CN115851552A - 棘孢曲霉Aa-1及其在烟叶提质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘孢曲霉Aa‑1及其在烟叶提质中的应用，本发明棘孢曲霉Aa‑1在以烟叶为主要碳源的培养基中培养，发现其能够利用烟叶原料进行生长，并分泌多种胞外生物酶组分，包括纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶酶、葡萄糖苷酶等，分解烟叶中的生物质大分子产生水溶性总糖。该菌种发酵液可有效提高烟丝的水溶性总糖浓度，增加多种产香物质的含量，并降低烟碱含量，可有效提高烟叶原料的香气质、回甜感和细腻性，降低烟叶刺激性，可较为明显的改善烟叶原料的品质。棘孢曲霉的发酵液制备中以麸皮和烟杆为碳源，利用了废弃生物质资源，成本较低，发酵工艺简单。
Description
(一)技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株棘孢曲霉Aa-1及其在烟叶提质中的应用。
(二)背景技术
消费者对卷烟产品消费需求的变化影响烟草工业对烟叶原料的需求结构，目前烟草工业企业越来越倾向采购香味风格突出的优质烟叶原料，而香味风格较弱、质量较差的烟叶大量积压成为库存烟叶，给企业在仓储、资金和保证烟叶品质等方面造成了持续压力。开发旨在提升低档次烟叶品质的技术，满足品质卷烟的配方需求，成为整个烟草行业亟需解决的难题之一。
烟叶的品质本质上是由烟叶内部化学成分所决定的。通过添加香精香料，可以改善低档次烟叶原料的香气特征，但烟叶本身固有的化学成分不协调难以改善。烟叶的醇化过程可以协调烟叶的内在化学比例，但是需要的周期长、且受环境条件的制约，效果不稳定。微生物在烟叶的醇化过程中其中较为重要的作用，其分泌生物酶可以起到分解、协调烟叶原料化学组分的效果，同时生成的某些次级代谢产物又能有效丰富烟叶的香气质，因此发掘对烟叶原料有提质效果的微生物资源对于烟叶品质缓解烟叶原料的结构性矛盾有重要意义。
目前微生物对烟叶提质的报道多集中于细菌和酵母菌，曲霉属能够分泌多种复合生物酶系，同时也是多种风味食品常用到的发酵菌种，但其在烟叶提质中的应用效果鲜有报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种棘孢曲霉Aa-1及其在烟叶提质中的应用，该棘孢曲霉Aa-1能够利用烟叶原料进行生长，并分泌多种胞外生物酶组分。将该菌株在发酵培养基中进行培养，并用发酵液喷施烟丝，可有效提高烟丝的水溶性糖浓度，增加多种产香物质的含量，降低烟碱含量，增加烟叶的香气质，提高烟叶原料的回甜感和细腻性，降低烟叶刺激性，可较为明显的改善烟叶原料的品质。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种新菌株--棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2022年11月14日，保藏编号CGMCCNo.40424，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
本发明还提供一种所述棘孢曲霉Aa-1在烟叶提质中的应用，所述的应用为：将棘孢曲霉Aa-1发酵培养的发酵产物离心(优选以转速10000rpm离心10分钟)，后收集上清液，过膜(优选膜孔径0.22μm)除菌后，获得发酵液；将发酵液与pH 4-6的缓冲液混合，获得混合发酵液；将混合发酵液喷施至烟叶或烟丝表面，均匀混合后于30-60℃条件下密封放置2-5天(优选50℃、3天)，灭活生物酶(优选80℃烘烤10分钟)，获得提质的烟叶或烟丝；所述提质包括提高烟丝的水溶性总糖浓度，增加多种产香物质的含量，降低烟碱含量，提高烟叶原料的香气质、回甜感和细腻性，降低烟叶刺激性。
优选的，所述缓冲液为0.2M pH 4.8的乙酸钠缓冲液。
优选的，所述发酵液与缓冲液体积比为5-15:1，优选9:1。
优选的，所述发酵液蛋白浓度为0.5～1mg/mL，所述混合发酵液喷施量为100-300mL/kg，优选200mL/kg。
优选的，所述发酵液按如下方法制备：(1)将棘孢曲霉Aa-1接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于28～30℃条件下生长4～6天，待平板长满孢子后，用生理盐水收集孢子，获得棘孢曲霉孢子液；马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成：200g/L土豆，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；
(2)将棘孢曲霉Aa-1孢子液按终浓度105～106个/毫升添加至发酵培养基中，28～30℃、150～200rpm条件下发酵5～6天，待蛋白浓度达到0.50～0.60mg/mL时，将发酵产物以转速10000rpm离心10分钟，后收集上清液，过0.22μm的膜除菌后，获得发酵液；发酵培养基质量组成：30g/L麸皮，10g/L的烟杆粉末，20g/L微晶纤维素，15g/L豆饼粉，2g/L硫酸铵，5g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，溶剂为水，pH自然。
