿主细胞包含编码异源木聚糖酶或其片段、变体或衍生物的单个多核苷酸。特别地，可将此类表达单个异源木糖代谢酶或异源木聚糖酶的宿主细胞与本发明的其它宿主细胞(所述宿主细胞包含编码至少一种其它异源木糖代谢酶或异源木聚糖酶或其片段、变体或衍生物的多核苷酸)共培养。如本文中所用，"共培养"是指将两个不同菌株或种的宿主细胞一起生长在相同的容器中。

编码异源木糖代谢酶或异源木聚糖酶的多核苷酸至宿主细胞内的引入可通过本领域已知的方法来进行。编码异源木糖代谢酶或异源木聚糖酶的多核苷酸至例如酵母宿主细胞的引入可以通过醋酸锂转化、原生质球转化或利用电穿孔进行的转化来实现，如Current Protocolsin Molecular Biology,13.7.1-13.7.10中描述的。构建体至其它宿主细胞中的引入可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔来实现。(Davis,L.,等人,Basic Methods in Molecular Biology,(1986))。然而，如上文中所述，梭菌属的几个种类，包括热纤梭菌，难以用异源多核苷酸转染。热纤梭菌的转化的实例公开于国际公布号WO2010/056450中。

在某些实施方案中，木糖代谢基因供体可包括赋予宿主细胞代谢己糖和戊糖的能力的微生物。在其它实施方案中，木聚糖酶基因供体可包括赋予宿主细胞代谢木聚糖的能力的微生物。在一些实施方案中，木糖代谢基因供体是解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum)、解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)、热解纤维素果汁杆菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)、植物发酵梭菌(C.phytofermentans)和粪堆梭菌(C.stercorarium)。

在一个实施方案中，木糖代谢基因的供体是细菌种类，包括但不限于解纤维素梭菌、解糖热厌氧杆菌、粪堆梭菌、热解纤维素果汁杆菌和植物发酵梭菌。这类菌株是木糖的良好利用者。在一个实施方案中，解糖热厌氧杆菌是木糖代谢基因的供体。

因此，在本发明的一个方面，可以例如通过引入一个或多个从生物质来源的戊糖(例如，D-木糖或L-阿拉伯糖代谢)产生乙醇所需的酶的基因，修饰一个或多个微生物菌株以最优化糖利用能力。可将启动子，包括热纤梭菌的天然启动子(例如磷酸丙糖异构酶(TPI)、GAPDH和LDH的启动子)用于表达这类基因。一旦已克隆基因，可在表达之前对密码子进行最优化。随后可将包含例如天然启动子、一个或多个木聚糖分解基因和选择标记的盒用于转化热纤梭菌并就在包含木糖作为唯一碳水化合物来源的培养基上进行木糖生长进行选择。

根据某些其它实施方案，本发明的宿主细胞涉及遗传修饰的梭菌属生物体，其中使基因或特定的多核苷酸序列部分、大体上或完全缺失、沉默、失活或下调，所述基因或多核苷酸序列编码酶，所述酶赋予所述生物体产生有机酸作为发酵产物的能力，从而增强生物体产生乳酸或醋酸作为主要发酵产物的能力。

赋予生物体产生醋酸作为发酵产物的能力的基因可编码醋酸盐激酶(ACK)、磷酸乙酰转移酶(PTA)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和/或醛或醇脱氢酶(ADH)的表达。编码ACK、PTA、PFL和/或ADH的表达的基因或特定多核苷酸序列的缺失或抑制减少或消除了总体糖酵解途径中的反应流程，其中丙酮酸被转化成乙酰CoA，乙酰CoA被转化成醋酸或乙醇。在某些实施方案中，可单独地或一致地在宿主细胞中破坏上述基因，或使上述基因部分或完全缺失。在一个实施方案中，从宿主细胞缺失PTA基因。在一个方面，PTA基因的缺失导致宿主细胞将木糖发酵成作为主要终产物的乙醇。在一个方面，PTA基因的缺失导致宿主细胞将木糖发酵成作为终产物的乙醇，实际上消除了一种或多种不期望的终产物(例如，除乙醇或二氧化碳外的终产物)。在另一个方面，PTA基因的缺失导致宿主细胞将木糖发酵成作为终产物的乙醇并且不产生不期望的终产物。在另一个实施方案中，不产生或不大量产生乳酸或乙酸或两者。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞还包含一个或多个内源基因的缺失。在一个方面，一个或多个内源基因的缺失有助于本发明的一个或多个核苷酸至宿主细胞的基因组中的整合的遗传选择。在某些实施方案中，待缺失的一个或多个内源基因可选自但不限于次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APT)基因。在一个实施方案中，待缺失的内源基因是次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因。HPT是转移酶，其催化次黄嘌呤至肌苷的转化。该酶在通过嘌呤补救途径产生嘌呤核苷酸中起着中心作用。

可检查上述转化的宿主细胞或细胞培养物的木糖代谢酶(包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶蛋白)的蛋白质含量。可通过方法从重组酵母细胞培养物回收和纯化此类蛋白质，所述方法包括例如原生质球制备和裂解、使用玻璃珠进行的细胞破坏以及使用液氮进行的细胞破坏。其它蛋白质纯化法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、凝胶过滤和外源凝集素层析。在完成成熟蛋白质的构型中，必要时可使用蛋白质重折叠步骤。最后，可使用高效液相色谱(HPLC)来进行终纯化步骤。

蛋白质分析方法包括方法例如常规Lowry法或按照BioRad制造商的方案进行的蛋白质测定法。通过使用此类方法，可估计木糖代谢酶的蛋白质含量。此外，为了精确地测量蛋白质浓度，可表达具有标记例如His-标记或HA-标记的异源木糖代谢酶，并通过使用例如抗所述标记的抗体通过标准方法或标准镍树脂纯化技术或类似方法进行纯化。

还可分析上述转化的宿主细胞或细胞培养物的木糖的水解、特定类型的木糖代谢酶活性(例如，通过测量个别木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶活性)或总的木糖代谢酶活性。还可分析转化的宿主细胞或细胞培养物的木聚糖的水解、特定类型的木聚糖酶的酶活性或总的木聚糖酶活性。

本发明的一个方面涉及一种或多种帮助降解木糖以及产生产物例如乙醇的木糖代谢酶的高效产生。本发明的另一个方面涉及一种或多种帮助降解木聚糖以及产生产物例如乙醇的木聚糖酶的高效产生。

在另外的实施方案中，测试转化的宿主细胞或细胞培养物的乙醇产量。可利用本领域技术人员已知的技术，例如利用标准HPLC折射率法来测定乙醇产量。

异源木糖代谢酶

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞表达一种或多种异源糖解酶。在一个方面，宿主细胞表达一种或多种异源纤维素分解酶。在另一个方面，宿主细胞表达一种或多种异源淀粉分解酶。在一个方面，宿主细胞表达一种或多种异源戊糖水解酶。在另一个方面，宿主细胞表达一种或多种异源木聚糖酶。

复杂生物质原料包含不同量的淀粉、木质纤维材料以及己糖和戊糖。因此，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞被构建来以不同水平表达不同的糖解酶。在一个实施方案中，宿主细胞以相较于一种或多种淀粉分解酶和一种或多种戊糖水解酶更高的水平表达一种或多种纤维素分解酶。在另一个实施方案中，宿主细胞以相较于一种或多种纤维素分解酶和一种或多种戊糖水解酶更高的水平表达一种或多种淀粉分解酶。在另一个实施方案中，宿主细胞以相较于一种或多种纤维素分解酶和一种或多种淀粉分解酶更高的水平表达一种或多种戊糖水解酶。

在一个实施方案中，宿主细胞中表达的一种或多种异源戊糖水解酶包括一种或多种木糖代谢酶。根据本发明的一个方面，宿主细胞中异源木糖代谢酶的表达可有利地用于从生物质来源的木糖部分产生产物例如乙醇。可异源表达来自多种来源的木糖代谢酶以例如成功地增加乙醇产生的效率。木糖代谢酶可来自真菌、细菌、植物、原生生物或白蚁来源。在一些实施方案中，木糖代谢酶是解糖热厌氧杆菌、灰腐质霉(H.grisea)、T.aurantiacus、埃默森篮状菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、C.lacteus、台湾乳白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、澳大利亚矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、N.walkeri、扣囊复膜袍酵母(S.fibuligera)、C.luckowense、黄胸散白蚁(R.speratus)、嗜热放线菌(Thermobfidafusca)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridumjosui)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)、多糖降解菌(Saccharophagus degradans)、厌氧真菌(Piromyces equii)、Neocallimastix patricarum或拟南芥木糖代谢酶。在一个实施方案中，木糖代谢酶是解糖热厌氧杆菌木糖代谢酶。在一些实施方案中，本发明的木糖代谢酶是本领域已知的任何木糖代谢酶。在具体的实施方案中，本发明的木糖代谢酶是本文中产生的表7中公开的酶。在一些实施方案中，木糖代谢酶由与SEQ ID NO:1-2之任一项具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%的同源性的核酸序列编码。在一些实施方案中，木糖代谢酶具有与SEQ IDNO:3-4之任一项具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或100%的同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的木糖代谢酶是适合在适当的宿主细胞中表达的任何木糖代谢酶。

