CN105907649A - 一种降解烟草梗丝果胶和纤维素的真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种降解烟草梗丝果胶和纤维素的真菌及其应用，公开了一株微生物菌株及其应用，具体涉及一种塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501，CCTCC NO：M2014425及其在烟草中的应用，属于生物工程领域。本发明所公开的菌株其粗酶液可以降解梗丝中的果胶和纤维素，增加梗丝的烟香。按梗丝重量的0.01％‑0.5％称取该菌株的粗酶液用无菌蒸馏水或者0.1‑0.2mol/L pH5.2的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的发酵液均匀喷洒到梗丝中，使梗丝的含水量达到30‑40％，然后将梗丝置于30‑40℃条件下发酵12‑48小时。梗丝发酵后果胶的含量减少了8.2‑50.3％，梗丝中纤维素的含量减少了2.2‑11.5％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，显著提高了梗丝的感官质量和可用性。

Description

一种降解烟草梗丝果胶和纤维素的真菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株微生物菌株及其应用，具体涉及一种塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501及其在烟草中的应用，属于微生物应用技术领域。
背景技术
烟梗作为烟草原料的一种,是目前卷烟生产企业无法完全消化的低质原料,但又是一种富含多种化学成分包括多种有效天然成分的自然资源。烟梗目前主要用于制备成梗丝以及烟草薄片,然后再将梗丝和薄片搀兑到叶组中，用于卷烟的生产。
梗丝在卷烟配方中起着重要的作用，是减害降焦的主要手段之一。一方面，梗丝能降低卷烟焦油、烟碱和CO等有害成分的含量，从而降低卷烟的危害；另一方面，梗丝能提高烟丝的填充值，降低卷烟的单箱耗丝量，从而降低生产成本。由于梗丝中的细胞壁物质(果胶、纤维素、半纤维素和木质素等)含量较多而香味物质含量很少，感官品质存在刺激性大、杂气重、香气质量较差的缺点，在形态及色泽方面与叶丝也存在着较大差异。因此，梗丝更多的是使用在低档卷烟中，在高档卷烟中不使用或用量很少，在卷烟中的掺配比例也比较低，导致每年都有大量烟梗废弃。随着减害降焦工作的不断推进，对梗丝的需求量越来越大，对梗丝的质量要求也越来越高，改善梗丝的质量具有重要的意义。
近年来，为了提高梗丝的质量，许多科技人员从工艺技术、化学方法以及生物方法等不同角度对梗丝进行了研究。其中，生物方法由于反应条件温和、反应专一以及成本低等特点而备受关注，成为提高梗丝质量研究的重要研究方向。从自然界筛选能有效降解烟梗细胞壁物质的微生物，利用微生物产生的酶处理烟梗，降解其中的大分子物质，能一定程度上提高烟梗口感，具有广阔应用前景。
纤维素和果胶是梗丝两种主要的细胞壁成分，能使梗丝在燃烧过程中产生木质气，严重影响梗丝的质量。特别是果胶，是梗丝产生木质气的主要原因之一。本发明从广西梧州六堡茶中筛选出一株优势菌株，经鉴定为塔宾曲霉。该菌株在发酵过程中可以产生特殊的香气，能分泌纤维素酶和果胶酶等生物酶，降解梗丝中的果胶、纤维素等物质，从而减少梗丝的木质气，增加梗丝的香气，大大提高了梗丝的质量和可用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解烟草梗丝细胞壁物质的产香真菌塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501，保藏号为CCTCC NO：M2014425，及其相应的培养条件并公开一种利用微生物发酵降解梗丝中的果胶和纤维素提高梗丝可用性的方法。
本发明通过如下方案实现：
一种微生物菌株,其特征在于：它为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501，保藏号为CCTCC NO：M2014425；具红褐至褐黑色的菌落，较长的分生孢梗茎和较小的分生孢子。 菌落在查氏酵母膏琼脂上生长很快，25℃7天直径65-70mm，平坦，在边缘有时具白色的菌丝体；质地丝绒状；分生孢子结构大量，淡褐至褐黑色；无渗出液；菌落反面淡黄褐色至黄褐色。菌落在麦芽汁琼脂上生长最快，25℃7天直径70-75mm；平坦；质地丝绒状，具少量的不育性过度生长；分生孢子结构大量，淡褐色褐黑色；无渗出液；菌落反面黄褐色。
所述菌株通过如下途径获得：
首先利用富集培养基从广西梧州产的六堡茶中分离出微生物菌株；
其次将获得的微生物菌株用平板分离培养基进行筛选，获得真菌菌株；
然后将得到的菌株用复筛培养基筛选能够产生果胶酶和纤维素酶的菌株，即塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501。
所述富集培养基为：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，水1000mL，pH值7.0。
所述平板分离培养基为：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，15g琼脂粉，水1000mL。
所述复筛培养基为：50g梗丝，1000mL水。
所述菌株的培养步骤为：
1、种子培养：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，15g琼脂粉，水1000mL，在无菌环境将冷冻保藏的菌种接种到培养基上，在28℃培养7天。
2、摇瓶培养：5g梗丝，加蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10～30v/v％，摇床转速为150rpm，在无菌环境用接种环从种子培养平板取一环孢子，接入发酵培养基中，在28℃培养48h。
3、粗酶液的制备：将摇瓶培养好的发酵液用8层无菌纱布过滤，得到滤液即为粗酶液。
所述梗丝的发酵方法为：
按梗丝重量的0.01％-0.5％称取该菌株的粗酶液用无菌蒸馏水或者0.1-0.2mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的发酵液均匀喷洒到梗丝中，使梗丝的含水量达到30-40％，然后将梗丝置于30-40℃条件下发酵12-48小时。梗丝发酵后果胶的含量减少了8.2-50.3％，梗丝中纤维素的含量减少了2.2-11.5％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，显著提高了梗丝的感官质量和可用性。