优选的，所述烟叶或烟丝包括低等级上部烟叶、糖碱比失衡烟叶或需要增香提质的烟叶等。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1)本发明通过对烟叶中的微生物进行分离，筛选到一株棘孢曲霉Aa-1，将该棘孢曲霉Aa-1在以烟叶为主要碳源的培养基中培养，发现其能够利用烟叶原料进行生长，并分泌多种胞外生物酶组分，包括纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、果胶酶、葡萄糖苷酶等，分解烟叶中的生物质大分子产生水溶性总糖。
2)该菌种发酵液可有效提高烟丝的水溶性总糖浓度，增加多种产香物质的含量，并降低烟碱含量，可有效提高烟叶原料的香气质、回甜感和细腻性，降低烟叶刺激性，可较为明显的改善烟叶原料的品质。
3)棘孢曲霉Aa-1的发酵液制备中以麸皮和烟杆为碳源，利用了废弃生物质资源，成本较低，发酵工艺简单。
(四)附图说明
图1为棘孢曲霉Aa-1在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的菌落形态图。
图2为棘孢曲霉Aa-1发酵液中生物酶活性测定曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用烟叶原料为湖北烟叶，该烟叶具有高烟碱、高氮、低糖的特点。所述室温为25-30℃。
本发明所用马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成：200g/L土豆，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然。配制方法为：取新鲜马铃薯200g，洗净去皮切成小块，加水煮沸20～30min，四层纱布过滤，加入葡萄糖20g、琼脂15g，继续加热搅匀，冷却后加水补足至1000mL。
实施例1、棘孢曲霉Aa-1的筛选及鉴定
1、菌株Aa-1筛选
(1)醇化烟叶
将打叶复烤后的烟叶原料装箱后放于醇化室，醇化室常年温度不超过32℃，湿度控制在55％～65％，放置醇化两年左右，获得醇化烟叶。
(2)初筛
将步骤(1)醇化烟叶和生理盐水按质量比1:1配比混合，后置于室温条件下，150～200rpm摇床振荡10分钟，后取上清液，用生理盐水稀释10倍，将稀释液涂布至马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，后置于28～30℃培养箱中培养2～4天。
(3)复筛
将步骤(2)马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落形态较大，长有气生菌丝、表面有分生孢子附着的菌种孢子收集于生理盐水中，并涂布在马铃薯葡萄糖琼脂平板上，在28～30℃培养箱中培养2～4天进行划线分离纯化，得到单菌落，记为菌株Aa-1。
2、菌株鉴定
(1)菌落特征：将步骤1筛选菌株Aa-1接种至马铃薯葡萄糖琼脂平板上，在28～30℃培养箱中培养2～4天，菌落气生菌丝呈白色，顶端长有黑色孢子(图1)。
(2)ITS序列
将步骤1筛选菌株Aa-1接种至葡萄糖液体培养基中，28～30℃振荡培养1-2天，离心收集菌体。葡萄糖液体培养基质量配方为：20g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，2g/L硫酸铵，5g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，溶剂为水，pH自然。
采用研磨法提取离心收集菌体的基因组，测定其ITS序列(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，并与NCBI数据库进行比对后，鉴定得到菌株Aa-1属于棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)，命名为棘孢曲霉Aa-1，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2022年11月14日，保藏编号CGMCCNo.40424。
SEQ ID NO.1
CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAATCTGAG
AAGATTGGGGGTCGAGGCAAGCCCCGGCCGGGCCCATAGAGCGGGTGACAGAGCCCCATAC
GCTCGAGGACCGGACGGTGCCGCCGTTTCTCTCGAGGCCCGCCCCCGGGGGGGCGCGGCCC
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CAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTT
ATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGA
CTGATTGGTATCAATCGACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCCATTGGGGTCTCCGG
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GGTACGGTAAGCACGGGTGGGAGGTTGGGCCCCGAAGGACCCAGCACTCGGTAATGATCCT