在本发明的一些实施方案中，可在相同的宿主细胞中共表达来自单种生物体的多种木糖代谢酶。在本发明的一些实施方案中，可在相同的宿主细胞中共表达来自不同生物体的多个木糖代谢酶。具体地，可在相同宿主细胞中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物体的木糖代谢酶。类似地，本发明可包括微生物菌株的共培养物，其中微生物菌株表达不同的木糖代谢酶。共培养物可包括表达来自相同生物体或来自不同生物体的异源木糖代谢酶的微生物菌株。共培养物可包括表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种微生物的木糖代谢酶的微生物菌株。

在本发明的一些实施方案中，在相同宿主细胞中共表达来自单种生物体的多种木聚糖酶。在本发明的一些实施方案中，在相同宿主细胞中共表达来自不同生物体的多个木聚糖酶。具体地，可在相同宿主细胞中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物体的木聚糖酶。类似地，本发明可包括微生物菌株的共培养物，其中微生物菌株表达不同的木聚糖酶。共培养物可包括表达来自相同生物体或来自不同生物体的异源木聚糖酶的微生物菌株。共培养物可包括表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种微生物的木聚糖酶的微生物菌株。在一个实施方案中，木聚糖酶可以是微生物来源的木聚糖酶，例如真菌来源(例如，木霉属(Trichoderma)、Meripilus、腐质霉属、曲霉菌属、镰刀菌属)的木聚糖酶或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))的木聚糖酶。在另一个实施方案中，木聚糖酶来源于丝状真菌，例如来源于曲霉菌属的菌株例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)；或腐质霉属的菌株例如柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)。在某些实施方案中，木聚糖酶可以是GH10或GH11的内切-1,4-β-木聚糖酶或内切-1,4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S,Denmark的SHEARZYME.TM.和BIOFEED WHEAT.TM.。下面的表2和3列出了在解糖热厌氧杆菌中表达的木聚糖酶以及木聚糖酶的来源。

表2.解糖热厌氧杆菌中表达的木聚糖酶基因的DNA序列

表3.解糖热厌氧杆菌中表达的木聚糖酶的蛋白质序列

在本发明的一些实施方案中，在相同宿主细胞中表达来自单种生物体的多种木糖转运蛋白。在本发明的一些实施方案中，在相同宿主细胞中共表达来自不同生物体的多种木糖转运蛋白。具体地，在相同宿主细胞中共表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种生物体的木糖转运蛋白。类似地，本发明可包括微生物菌株的共培养物，其中微生物菌株表达不同的木糖转运蛋白。共培养物可包括表达来自相同生物体或来自不同生物体的异源木糖转运蛋白的微生物菌株。共培养物可包括表达来自2、3、4、5、6、7、8、9或更多种微生物的木糖转运蛋白的微生物菌株。在一个实施方案中，木糖转运蛋白可是微生物来源的转运蛋白，例如真菌来源(例如，木霉属、Meripilus,腐质霉属、曲霉菌属、镰刀菌属)的转运蛋白或来自细菌(例如，芽孢杆菌属)的木糖转运蛋白。在另一个实施方案中，木糖转运蛋白来源于丝状真菌，例如来自曲霉菌属的菌株或腐质霉属的菌株。下文的表4和5列出了在解糖热厌氧杆菌中表达的木糖转运蛋白以及木糖转运蛋白的来源。

表4.解糖热厌氧杆菌中表达的木糖转运蛋白基因的DNA序列

表5.解糖热厌氧杆菌中表达的木糖转运蛋白的蛋白质序列

在本发明的某些实施方案中，木糖代谢酶可以是木糖异构酶,木酮糖激酶,木糖还原酶,木糖脱氢酶,木糖醇脱氢酶,木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶旁系同源物或直系同源物。在一个具体的实施方案中，木糖代谢酶包含选自SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列。根据某些其它实施方案，木糖代谢酶包含与选自SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列具有至少约70、约80、约90、约95、约96、约97、约98、约99或100%的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，木糖异构酶的来源生物体包括但不限于玻璃海鞘(Ciona intestinalis)、极端嗜热菌(Thermus thermophilus)、大肠杆菌K-12、Cereus pterogonus、黄麻链霉菌(Streptomyces corchorusii)、Thermus caldophilus、烟碱节杆菌属(Arthrobacter nicotinae)、黑胫病菌(Pectobacterium atrosepticum)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulurigenes)、Thermotoganaepolitana、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)、解糖热厌氧杆菌、大麦(Hordeum vulgare)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adloescentis)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、橄榄产色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、白色链霉菌(Streptomyces albus)和热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor sp.)。

在另一个实施方案中，木酮糖激酶的来源生物体包括但不限于安格斯毕赤酵母(Pinchia angusta)、拟南芥、地芽孢杆菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stiptis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)和热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptorsp)。

实际来看，任何多肽是否与本发明的多肽具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性可使用已知的计算机程序来方便地测定。用于测定百分比同一性的方法(如在下文中关于多核苷酸的同一性更详细地论述的)也适合用于评估多肽序列的同一性。

在本发明的一些具体实施方案中，可通过登录号在查询适当的数据库例如Genebank后容易地测定基因、蛋白质或其它元件的氨基酸和核酸序列。然而本发明的基因和蛋白质的序列也公开于本文中(SEQID NO:1-4)。参见下列表6和表7。

表6.解糖热厌氧杆菌的木糖异构酶和木酮糖激酶的DNA序列

表7.解糖热厌氧杆菌的木糖异构酶和木酮糖激酶的蛋白质序列

本发明的一些实施方案包括包含SEQ ID NO:3-4的任一项的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500或更多个连续氨基酸的多肽或结构域、片段、变体或衍生物。

在本发明的某些方面，本发明的多肽和多核苷酸以分离的形式(例如纯化至均质)提供。

本发明还包括多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:3-4的任一项的多肽或这样的多肽的部分(多肽的这样的部分通常包含至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸)具有至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的相似性的氨基酸序列，或可选择地由所述氨基酸组成。

如本领域中已知的，两个多肽之间的“相似性”可通过将多肽的氨基酸序列和对其的保守氨基酸置换与第二多肽的序列相比较来进行测定。

本发明还涉及SEQ ID NO:3-4的任一项的多肽的结构域、片段、变体、衍生物或类似物。

本发明的多肽的片段或部分可用于通过肽合成产生对应的全长多肽。因此，可将片段用作用于产生全长多肽的中间物。

本发明的木糖代谢酶的片段包括保留木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶蛋白的任何特定生物活性的结构域、蛋白水解片段、缺失片段和任何基因的片段。多肽片段还包括保留木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶蛋白的催化活性的多肽的任何部分。

本发明的木聚糖酶的片段包括保留木聚糖酶的任何特定生物活性的结构域、蛋白水解片段、缺失片段和任何基因的片段。多肽片段还包括保留木聚糖酶的催化活性的多肽的任何部分。

本发明的木糖代谢酶或木聚糖酶的多肽的变体、衍生物或类似物可以是(i)其中氨基酸残基的一个或多个被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换并且此类置换的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的变体、衍生物或类似物或(ii)其中氨基酸残基的一个或多个包括取代基的变体、衍生物或类似物或(iii)其中将成熟多肽与另一种化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合的变体、衍生物或类似物或(iv)其中将另外的氨基酸融合至成熟多肽融合以纯化多肽的变体、衍生物或类似物。根据本文中的教导，此类变体、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的能力范围之内。

本发明的多肽还包括多肽的变体。多肽的“变体”可以是保守变体或等位基因变体。如本文中所用，保守变体是指不会不利地影响蛋白质的生物功能的氨基酸序列的改变。当改变的序列阻止或破坏与蛋白质相关的生物功能时，置换、插入或缺失被称为不利地影响蛋白质。例如，可改变蛋白质的总体电荷、结构或疏水-亲水性质而不不利地影响生物活性。因此，可改变氨基酸序列例如以使肽更加疏水或亲水，而不不利地影响蛋白质的生物活性。

"等位基因变体"是占据生物体的染色体上的给定基因座的基因的预期的替代形式。Genes II,Lewin,B.,ed.,John Wiley&Sons,NewYork(1985)。可使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。等位基因变体，尽管具有与上文中引用的氨基酸序列略微不同的氨基酸序列，但仍将具有相同的或类似的与本发明的木糖代谢酶相关的生物功能。等位基因变体，保守置换变体以及木糖代谢酶的成员可具有与本发明的木糖代谢酶，特别地与SEQ ID NO:3-4之任一项所示的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少90%、至少95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。相对于此类序列的同一性或同源性在本文中定义为：在对齐序列和引入缺口(必要时)以获得最大百分比同源性并且不将任何保守置换考虑为序列同一性的部分后，候选序列中与已知序列相同的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或内部延伸、缺失或至肽序列内的插入将不应解释为影响同源性。

因此，在一个方面，本发明的蛋白质和肽包括分子，所述分子包含SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列或其具有木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶或转醛醇酶多肽序列的至少约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或更多个氨基酸残基的连续序列的片段；其中至少一个氨基酸残基已被插入公开的序列的N或C末端或内部的此类序列的氨基酸序列变体；已被另一个残基置换的如上定义的公开的序列或其片段的氨基酸序列变体。预期的变体还包括包含通过例如同源重组、定点或PCR诱变产生的预定突变的那些变体以及其它动物物种(包括但不限于细菌、真菌、昆虫、兔、大鼠、猪、牛、羊、马和非人灵长类物种)的对应蛋白质、蛋白质家族的等位基因或其它天然存在的变体；以及其中蛋白质已通过置换、化学、酶促或其它适当的方法，利用除天然存在的氨基酸外的部分(例如，可检测的部分例如酶或放射性同位素)共价修饰的衍生物。

通过使用已知的蛋白质工程和重组DNA技术的方法，变体可被产生来改善或改变编码木糖代谢酶的多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸而大体上无生物功能的丢失。

因此，在另一个方面，本发明还包括显示大体生物活性的木糖异构酶,木酮糖激酶,木糖还原酶,木糖脱氢酶,木糖醇脱氢酶,木糖酸脱水酶,转酮醇酶和转醛醇酶多肽变体。此类变体包括按照本领域已知的一般规则选择以便对活性几乎没有影响的缺失、插入、倒转、重复和置换。

本领域技术人员充分了解不太可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸置换(例如，用另一个脂肪族氨基酸替代一个脂肪族氨基酸)，如下文中进一步描述的。

例如，关于如何产生表型上沉默的氨基酸置换的指导方针提供于Bowie等人,"Deciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions,"Science247:1306-1310(1990)中，其中作者指出存在两个用于研究氨基酸序列对改变的耐受性的策略。

第一策略利用进化过程中通过自然选择产生的氨基酸置换的耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可鉴定保守氨基酸。这类保守氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相反地，其中置换已被自然选择耐受的氨基酸位置表示此类位置对于蛋白质功能不是至关重要的。因此，耐受氨基酸置换的位置可被修饰同时仍然维持蛋白质的生物活性。

第二策略使用基因工程以将氨基酸变化引入克隆的基因的特定位置上以鉴定对于蛋白质功能是至关重要的区域。例如，可使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(将单个丙氨酸突变引入分子的每一个残基上)。(Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。随后可测试所得的突变分子的生物活性。

如作者所述，这两个策略已显示蛋白质通常令人惊讶地耐受氨基酸置换。发明人还指出哪个氨基酸的改变在蛋白质的某些氨基酸位置上可能是允许的。例如，大多数埋藏的(在蛋白质的三级结构内部)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的少数特性通常是保守的。此外，被耐受的保守氨基酸置换包括脂肪簇或疏水氨基酸Ala、Val、Leu和Ile的替换；羟基残基Ser和Thr的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酰胺残基Asn和Gln的替换；碱性残基Lys、Arg和His的替换；芳香族残基Phe、Tyr和Trp的替换以及小尺寸的氨基酸Ala、Ser、Thr、Met和Gly的替换。

术语"衍生物"和"类似物"是指与本发明的木糖代谢酶不同但保留其基本性质的多肽。一般而言，衍生物和类似物在总体上是十分相似的，并且在许多区域与本发明的木糖代谢酶相同。术语"衍生物"和"类似物"，当指木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶多肽时，包括保留对应的天然多肽的至少一些活性、例如木糖异构酶活性或其催化结构域的活性的任何多肽。

本文中公开的木糖代谢酶的衍生物是已被改变以展示在天然多肽上未发现的特性的多肽。可通过置换、化学、酶促或其它适当的方法，利用除天然存在的氨基酸外的部分(例如，可检测的部分例如酶或放射性同位素)共价修饰衍生物。衍生物的实例包括融合蛋白。

"类似物"是本发明的木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶多肽的另一种形式。类似物也保留与目标多肽大体上相同的生物功能或活性，例如作为木糖异构酶的功能。类似物包括可通过切割前蛋白部分以产生活性成熟多肽来进行激活的前蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。在一些具体的实施方案中，多肽是重组多肽。

本发明还提供了等位基因变体、直系同源物和/或物种同源物。通过使用来自本文中公开的序列或保藏在ATCC的克隆的信息，可将本领域已知的方法用于获得对应于SEQ ID NO:1-2的任一项或其它木糖代谢酶的基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物和/或物种同源物。例如，可通过从本文中提供的序列产生适当的探针或引物并就等位基因变体和/或期望的同源物筛选适当的核酸来源来分离和鉴定等位基因变体和/或物种同源物。

木糖代谢酶或木聚糖酶的组合

在本发明的一些实施方案中，宿主细胞表达异源木糖代谢酶的组合。在其它实施方案中，宿主细胞表达异源木聚糖酶的组合。例如，宿主细胞可包含至少两种异源木糖代谢酶或至少两种异源木聚糖酶、至少三种异源木糖代谢酶或至少三种异源木聚糖酶、至少四种异源木糖代谢酶或至少四种异源木聚糖酶、至少五种异源木糖代谢酶或至少五种异源木聚糖酶、至少六种异源木糖代谢酶或至少六种异源木聚糖酶、至少七种异源木糖代谢酶或至少七种异源木聚糖酶或至少八种异源木糖代谢酶或至少八种异源木聚糖酶。宿主细胞中的异源木糖代谢酶可来自相同或不同的物种。在一个实施方案中，操纵子包含一种或多种异源木糖代谢酶。宿主细胞中的异源木聚糖酶可来自相同或不同的物种。

包含木糖代谢酶或木聚糖酶的融合蛋白

本发明还包括融合蛋白。例如，融合蛋白可以是异源木糖代谢酶与第二肽的融合物。可直接或间接例如通过接头序列将异源木糖代谢酶与第二肽融合。融合蛋白可包含例如，位于异源木糖代谢酶的N末端的第二肽和/或位于异源木糖代谢酶的C末端的第二肽。因此，在某些实施方案中，本发明的多肽包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶。

在其它实施方案中，融合蛋白可以是异源木聚糖酶与第二肽的融合物。可直接或间接例如通过接头序列将异源木聚糖酶与第二肽融合。融合蛋白可包含例如，位于异源木聚糖酶的N末端的第二肽和/或位于异源木聚糖酶的C末端的第二肽。因此，在某些实施方案中，本发明的多肽包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包括异源木聚糖酶。

根据本发明的一个方面，融合蛋白可包含第一和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶或木聚糖酶，并且第二多肽包括信号序列。根据另一个实施方案，融合蛋白可包括第一和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶或木聚糖酶，并且第二多肽包括用于帮助纯化或鉴定的多肽或报道肽。用于帮助纯化或鉴定的多肽或报道肽可以是例如HIS-标记、GST-标记、HA-标记、FLAG-标记或MYC-标记。

根据另一个实施方案，融合蛋白可包括第一和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶或木聚糖酶，并且第二多肽包括荧光蛋白。在一个方面，荧光蛋白用于检测异源木糖代谢酶融合蛋白或异源木聚糖酶融合蛋白。

根据另一个实施方案，融合蛋白可包含第一和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶或木聚糖酶，并且第二多肽包括锚定肽。

根据另一个实施方案，融合蛋白可包含第一和第二多肽，其中第一多肽包括异源木糖代谢酶或木聚糖酶，并且第二多肽包括纤维素结合模块(CBM)。

根据某些其它实施方案，第一多肽与第二多肽通过接头序列融合。在一些实施方案中，接头序列可由密码子最优化的多核苷酸编码。(在下文中更详细地描述了密码子最优化的多核苷酸)。

共培养物

在另一个方面，本发明涉及包括至少两种宿主细胞的共培养物，其中所述至少两种宿主细胞各自包含一种或多种编码一种或多种木糖代谢酶的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，共培养物可包含宿主细胞的两个或更多个菌株，并且可在宿主细胞的两个或更多个菌株中以任意组合表达异源木糖代谢酶。在一个方面，至少两种宿主细胞表达相同的木糖代谢酶。在另一个方面，至少两种宿主细胞表达不同的木糖代谢酶。在另一个方面，至少两种宿主细胞表达至少一种共同的木糖代谢酶。在一个方面，木糖代谢酶是异源木糖代谢酶。在一个实施方案中，宿主细胞之一是梭菌属宿主细胞。在一个方面，宿主细胞之一是重组热纤梭菌宿主细胞。

在其它方面，本发明涉及包含至少两种宿主细胞的共培养物，其中所述至少两种宿主细胞各自包含一种或多种编码一种或多种木聚糖酶的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，共培养物可包含宿主细胞的两个或更多个菌株，并且可在宿主细胞的两个或更多个菌株中以任意组合表达异源木聚糖酶。在一个方面，至少两种宿主细胞表达相同的木聚糖酶。在另一个方面，至少两种宿主细胞表达不同的木聚糖酶。在另一个方面，至少两种宿主细胞表达至少一种共同的木聚糖酶。在一个方面，木聚糖酶是异源木聚糖酶。在一个实施方案中，宿主细胞之一是梭菌属宿主细胞。在一个方面，宿主细胞之一是重组热纤梭菌宿主细胞。