TCCGCAGGTTCACCTACGGA
实施例2、棘孢曲霉Aa-1发酵液的制备
将棘孢曲霉Aa-1接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(组成同实施例1)上，于28～30℃条件下生长4～6天，待平板长满孢子后，用生理盐水收集孢子，获得棘孢曲霉Aa-1孢子液。
将棘孢曲霉Aa-1孢子液按终浓度105～106个/毫升浓度添加至发酵培养基中，28～30℃、150～200rpm条件下发酵5天。将发酵产物以转速10000rpm离心10分钟，后收集上清液，过0.22μm的膜除菌后，获得发酵液。采用Bradford方法检测发酵液中蛋白浓度，所得发酵液中蛋白浓度为0.7mg/mL。
发酵培养基质量组成：30g/L麸皮，10g/L的烟杆粉末，20g/L微晶纤维素，15g/L豆饼粉，2g/L硫酸铵，5g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，溶剂为水，pH自然。
实施例3、棘孢曲霉Aa-1发酵液多种生物酶活性的测定
将实施例2中发酵培养5天获得的发酵液分别测定纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶及β-葡萄糖苷酶等生物酶活性，结果见图2，说明棘孢曲霉发酵液中有多种生物酶组分。
酶活力单位定义为：底物反应后每分钟水解产生1μmol产物(葡萄糖、木糖、对硝基苯酚)所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g(化学纯)，加水500mL。搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL 0.2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
纤维素酶活力测定：向1.5mL pH 4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液里加入50mg的Whantman No.1滤纸作为反应底物，加入待测发酵液0.5mL，于50℃条件下反应60min。向体系中加入3mL DNS试剂，煮沸10分钟显色。取200μL反应液于OD 540波长下读取数值。
淀粉酶活力测定：向1.5mL质量浓度1％的淀粉水溶液(底物)里加入待测发酵液0.5mL，于40℃条件下反应10min。向体系中加入3mL DNS试剂，煮沸10分钟显色。取200μL反应液于OD 540波长下读取数值。
木聚糖酶活力测定：向1.5mL质量浓度1％的木聚糖水溶液(底物)里加入待测发酵液0.5mL，于50℃条件下反应30min。向体系中加入3mL DNS试剂，煮沸10分钟显色。取200μL反应液于OD 540波长下读取数值。
果胶酶酶活力测定：向1.5mL质量浓度1％的苹果果胶水溶液(底物)里加入待测发酵液0.5mL，于50℃条件下反应15min。向体系中加入3mL DNS试剂，煮沸10分钟显色。取200μL反应液于OD 540波长下读取数值。
阿拉伯呋喃糖苷酶酶活力测定：向50μL质量浓度0.1％的对硝基苯-α-阿拉伯呋喃糖苷水溶液中加入待测发酵液100μL，于50℃条件下反应30min。向体系中加入150μL质量浓度10％ Na2CO3水溶液中止反应并显色。取200μL反应液于OD 405波长下读取数值。
β-葡萄糖苷酶活力测定：向50μL质量浓度0.1％的对硝基苯-β-葡萄糖苷水溶液中加入待测发酵液100μL，于50℃条件下反应30min。向体系中加入150μL质量浓度10％ Na2CO3水溶液中止反应并显色。取200μL反应液于OD405波长下读取数值。
实施例4、棘孢曲霉Aa-1发酵液处理烟叶的效果评价
将实施例2方法获得的棘孢曲霉Aa-1发酵液与0.2M pH 4.8的乙酸钠缓冲液以9：1的体积比混合，获得混合发酵液；将混合发酵液以200mL/kg的添加量喷施至烟丝表面，均匀混合后将低次烟叶烟丝装入自封袋后于50℃条件下放置3天，后将烟叶80℃烘烤10分钟灭活生物酶。将烟丝晾制待含水量约为12.5％后卷制成卷烟烟支，放于温度20℃、湿度60％的恒温恒湿箱平衡水分48小时，即为棘孢曲霉发酵液处理的烟支。由7名评吸专家组成评吸小组，参照烟草行业标准YC/T 415 2011烟草在制品的感官评价方法，对实施例5棘孢曲霉发酵液处理的烟支的烟丝进行感官评吸。以未处理的低次烟叶烟丝为对照。
表1专家对烟丝的感官评价打分结果。
专家对棘孢曲霉发酵液喷施的烟丝进行感官评吸后认为棘孢曲霉处理的烟丝品质有良好的提升效果。在香气特征方面，与对照相比，棘孢曲霉处理组能提升烟丝的香气质和香气量，减少杂气；在烟气特征方面，与对照相比，棘孢曲霉处理组能增加烟丝的细腻程度；在口感特征方面，与对照组相比，棘孢曲霉处理组能有效降低烟丝的刺激性和干燥感，增加口感的干净度和回甜感。
实施例5、棘孢曲霉发酵液处理烟叶的化学成分测定
分别参照烟草行业标准YC/T 34 1996、YC/T 161-2002、YC/T 217-2007、YC/T162-2011、YC/T159-2019测定实施例4棘孢曲霉发酵液处理的烟支(处理组)及未处理的低次烟叶烟丝(对照组)的化学成分，包括烟碱、总氮、钾、氯、水溶性糖指标，结果见表2。
表2烟丝化学成分测定。