共培养物中的不同宿主细胞菌株可以以相等数目存在或宿主细胞的一个菌株或种在数目上可以显著地多于宿主细胞的另一个第二菌株或种。例如，在包含宿主细胞的两个菌株或种的共培养物中，一种宿主细胞对另一种的比率可以为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:100、1:500或1:1000。类似地，在包含宿主细胞的3或更多个菌株或种的共培养物中，宿主细胞的菌株或种可以以相等或不相等的数目存在。

编码异源木糖代谢酶或异源木聚糖酶的多核苷酸

在另一个方面，本发明包括编码本发明的木糖代谢酶或木聚糖酶的分离的多核苷酸。多核苷酸可编码木糖异构酶,木酮糖激酶,木糖还原酶,木糖脱氢酶,木糖醇脱氢酶,木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶。

本发明还包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码木糖异构酶,木酮糖激酶,木糖还原酶,木糖脱氢酶,木糖醇脱氢酶,木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶的核酸具有至少约70%、75%或至少约80%的同一性、至少约90%至约95%的同一性或至少约96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸。本发明还包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与编码木聚糖酶的核酸具有至少约70%、75%或至少约80%的同一性、至少约90%至约95%的同一性或至少约96%、97%、98%、99%或100%的同一性的核酸。

本发明还包括木糖代谢酶基因或木聚糖酶基因的变体。变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。实例是包含产生沉默置换、添加或缺失但不改变编码的多肽的性质或活性的改变的多核苷酸变体。在某些实施方案中，通过因遗传密码的简变性引起的沉默置换产生核苷酸变体。在其它实施方案中，可因多种原因(例如为了最优化用于特定宿主的密码子表达)而产生木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶多核苷酸变体。在其它实施方案中，可因多种原因(例如为了最优化用于特定宿主的密码子表达)而产生木聚糖酶多核苷酸变体。本发明的密码子最优化的多核苷酸进一步描述于下文中。

本发明还包括编码融合蛋白的分离的多核苷酸。在其它实施方案中，第一与第二多核苷酸以相同的取向存在或第二多核苷酸以与第一多核苷酸相反的取向存在。在其它实施方案中，第一多核苷酸编码位于由第二多核苷酸编码的多肽的N末端或C末端的多肽。根据某些其它实施方案，第一多核苷酸和/或第二多核苷酸由密码子最优化的多核苷酸例如针对热纤梭菌密码子最优化的多核苷酸编码。

本发明中还提供了等位基因变体、直系同源物和/或物种同源物。可使用来自本文中公开的序列或保藏在ATCC的克隆的信息或另外地公共可获得的信息，将本领域已知的方法用于获得对应于SEQ ID NO:1-2的任一项或其它木糖代谢酶的基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物和/或物种同源物。例如，可通过从本文中提供的序列产生适当的探针或引物并就等位基因变体和/或期望的同源物筛选适当的核酸来源来分离和鉴定等位基因变体和/或物种同源物。通过使用来自本文中公开的序列或保藏在ATCC的克隆的信息或另外地公共可获得的信息，还可将本领域已知的方法用于获得对应于任何木聚糖酶的基因的全长基因、等位基因变体、剪接变体、全长编码部分、直系同源物和/或物种同源物。

对于具有与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的核酸，期望核酸的核苷酸序列，除核苷酸序列可包括达到5个点突变每编码特定多肽的参照序列的每100个核苷酸外，与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列具有至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，可缺失或用另一个核苷酸置换参照序列中达到5%的核苷酸或可将达到5%的参照序列的总核苷酸的众多核苷酸插入参照序列。在一个实施方案中，查询序列可以是SEQ ID NO:1-2的任一项显示的完整序列或如本文中描述的指定的任何片段或结构域。

实际来看，任何特定的核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性可使用已知的计算机程序来方便地测定。用于测定查询序列(本发明的序列)与目标序列(目标序列)之间的最佳总体匹配的方法(也被称为全局序列比对)可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245)的算法的FASTDB计算机程序来测定。在序列比对中，查询和目标序列都是DNA序列。可通过将U转换成T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性表示。用于在DNA序列的FASTDB比对中计算百分比同一性的优选参数是：矩阵=Unitary、k-tuple=4、错配罚分=1、连接罚分=30、随机化组长度=0、截留值评分(Cutoff Score)=1、缺口罚分(Gap Penalty)=5、缺口大小罚分(Gap Size Penalty)0.05、窗口大小(Window Size)=500或目标核酸序列的长度，取两者较短者。

如果由于5’或3’缺失而非由于内部缺失而导致目标序列比查询序列短，必须对结果进行手工修正。这是因为当计算百分比同一性时，FASTDB程序不计入目标序列的5’和3’截短。对于相对于查询序列在5’或3’末端被截断的目标序列，通过将未匹配/对齐的为目标序列的5’和3’的查询序列的碱基的数目计算为查询序列的总碱基的百分比来修正百分比同一性。核苷酸是否匹配/对齐可通过FASTDB序列比对的结果来测定。随后从使用指定参数通过上述FASTDB程序计算的百分比同一性扣除该百分比，以达到最终的百分比同一性评分。该修正的评分是用于本发明的目的评分。为了手工调整百分比同一性评分，仅计算不与查询序列匹配/对齐的目标序列的5’和3’碱基外的碱基，如通过FASTDB比对显示的。

例如，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列对齐以测定百分比同一性。缺失存在于目标序列的5’末端上，FASTDB比对从而不显示5’末端上的前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基代表10%的序列(查询序列的5’和3’末端上未匹配的碱基数目/查询序列的碱基总数)，因此从通过FASTDB程序计算的百分比同一性评分扣除10%。如果剩下的90个碱基完全匹配，则终百分比同一性可为90%。在另一个实例中，将90个碱基的目标序列与100个碱基的查询序列相比较。这次，缺失是内部缺失，以便在目标序列的5’或3’上不存在不与查询序列匹配/对齐的碱基。在该情况下，不对通过FASTDB计算的百分比同一性进行手工修正。再一次地，仅对目标序列的5’和3’上的不与查询序列匹配/对齐的碱基进行手工修正。为了本发明的目的不进行其它手工修正。

本发明的一些实施方案包括包含SEQ ID NO:1-2的任一项或其片段、变体或衍生物的至少10、20、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800个连续核苷酸或更多个连续核苷酸的核酸分子。本发明的其它实施方案包括包含已知的木聚糖酶的任一种或其结构域、片段、变体或衍生物的至少10、20、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800个连续核苷酸或更多个连续核苷酸的核酸分子。

本发明的多核苷酸可以以RNA的形式或以DNA的形式存在，所述DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。在一个实施方案中，编码成熟多肽的编码序列可与编码SEQ ID NO:3-4的编码序列相同，或可以是不同的编码序列，所述编码序列，因遗传密码的冗余性或简并性，可与SEQ ID NO:3-4的任一项的核酸序列编码相同的成熟多肽。在另一个实施方案中，编码成熟多肽的编码序列可与编码已知的木聚糖酶的编码序列相同，或可以是由于遗传密码的冗余性或简并性编码相同的成熟木聚糖酶的不同的编码序列。

在某些实施方案中，本发明提供了包含编码SEQ ID NO:1-2的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少95或至少100或更多个连续氨基酸的核酸片段的分离的多核苷酸。在其它实施方案中，本发明提供了包含编码已知的木聚糖酶的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少95或至少100或更多个连续氨基酸的核酸片段的分离的多核苷酸。

编码SEQ ID NO:3-4的成熟多肽的多核苷酸可包括：仅仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽的任何结构域的编码序列；和与非编码序列例如内含子或成熟多肽的编码序列的5'和/或3'非编码序列一起的成熟多肽的编码序列(或结构域编码序列)。

因此，术语"编码多肽的多核苷酸"包括仅包含编码多肽的序列的多核苷酸以及包含另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。

由于遗传密码的简并性，本领域技术人员将立即认识到，大部分具有与SEQ ID NO:1-2的任一项或其片段的核酸序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的序列的核酸分子将编码具有功能活性的多肽。事实上，由于此类核苷酸序列的任一项的简并变体编码相同的多肽，因此在许多情况下，即使在不进行上述比较测定的情况下，这对于本领域技术人员来说是很明了的。本领域还进一步认识到，对于不是简并变体的此类核酸分子，合理的数目也编码具有功能活性的多肽。

本发明的多核苷酸还包括编码融合至编码标记序列的多核苷酸的编码木糖代谢酶或其结构域、片段、变体或衍生物的核酸，所述标记序列允许检测本发明的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，标记的表达不依赖于木糖代谢酶的表达。本发明的多肽还包括融合至编码标记序列的多核苷酸的编码木聚糖酶或其结构域、片段、变体或衍生物的核酸，所述标记序列允许检测本发明的多核苷酸。在本发明的一个实施方案中，标记的表达不依赖于木聚糖酶的表达。

在一个实施方案中，将本发明的一个或多个多核苷酸稳定地整合进入宿主细胞的基因组。在一个方面，将多核苷酸随机地整合进入宿主细胞的基因组。在另一个方面，将多个拷贝的多核苷酸随机地整合进入宿主细胞的基因组。在一个方面，将至少两个拷贝的多核苷酸随机整合进入宿主细胞的基因组。

在另一个实施方案中，将一个或多个多核苷酸整合进入宿主细胞的基因组。在一个方面，一个或多个多核苷酸在宿主细胞中存在于染色体外质粒中。

在一个实施方案中，将本发明的一个或多个多核苷酸在特定的位置上稳定地整合进入宿主细胞的基因组。在一个方面，将一个或多个多核苷酸在一个或多个特定的基因的位置上稳定地整合进入宿主细胞的基因组。在一个实施方案中，一个或多个特定的基因由于一个或多个整合事件而被破坏。在另一个方面，一个或多个特定的基因由于一个或多个整合事件而被缺失。在一个实施方案中，宿主细胞不能产生一个或多个特定的被破坏的基因的蛋白质产物。在另一个方面，宿主细胞不能产生一个或多个特定的缺失的基因的蛋白质产物。在优选实施方案中，将一个或多个多核苷酸在乳酸脱氢酶基因的位置上稳定地整合进入宿主细胞的基因组。

在一个实施方案中，将本发明的多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合进入宿主细胞的基因组。在另一个实施方案中，将本发明的多核苷酸的终止密码子与特定基因的终止子在读框内整合进入宿主细胞的基因组。在一个实施方案中，将多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合进宿主细胞的基因组，并且还将相同多核苷酸的终止子与该特定的基因的终止子在读框内整合。

在一个实施方案中，一个或多个多核苷酸是操纵的部分。在一个方面，将操纵子中的第一多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合进入宿主细胞的基因组。在另一个方面，将操纵子中的最后一个多核苷酸的终止密码子与特定基因的终止子在读框内整合进入宿主细胞的基因组。在一个实施方案中，将操纵子中的第一多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合进入宿主细胞的基因组，并且将操纵子中的最后一个多核苷酸的终止密码子与该特定基因的终止子在读框内整合。

密码子最优化的多核苷酸

可对本发明的多核苷酸进行密码子最优化。如本文中所用，术语"密码子最优化的编码区"意指已被改造(通过用一个或多个在给定的生物体的基因中更频繁使用的密码子替代至少一个或超过一个或许多个密码子)用于在给定生物体的细胞中进行表达的核酸编码区。

一般而言，生物体中高度表达的基因偏向于被该生物体的最丰富的tRNA种类识别的密码子。该偏好性的一个量度是"密码子适应指数(codon adaptation index)"或"CAI"，其测量用于编码特定基因中的每一个氨基酸的密码子是在一个参照组的来自生物体的高度表达的基因中最频率出现的密码子的程度。

本发明的密码子最优化的序列的CAI对应于约0.8至1.0、约0.8至0.9或约1.0。取决于该生物的生物约束(biological constraint)，可进一步修饰密码子最优化的序列以在特定的生物体中表达。例如，可从序列除去大量"A"或"T"(例如，超过3、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基)，如果已知这些碱基不利地影响转录的话。此外，为了分子克隆目的可除去特定限制性内切酶位点。此类限制性内切酶位点的实例包括PacI、AscI、BamHI、BglII、EcoRI和XhoI。此外，可检查DNA序列的具有10个碱基或更长的长度的正向重复、反向重复和镜像重复，可通过用“第二最佳”密码子(即在将对其序列进行最优化的特定生物中以第二高频率出现的密码子)替代密码子来手工修饰所述DNA序列。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的差异允许编码基因的序列的变化。由于每一个密码子由3个核苷酸组成，并且包含核苷酸的DNA限定于4个特定的碱基，因此存在64个可能的核苷酸组合，其中的61个编码氨基酸(其余3个密码子编码编码翻译的信号)。将显示哪个密码子编码哪个氨基酸的"遗传密码"在本文中重现为表8。因此，许多氨基酸由超过一个密码子来指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4个三联体编码，丝氨酸和精氨酸由6个三联通体编码，然而色氨酸和甲硫氨酸仅由1个三联体编码。该简并性允许DNA碱基组成在较宽的范围内变化而不改变由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列序列。

表8:标准遗传密码

许多生物体显示对编码特定氨基酸在正在生长的肽链中的插入的特定密码子的使用的偏爱。生物体之间的密码子偏好性或密码子偏爱、密码子选择的差异由遗传密码的简并性提供，并且在许多生物体之间得以充分证明。密码子偏爱通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而所述翻译效率反过来据信取决于，除其它以外，待翻译的密码子的性质和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。选择的tRNA在细胞中的数量优势通常反映肽合成中最频率使用的密码子。因此，可基于密码子最优化定制基因来在给定的动物中进行最佳基因表达。

鉴于存在大量可获得的广泛的动物、植物和微生物种类的基因序列，因此可能计算密码子选择的相对频率。密码子选择表可容易获得，例如，在http://www.kazusa.or.jp/codon/(于2011年12月21日访问的)上，可以以许多方式改编这些表。参见Nakamura,Y.,等人"Codonusage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000,"Nucl.Acids Res.28:292(2000)。热纤梭菌的密码子选择表在下文中重现为表9。该表使用mRNA命名法，因此该不使用在DNA中发现的胸腺嘧啶(T)，而是使用在RNA中发现的尿嘧啶(U)。该表已被改编以便针对每一个氨基酸而非针对所有64个密码子计算频率。

表9：热纤梭菌基因的密码子选择表

通过利用该表或类似的表达，本领域技术人员可将频率用于任何给定的多肽序列，产生编码多肽但使用针对给定的物种是最佳的密码子的密码子最优化编码区的核酸片段。密码子最优化编码序列可通过各种不同的方法来设计。

在一个方法中，将密码子选择表用于寻找用于任何给定的氨基酸的单个频率最高的密码子，将该密码子每一次用于出现在多肽序列中的该特定氨基酸。例如，参照上表9，对于亮氨酸，频率最高的密码子是UUG，该密码子选择的次数占27.2%。因此将给定的氨基酸序列中的所有亮氨酸残基的密码子指定为UUG。

在另一个方法中，将密码子的实际频率随机分配在整个编码序列。因此，通过使用该方法进行最优化，如果假定的多肽序列具有100个亮氨酸残基，关于在酿酒酵母中的选择频率参考表9，则约5或5%的亮氨酸密码子为CUC，约11或11%的亮氨酸密码子为CUG，约12或12%的亮氨酸密码子为CUU，约13或13%的亮氨酸密码子为CUA，约26或26%的亮氨酸密码子UUA，约27或27%的亮氨酸密码子为UUG。

可将这些频率在编码假定的多肽的编码区中随机分配在整个亮氨酸密码子中。如将被本领域技术人员所理解的，密码子在序列中的分配可使用该方法来显著地改变；然而，序列总是编码相同的多肽。

当使用上述方法时，术语"约"用于精确地说明给定的氨基酸的密码子频率的百分比分数。如本文中所用，"约"定义为比合定的值多1个氨基酸或少1个氨基酸。如果使用的分数频率为0.50或更大，则将氨基酸的整个数值向上舍入，如果使用的分数频率为0.49或更小，则向下舍入。通过对具有62个亮氨酸残基的假定的多肽再次使用人基因中的亮氨酸的选择频率的实例，密码子选择的分数频率可通过用不同密码子的频率乘以62来计算。因此，62的7.28%等于4.51个UUA密码子或"约5个"，即4、5或6个UUA密码子，62的12.66%等7.85个UUG密码子或"约8个"，即7、8或9个UUG密码子，62的12.87%等于7.98个CUU密码子或"约8个"，即，7、8或9个CUU密码子、62的19.56%等于12.13个CUC密码子或"约12个"，即11、12或13个CUC密码子、62的7.00%等于4.34个CUA密码子或"约4个"，即3、4或5个CUA密码子，62的40.62%等于25.19个CUG密码子或"约25个"，即24、25或26个CUG密码子。

可通过计算每一个氨基酸的密码子频率，随后将密码子随机分配给多肽序列来手工地以最优化的频率随机分配密码子以编码给定的多肽序列。此外，不同的算法和计算机软件程序对本领域技术人员说是可容易获得的。例如，可从DNAstar,Inc.,Madison,WI获得的Lasergene包中的"EditSeq"功能，可从InforMax,Inc.,Bethesda,MD获得的VectorNTI Suite中的回译(backtranslation)功能，以及可从Accelrys,Inc.,San Diego,CA获得的GCG—Wisconsin包中的“回译”功能。此外，不同来源是可公共获得，用以对编码区序列进行密码子最优化，例如http://www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php?lang=eng(2009年12月18日访问的)上的“回译”功能，和可在http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/backtranseq(2009年12月18日访问的)上获得的"backtranseq"功能。构建基本算法以基于给定的频率分配密码子还可由本领域技术人员利用基本数学函数来容易地实现。