水溶性还原糖可作为美拉德反应的前体物质，对烟叶产香有较为积极的影响。此外，一般认为烟碱含量对烟叶品质有负面影响，烟碱的降低利于烟叶原料品质的提高。经棘孢曲霉发酵液处理可增加烟叶的水溶性糖浓度，并显著降低烟碱含量。
实施例6、棘孢曲霉发酵液处理烟叶的致香成分测定
采用顶空固相微萃取-气质联用技术对实施例4棘孢曲霉发酵液处理的烟支的烟丝样品的致香成分进行测定，具体如下：
前处理：称取200mg的烟末，转至进样瓶中，加入20μL0.02 mg/mL的葵酸乙酯，用于HS-SPME-GC-MS分析。
萃取：50℃恒温条件下，50/30μm DVB/CAR on PDMS萃取头插入样品顶空部分，顶空萃取30min，于250℃下解析5min，然后进行GC-MS分离鉴定。
色谱条件：DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，载气为高纯氦气(纯度不小于99.999％)，恒流流速1.0mL/min，进样口温度260℃，不分流进样，溶剂延迟1.5min。程序升温：40℃保持3min，以5℃/min升至220℃，保持5min。
质谱条件：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN)，质量扫描范围：m/z 20-650。
表3烟丝中芳香化合物的积累情况。
经棘孢曲霉发酵液处理，烟叶原料中的多种香气物质增加，其中包括多种酮类、酸类、醛类、芳香类和醇类致香成分。增加的酸性致香成分中，异戊酸具有甜润的果香味，而苯甲酸多用于香精香料；增加的酮类致香成分中，大马士酮具有玫瑰芳香味，1,3,7,7-四甲基-2-氧杂双环[4.4.0]-5-葵烯-9-酮可赋予香料烟香韵，茄酮可增加烟草香；增加的醛类致香成分中，3-糠醛多用于香料，5-羟甲基糠醛有甘橘花香味，而5-甲基呋喃醛有焦糖香味；增加的芳香类致香成分中，麦芽酚多用于香料，而间二甲苯具有芳香气味。多种香气物质含量的增加，可赋予烟叶原料更丰富的香气质。
Claims (10)
1.棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)Aa-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2022年11月14日，保藏编号CGMCC No.40424，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
2.一种权利要求1所述棘孢曲霉Aa-1在烟叶提质中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将棘孢曲霉Aa-1发酵培养的发酵产物离心，后收集上清液，过膜除菌后，获得发酵液；将发酵液与pH 4-6的缓冲液混合，获得混合发酵液；将混合发酵液喷施至烟叶或烟丝表面，均匀混合后于30-60℃条件下密封放置2-5天，灭活生物酶，获得提质的烟叶或烟丝。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述过膜的孔径为0.22μm。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为0.2M pH 4.8的乙酸钠缓冲液。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液与缓冲液体积比为5-15:1。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，密封放置条件为50℃、3天；灭活生物酶是在80℃烘烤10分钟。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液蛋白浓度为0.5～1mg/mL，所述混合发酵液喷施量为100-300mL/kg。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵液按如下方法制备：(1)将棘孢曲霉Aa-1接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，于28～30℃条件下生长4～6天，待平板长满孢子后，用生理盐水收集孢子，获得棘孢曲霉Aa-1孢子液；马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成：200g/L土豆，20g/L葡萄糖，15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然；
(2)将棘孢曲霉Aa-1孢子液按终浓度105～106个/毫升添加至发酵培养基中，28～30℃、150～200rpm条件下发酵5～6天，待蛋白浓度达到0.50～0.60mg/mL时，将发酵产物以转速10000rpm离心10分钟，后收集上清液，过0.22μm的膜除菌后，获得发酵液；发酵培养基质量组成：30g/L麸皮，10g/L的烟杆粉末，20g/L微晶纤维素，15g/L豆饼粉，2g/L硫酸铵，5g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁，溶剂为水，pH自然。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述烟叶或烟丝包括低等级上部烟叶、糖碱比失衡烟叶或需要增香提质的烟叶。
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