许多选项可获得用于使用本领域技术人员公知的标准和常规分子生物学操作合成通过任何上述方法设计的密码子最优化编码区。在一个方法中，利用标准方法合成一系列互补寡核苷酸对，所述寡核苷酸对在长度上各自具有80-90个核苷酸并且覆盖期望的序列的长度。合成此类寡核苷酸对以便在退火后，它们形成80-90个碱基对的包含粘性末端的双链片段，例如合成对中的每一个寡核苷酸以延伸至与对中的另一个寡核苷酸互补的区域外3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。寡核苷酸的每一个对的单链末端被设计来与另一对寡核苷酸的单链末端退火。使寡核苷酸对退火，随后使这类双链片段的约5至6个片段通过粘性单链末端退火在一起，随后将它们连接在一起并且克隆进入标准细菌克隆性载体，例如可从Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA获得的载体。随后利用标准方法对构建体进行测序。制备由5至6个连接在一起的80至90个碱基对的片段组成的此类构建体的几个构建体，即约500个碱基对的片段，以便在一系列质粒构建体中代表整个期望的序列。随后利用适当的限制性内切酶切割此类质粒的插入物，将其连接在一起以形成最终的构建体。随后将构建体克隆进入标准细菌克隆性载体，然后进行测序。其它方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。此外，基因合成在容易地商购获得。

在其它实施方案中，针对给定的物种对全长多肽序列进行密码子最优化，从而产生编码整个多肽的密码子最优化编码区，随后从最初的密码子最优化编码区产生编码多肽的片段、变体和衍生物的密码子最优化编码区的核酸片段。如可被本领域技术人员充分理解的，如果已将密码子基于它们在给定的物种中的使用频率随机分配至全长编码区，则编码片段、变体和衍生物的核酸片段对于给定的物种可能不一定是完全密码子最优化的。然而，这样的序列仍然远比天然密码子选择更接近期望的物种的密码子选择。该方法的有利方面是合成编码给定的多肽的每一个片段、变体和衍生物的密码子最优化的核酸片段，无论何种途径，将是非常耗时的并且可造成非常高的费用。

密码子最优化的编码区可以是例如编码本发明的木糖代谢酶或其结构域、片段、变体或衍生物的形式。

利用本文中描述的方法针对特定特种进行密码子最优化，例如，在某些实施方案中，按照细菌(例如，热纤梭菌)的密码子选择最优化编码本申请中公开的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子最优化的编码区。在本文中公开的某些实施方案中，按照梭菌属的密码子选择最优化编码SEQ ID NO:3-4的任一项或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子最优化的编码区。在一些实施方案中，特别地针对在热纤梭菌中的表达对序列进行密码子最优化。或者，可按照任何植物、动物或微生物种类中的密码子选择最优化编码SEQ ID NO:3-4的任一项的密码子最优化的编码区。

还提供了包含编码本文中公开的多肽或其结构域、片段、变体或衍生物的密码子最优化的编码区的多核苷酸、载体和其它表达构建体，以及使用此类多核苷酸、载体和其它表达构建体的各种方法。

载体和在宿主细胞中使用载体的方法

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的载体、利用本发明的载体对其进行了遗传工程化的宿主细胞以及利用重组技术进行的本发明的多肽的产生。

利用本发明的载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以以例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式存在。可将工程化的宿主细胞培养在根据具体情况经改良用于激活启动子、选择转化体或扩增本发明的基因的常规营养培养基中。培养条件例如温度、pH等是先前用于被选择用于表达的宿主细胞的那些条件，并且对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

本发明的多肽可用于通过重组技术产生多肽。因此，例如，可将多核苷酸包含在许多表达载体的任一个中以表达多肽。此类载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；和酵母质粒。然而，可使用任何其它载体，只要其在宿主中是可复制的和有活力的。

可通过许多方法将适当的DNA序列插入载体。一般而言，通过本领域已知的方法将DNA序列插入适当的限制性内切核酸酶位点。此类方法和其它方法被认为在本领域技术人员的能力范围之内。

将表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列(启动子)有效地连接以指导mRNA合成。可使用在本发明的宿主细胞中驱动基因表达的任何适当的启动子。

此外，表达载体可包含一个或多个选择标记基因来提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如URA3、HIS3、LEU2、TRP1、LYS2或ADE2、二氢叶酸还原酶、新霉素(G418)抗性或zeocin抗性(对于真核细胞培养)或四环素或氨苄青霉素抗性(在原核细胞培养，例如热纤梭菌)。

表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和/或转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的适当序列或可包括另外的调控区。

可将其中包含适当的DNA序列以及适当的启动子或控制序列的载体用于转化适当的宿主以允许宿主表达蛋白质。

因此，在某些方面，本发明涉及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是本申请中其它地方描述的宿主细胞。宿主细胞可以是例如低等真核生物细胞例如酵母细胞，例如酿酒酵母或克鲁维酵母属细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，例如热纤梭菌。

根据本文中的教导，适当的宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。在一个实施方案中，将载体整合进入宿主细胞的基因组。在另一个实施方案中，载体以染色体外质粒的形式存在于宿主细胞中。

为了选择已进入宿主的外来DNA，优选将DNA稳定地维持在目标生物体中。对于质粒，存在两个这可籍以发生的方法。一个方法是通过使用复制型质粒。此类质粒具有被宿主识别并且允许质粒复制为稳定的自主的染色体外元件的复制起始点，所述元件在细胞分裂过程中被分配入子细胞。第二方面通过将质粒整合进入染色体来发生。这主要通过同源重组发生，并且导致整个质粒或质粒的部分插入宿主染色体。因此，质粒和选择标记可作为染色体的不可分割的部分复制并且分离进入子细胞。因此，为了确定(通过使用选择标记)质粒DNA在是否在转化事件过程中进入细胞，需要使用复制型质粒或将质粒重组至染色体上的能力。此类合格者不可能总是遇得到的，特别地当操作不具有一套遗传工具的生物体时。

避免关于质粒相关标记的问题的一个方式是通过使用转座子。转座子是移动DNA元件，被定义为可被称为转座酶的酶促机器识别的嵌合DNA序列(mosaic DNA sequence)。转座酶的功能是将转座子DNA随机插入宿主或靶靶DNA。可通过标准遗传工程将选择标记克隆至转座子上。可在体外反应中将所得的DNA片段偶联至转座酶机器，随后可通过电穿孔将复合物引入靶细胞。标记至染色体上的稳定插入仅需要转座酶机器的功能，并且减少了对同源重组或复制型质粒的需要。

与转座子的整合相关的随机性质具有用作诱变的形式的额外有利方面。可产生包含合并的转座子突变体的文库。此类文库可用于筛选或选择以产生具有期望的表型的突变体。例如，可筛选CBP生物体的转座子文库的产生更少乙醇或更多乳酸和/或更多醋酸的能力。

使用宿主细胞产生乙醇或其它发酵产物的方法

微生物产生多种多样的发酵产物，包括有机酸例如乳酸盐(乳酸的盐形式)、醋酸盐(醋酸的盐形式)、丙酮酸盐、琥珀酸盐和丁酸盐以及中性产物例如乙醇、丁醇、丙酮和丁二醇。发酵产物包括生物燃料、化学品、适合作为液体燃料的化合物、试剂、化学原料、化学添加剂、操作助剂(processing aid)、食品添加剂和其它产物。例如，参见国际公布号WO2010/105194、国际申请号PCT/US2010/046172和美国临时申请号61/331,657和61/351,133。

在一个方面，本发明涉及宿主细胞和共培养物用于从生物质底物的木糖部分产生乙醇或其它产物的用途。可以例如通过将含有木糖的质纤维底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触来实现此类方法。在另一个方面，本发明涉及宿主细胞和共培养物用于从生物质底物的木聚糖部分产生乙醇或其它产物的用途。发酵产物包括但不限于产物例如乙醇、丙醇、异戊醇、丁醇、醋酸盐、氨基酸和维生素。

在一个实施方案中，通过宿主菌株的木糖发酵的终产物包含丙酮酸盐、醋酸盐和乙醇。在另一个实施方案中，通过宿主菌株的木糖发酵的终产物包含醋酸盐和乙醇。在一个方面，形成的醋酸盐对乙醇的比率可以为至少约10:1、至少约5:1、至少约2:1、至少约1:1、至少约1:2、至少约1:5、至少约1:10、至少1:100、至少1:1000或至少1:10,000。在一个实施方案中，通过宿主菌株的木聚糖发酵的终产物不包含可检测的醋酸盐。在另一个实施方案中，通过宿主菌株的木聚糖发酵的终产物包含乙醇。在一个实施方案中，对宿主细胞进行进一步工程化以增加来自通过宿主细胞的木糖发酵的乙醇产量。在一个实施方案中，使PTA基因缺失以增加来自通过宿主细胞的木糖发酵的乙醇产量。在一个方面，PTA基因的缺失导致乙醇为通过宿主细胞的木糖发酵的主要终产物。在另一个方面，PTA基因的缺失导致作为通过宿主细胞的木糖发酵的终产物的乙醇的产生，实际消除了一种或多种不期望的终产物(例如除乙醇或二氧化碳外的终产物)。在另一个方面，PTA基因的缺失导致作为终产物的乙醇产生并且无不期望的终产物产生。在另一个实施方案中，不产生或不大量产生乳酸盐或醋酸盐或两者。

可按照本发明在至少约25℃、约28℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃或约50℃的温度进行乙醇的产生。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在高于约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃或约50℃的温度从含木糖或含木聚糖的纤维质底物产生乙醇。在本发明的一些实施方案中，耐热宿主细胞可在约30℃至60℃、约30℃至55℃、约30℃至50℃、约40℃至60℃、约40℃至55℃或约40℃至50℃的温度从含木糖或含木聚糖的纤维质底物产生乙醇.

在一些实施方案中，产生乙醇的方法可包括将含木糖和/或含木聚糖的木质纤维底物与本发明的宿主细胞或共培养物接触，以及额外地将含木糖的木质纤维底物与外部产生的木糖代谢酶和/或木聚糖酶接触。示例性外部产生的木糖代谢酶是商购可得的并且对于本领域技术人员来说是已知的。示例性外部产生的木聚糖酶也是商可得的并且对于本领域技术人员来说是已知的。

在一些实施方案中，通过在包含木糖作为唯一糖源的培养基中生长至少2、5、10、15、20或100代以产生第二重组宿主细胞来进一步选择本发明的重组宿主细胞，所述第二重组宿主细胞比未经历选择的另外的相同的细胞更高效地利用木糖。

本发明还涉及减少从含木糖的纤维质底物产生给定量的乙醇所需的外部产生的木糖代谢酶的量的方法，包括将含木糖的纤维质底物与外部产生的木糖代谢酶和与本发明的宿主细胞或共培养物接触。在一些实施方案中，可使用减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%或50%的外部产生的木糖代谢酶实现相同量的乙醇产生。在其它实施方案中，可实现乙醇产生而无需添加外部产生的木糖代谢酶。

本发明还涉及减少从含木聚糖的纤维质底物产生给定量的乙醇所需的外部产生的木聚糖酶的量的方法，包括将含木聚糖的纤维质底物与外部产生的木聚糖酶和与本发明的宿主细胞或共培养物接触。在一些实施方案中，可使用减少至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%或50%的外部产生的木聚糖酶实现相同量的乙醇产生。在其它实施方案中，可实现乙醇产生而无需添加外部产生的木聚糖酶。

在一些实施方案中，方法包括以特定的速率产生乙醇。例如，在一些实施方案中，以至少约0.1mg/小时/升、至少约0.25mg/小时/升、至少约0.5mg/小时/升、至少约0.75mg/小时/升、至少约1.0mg/小时/升、至少约2.0mg/小时/升、至少约5.0mg/小时/升、至少约10mg/小时/升、至少约15mg/小时/升、至少约20.0mg/小时/升、至少约25mg/小时/升、至少约30mg/小时/升、至少约50mg/小时/升、至少约100mg/小时/升、至少约200mg/小时/升或至少约500mg/小时/升的速率产生乙醇。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可以以比在相同条件下生长的对照菌株(缺乏异源木糖代谢酶)快至少约0.1mg/小时/升、至少约0.25mg/小时/升、至少约0.5mg/小时/升、至少约0.75mg/小时/升、至少约1.0mg/小时/升、至少约2.0mg/小时/升、至少约5.0mg/小时/升、至少约10mg/小时/升、至少约15mg/小时/升、至少约20.0mg/小时/升、至少约25mg/小时/升、至少约30mg/小时/升、至少约50mg/小时/升、至少约100mg/小时/升、至少约200mg/小时/升或至少约500mg/小时/升的速率产生乙醇。在一些实施方案中，可在任何外部添加的木糖代谢酶不存在的情况下产生乙醇。

可使用本领域已知的任何方法测量乙醇产量。例如，可使用HPLC分析估量发酵样品中乙醇的量。许多乙醇测定试剂盒是商购可得的，其使用例如基于醇氧化酶的测定。根据本文中的教导，测定乙醇产量的方法在本领域技术人员的能力范围之内。

美国能源部(DOE)提供了用于计算理论乙醇产率的方法。因此，如果已知C6糖(即，葡聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖)的重量百分比，则可通过应用如下的换算因子来测定每干吨的总C6聚合物产生的乙醇(以加仑表示的)的理论产率：

(1.11磅的C6糖/磅的聚合糖)x(0.51磅的乙醇/磅的糖)x(2000磅的乙醇/吨的C6聚合糖)x(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)x(1/100%)，其中将因子(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)用作乙醇在20℃的比重。

并且如果已知C5糖(即，木聚糖、阿拉伯聚糖)的重量百分比，则可通过应用如下的换算因子来测定每干吨的总C5聚合物产生的乙醇(以加仑表示的)的理论产率：

(1.136磅的C5糖/磅的C5聚合糖)x(0.51磅的乙醇/磅的糖)x(2000磅的乙醇/吨的C5聚合糖)x(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)x(1/100%)，其中将因子(1加仑的乙醇/6.55磅的乙醇)用作乙醇在20℃的比重。

随后，通过将每干吨的总C6聚合物产生的乙醇(以加仑表示的)的理论产率加上每干吨的总C5聚合物产生的乙醇(以加仑表示的)的理论产率产生每干吨的原料产生的乙醇(以加仑表示的)的总产率。

在一个实施方案中，本发明提供了产生戊糖发酵产物的方法，包括温育包含含有一种或多种戊糖的生物质和能够发酵一种或多种戊糖的微生物的反应混合物。在一个方面，能够发酵一种或多种戊糖的微生物是梭菌属的种。在一个方面，梭菌属的种是热纤梭菌。在一个实施方案中，热纤梭菌是本发明的重组热纤梭菌宿主细胞。在一个实施方案中，戊糖是木糖。在一个实施方案中，木糖发酵产物包含乙醇、醋酸盐和/或丙酮酸盐。在一个实施方案中，木糖发酵终产物是乙醇。

在一个实施方案中，本发明提供了发酵木糖的方法，包括温育包含含有一种或多种戊糖的生物质和能够发酵一种或多种戊糖的微生物的反应混合物。在一个方面，戊糖是木糖。在一个方面，能够发酵一种或多种戊糖的微生物是梭菌属的种。在一个方面，梭菌属的种是热纤梭菌。在一个实施方案中，热纤梭菌是本发明的重组热纤梭菌宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够发酵一种或多种戊糖的微生物和培养基的发酵液。在一个方面，戊糖是木糖。在一个方面，能够发酵一种或多种戊糖的微生物是梭菌属的种。在一个方面，梭菌属的种是热纤梭菌。在一个方面，热纤梭菌是本发明的重组热纤梭菌宿主细胞。在一个实施方案中，培养基包含一种或多种戊糖。在一个方面，戊糖是木糖。在一个实施方案中，培养基能够支持能够发酵一种或多种戊糖的微生物的生长。

实施例

本发明现被一般性描述，通过参考下列实施例可更容易地理解本发明，所述实施例仅仅是为了举例说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并且无意限定本发明。

实施例1

Δldh::XI/XK(T2)菌株的产生

本发明提供了用于产生表达酶XI和XK的热纤梭菌的方法。为了进行该方法，分子盒被设计来将XI/XK操纵子与热纤梭菌的染色体上的LDH启动子和终止子序列融合(图1)。在无缝整合过程中，使LDH开放阅读框缺失，从而所得的菌株不能产生乳酸盐。

为了将XI/XK操纵子整合在染色体上，设计并构建质粒pMU1793(图2)。将该质粒转化进入包含次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因的缺失的热纤梭菌。需要该背景来帮助整合事件的遗传选择，并且该背景与本发明无关。进行两轮遗传选择。第一轮针对质粒并就XI/XK操纵子和可选择标记的整合进行选择。在第二轮中，除去标记，从而导致XI/XK操纵子与LDH启动子和终止子在读框内的无缝整合。通过诊断性PCR确认了无缝整合(图3)。

实施例2

Δldh::XI/XK(T2)菌株在木糖上的生长

将来自实施例1的所得菌株接种在数管包含浓度在5-100g/l的范围内的木糖的CTFUD培养基中。7天后，在10、20、50g/l木糖中观察到OD的增加。通过诊断性PCR和16S测序进一步分析了这些菌株。两个结果都表明样品是热纤梭菌的纯培养物。获取终点样品，通过HPLC进行分析。156小时后，观察到显著的木糖消耗(图4)。在已用野生型热纤梭菌接种的培养基中未观察到混浊，未通过HPLC分析样品。

实施例3

通过Δldh::XI/XK(T2)菌株进行的木糖发酵

热纤梭菌产生乙醇、乳酸盐和醋酸盐作为主要的发酵终产物。观察到T2Δldh::XI/XK菌株产生少量醋酸盐、乙醇和丙酮酸盐(图5)。未观察到乳酸盐，鉴于LDH基因的缺失，这是预料之中的结果。在培养基中观察到的相对大量的丙酮酸盐表示细胞可能处于应激条件下。

将以20g/l生长的Δldh::Xi/Xk培养物连续2次转移至相同培养基中，从而产生T3和T4培养物。监测这些转移的OD，通过显微镜检查进行分析。观察到始于在接种后前24小时中无生长的模式。48小时后，观察到OD的稍许增加，并且观察到高频率的孢子形成(图6)。孢子形成是不容易在热纤梭菌产生并且仅在ΔldhΔpta菌株的定向进化的早期阶段以该频率观察到的现象。鉴于引入Δldh::Xi/XK和ΔldhΔpta菌株中的代谢干扰，该数据可表示热纤梭菌响应氧化还原应激而形成孢子。72小时后，T3和T4培养物中观察到孢子形成现象被长时间压力下的细胞替代(图7)。

实施例4

通过Δldh::XI/XK(T6)菌株进行的木糖发酵

继续Δldh::XI/XK培养物的连续转移，再进行二代，从而产生T6菌株。对在10和20g/l木糖上生长的T6培养物进行终点分析。结果表明培养物进化至优先产生醋酸盐，因为观察到5:1的醋酸盐对乙醇比率(图8)。

对T6菌株进行分子QC，并且再次确认菌株是热纤梭菌的纯培养物。将T6菌株接种至包含10g/l微晶粉末纤维素的培养基中，以进一步支持该培养物确实是热纤梭菌。微晶粉末纤维素上的生长是迅速的，表明已被转移的生物体是高度分解纤维素的。有趣地，即使在基于纤维素的碳源上，醋酸盐:乙醇保持在5:1(图9)。未观察到乳酸盐，由于LDH的缺失，这是预料之中的。

实施例5

Δhpt,Δldh:XI/XKΔpta菌株的产生

上述T6菌株能够在木糖上生长，然而仍然产生醋酸盐。为了产生高产率菌株，应当消除醋酸盐的产生，这可通过PTA基因的缺失来实现。

因此，为了产生能够将木糖转化成乙醇(作为终产物)、实际消除其它不期望的终产物或不产生不期望的终产物的菌株，必需使PTA基因缺失。由于Δldh::XI/XK菌株进化至产生5:1的醋酸盐对乙醇比率，将未进化的菌株选择作为用于该突变的背景。在Δldh:XI/XK背景中使PTA缺失的方法公开于Argyros等人,Appl.Environ.Microbiol.,77:8288-8294,2011中。简而言之，利用质粒pMU1817转化Δldh:Xi/XK菌株，所述质粒先前已被用于使PTA缺失。如上所述进行遗传选择，通过诊断性PCR确认了Δpta,Δldh:XI/XK菌株。将该菌株转移至最简培养基上，进行10次，冷冻以待进一步分析。

此外，从实施例1的所得菌株构建菌株M2236。菌株M2236还包含PTA基因的缺失，从而产生菌株Δhpt,Δldh:XI/XKΔpta。将M1570菌株用作热纤梭菌的对照菌株。M1570具有LDH和PTA缺失但不包含解糖热厌氧杆菌XI/XK基因，从而不能将木糖发酵成乙醇。

实施例6

利用Δhpt,Δldh::XI/XKΔpta菌株进行的木糖发酵

将M1570(ΔhptΔldhΔpta)和M2236菌株生长在包含木糖作为唯一碳源的CM3培养基中。在第24小时和第48小时使用HPLC测量木糖和乙醇的浓度。图10显示木糖被M2236菌株消耗，并且M2236菌株产生乙醇。相反地，M1570菌株不能将大量木糖转化成乙醇。在任一发酵中未检测到乳酸盐或醋酸盐。

通过引用并入

本文中引用的所有文献，包括期刊论文或摘要、公布或相应的美国或外国专利申请、颁布的或外国专利或任何其它文献通过引用整体并入本文，包括引用的文献中提供的所有数据、表、图和正文。

等同物

本领域技术人员将认识到或通过仅使用常规实验能够确定本文中描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物意欲由下列权利要求包括。

Claims (82)

1.一种能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞。

2.权利要求1的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含一种或多种编码一种或多种能够代谢木糖的酶的异源多核苷酸。

3.权利要求1或2的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主包含编码木糖异构酶的异源多核苷酸。

4.权利要求1-3的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主包含编码木酮糖激酶的异源多核苷酸。

5.权利要求2-4的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸来源于解糖热厌氧杆菌。

6.权利要求2-5的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含乳酸脱氢酶启动子和终止子。

7.包含一种或多种异源多核苷酸的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-2的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列。

8.权利要求7的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-2的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一性的核苷酸序列。

9.权利要求8的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-2的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。

10.权利要求2-9的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸被表达。

11.权利要求10的重组热纤梭菌宿主细胞，其中一种或多种异源多核苷酸的表达赋予重组宿主细胞发酵木糖的能力。

12.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸被稳定地整合进入宿主细胞的基因组。

13.权利要求2-12的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含至少两个拷贝的整合进入宿主细胞的基因组的异源多核苷酸。

14.权利要求2-13的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在特定的位点被整合进入宿主细胞的基因组。

15.权利要求2-14的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中异源多核苷酸的至少一个的整合发生在宿主细胞的基因组的特定基因的位点。

16.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中特定基因是宿主细胞的乳酸脱氢酶基因。

17.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在宿主细胞中存在于染色体外质粒中。

18.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于异源多核苷酸的整合而被破坏。

19.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于异源多核苷酸的整合而缺失。

20.权利要求18的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞不能产生被破坏的基因的蛋白质产物。

21.权利要求19的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞不能产生缺失基因的蛋白质产物。

22.权利要求2-21的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种编码一种或多种酶的异源多核苷酸包含在操纵子中。

23.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中将一种或多种异源多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合在宿主细胞的基因组中。

24.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中将一种或多种异源多核苷酸的终止密码子与特定基因的终止子在读框内整合在宿主细胞的基因组中。

25.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸随机整合进入宿主细胞的基因组。

26.权利要求7的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。

27.权利要求8的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。

28.权利要求9的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。

29.权利要求1-28的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含对于宿主细胞是内源的一个或多个基因的缺失。

30.权利要求29的重组热纤梭菌宿主细胞，其中一个或多个对于宿主细胞是内源的基因的缺失包括次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因。

31.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙醇。

32.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙酸。

33.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成丙酮酸。

34.权利要求1-33的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含PTA基因的缺失。

35.权利要求34的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞将木糖发酵成乙醇作为终产物并且不产生不期望的终产物。

36.一种发酵液，其包含:

(a)能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和

(b)培养基，其中所述培养基包含木糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。

37.权利要求36的发酵液，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。

38.一种共培养物，其包含权利要求1-35的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞。

39.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达相同的木糖代谢酶。

40.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达不同的木糖代谢酶。

41.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达至少一种共同的木糖代谢酶。

42.发酵木糖的方法，其包括：

温育反应混合物，所述反应混合物包含：

(a)生物质，其中所述生物质包含木糖；和

(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木糖。

43.权利要求42的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。

44.产生一种或多种木糖发酵产物的方法，包括：

温育反应混合物，所述反应混合物包括：

(a)生物质，其中所述生物质包含木糖；和

(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木糖以产生一种或多种木糖发酵产物。

45.权利要求44的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。

46.权利要求44的方法，其中所述一种或多种木糖发酵产物包括乙醇。

47.重组热纤梭菌宿主细胞，其能够发酵木聚糖。

48.权利要求47的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含一种或多种编码一种或多种能够代谢木聚糖的酶的异源多核苷酸。

49.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在特定位点整合进入宿主细胞的基因组。

50.权利要求49的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸的至少一个的整合发生在宿主细胞的基因组的特定基因的位点。

51.权利要求50的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于所述异源多核苷酸的整合而被破坏。

52.权利要求50的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于所述异源多核苷酸的整合而缺失。

53.权利要求51的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞不能产生被破坏的基因的蛋白质产物。

54.权利要求52的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞不能产生缺失基因的蛋白质产物。

55.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在宿主细胞中存在于染色体外质粒中。

56.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸随机整合进入宿主细胞的基因组。

57.权利要求47-56的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木聚糖发酵成乙醇。

58.一种发酵液，其包含：

(a)能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和

(b)培养基，其中所述培养基包含木聚糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。

59.权利要求58的发酵液，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。

60.一种共培养物，其包含权利要求47-56的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞。

61.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达相同的木聚糖代谢酶。

62.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达不同的木聚糖代谢酶。

63.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达至少一种共同的木聚糖代谢酶。

64.发酵木聚糖的方法，其包含：

温育反应混合物，所述反应混合物包含：

(a)生物质，其中所述生物质包含木聚糖；和

(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木聚糖。

65.权利要求64的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。

66.产生一种或多种木聚糖发酵产物的方法，其包括：

温育反应混合物，所述反应混合物包含：

(a)生物质，其中所述生物质包含木聚糖；和

(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木聚糖以产生一种或多种木聚糖发酵产物。

67.权利要求66的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。

68.权利要求66的方法，其中所述一种或多种木聚糖发酵产物包括乙醇。

69.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:5-21的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列。

70.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:5-21的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一性的核苷酸序列。

71.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:5-21的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。

72.权利要求69的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。

73.权利要求70的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。

74.权利要求71的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。

75.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列。

76.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一性的核苷酸序列。

77.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。

78.权利要求75的重组热纤梭菌，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:51-62的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。

79.权利要求76的重组热纤梭菌，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:51-62的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。

80.权利要求77的重组热纤梭菌，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:51-62的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。

81.一种共培养物，其包含权利要求1-35的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种权利要求69-80的任一项的其它重组热纤梭菌宿主细胞。

82.权利要求1-35的任一项的第一重组热纤梭菌宿主细胞，其通过在包含木糖作为唯一糖源的培养基上生长10代以产生第二重组热纤梭菌宿主细胞来进行选择，所述第二重组热纤梭菌宿主细胞比未经历所述选择的在其它方面相同的细胞更高效地利用木糖。

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