已于2014年9月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M2014425。保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，邮政编码430072。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明来改善梗丝原料的品质，工艺过程简单，反应条件温和；经过处理后，梗丝的果胶含量降低，刺激性明显减少，烟气柔和，烟香增加，梗丝的可用性明显提高。该方法 具有简单实用，成本低廉等特点，可望在工业上推广应用。
具体实施方式
以下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
种子培养：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，15g琼脂粉，水1000mL，在无菌环境将冷冻保藏的菌种接种到培养基上，在28℃培养7天。
摇瓶培养：5g梗丝，加蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10-30v/v％，摇床转速为150rpm，在无菌环境用接种环从种子培养平板取一环孢子，接入发酵培养基中，在28℃培养48h。
粗酶液的制备：将摇瓶培养好的发酵液用8层无菌纱布过滤，得到滤液即为粗酶液。粗酶液气味芳香，果胶酶活力达到471U/mL，纤维素酶活力达到218U/mL。
实施例2
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液1.5μg用3.9mL蒸馏水稀释,装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，使梗丝的含水量达到30％，然后将梗丝放入30℃培养箱发酵24h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了8.2％，梗丝中纤维素的含量减少了2.2％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。
实施例3
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液7.5μg用7mL蒸馏水稀释,装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，使梗丝的含水量达到40％，然后将梗丝放入30℃培养箱发酵36h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了11.3％，梗丝中纤维素的含量减少了3.6％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。
实施例4
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液7.5μg用0.1mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液7mL稀释,使梗丝的含水量达到40％，装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，然后将梗丝放入35℃培养箱发酵24h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了23.9％，梗丝中纤维素的含量减少了5.4％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。
实施例5
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液15μg用0.2mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液11.4mL稀释,使梗丝的含水量达到50％，装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，然后将梗丝放入35℃培养箱发酵48h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了38.3％，梗丝中纤 维素的含量减少了8.3％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。
实施例6
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液4.5μg用0.1mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液11.4mL稀释,装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，使梗丝的含水量达到50％，然后将梗丝放入40℃培养箱发酵12h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了11.6％，梗丝中纤维素的含量减少了3.9％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。
实施例7
称取15g梗丝，取实施例1制备的粗酶液75μg用0.2mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液11.4mL稀释,装入微量喷雾器喷均匀喷洒到梗丝上，使梗丝的含水量达到50％，然后将梗丝放入35℃培养箱发酵48h。经过发酵后，梗丝中果胶的含量减少了50.3％，梗丝中纤维素的含量减少了11.5％，梗丝的木质气减少，刺激性降低，烟气变醇和，烟香增加，感官质量明显改善。

Claims (7)

1.一种微生物菌株,其特征在于：所述微生物菌株为塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501，保藏号为CCTCC NO：M2014425；具红褐至褐黑色的菌落，菌落反面淡黄褐色至黄褐色；较长的分生孢梗茎和较小的分生孢子；菌落在查氏酵母膏琼脂上生长很快，25℃培养7天直径65-70mm；菌落在麦芽汁琼脂上生长最快，25℃培养7天直径70-75mm。
2.如权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于：所述菌株通过如下途径获得：
首先从广西梧州产的六堡茶中分离出微生物菌株；其次将获得的微生物菌株用平板分离培养基进行筛选，获得真菌菌株；然后将得到的菌株用复筛培养基筛选能够产生果胶酶和纤维素酶的菌株，即塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501。
3.如权利要求2所述的微生物菌株，其特征在于：
所述富集培养基为：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，水1000mL，pH值7.0；
所述平板分离培养基为：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，15g琼脂粉，水1000mL；
所述复筛培养基为：50g梗丝，1000mL水。
4.如权利要求1或2所述的微生物菌株，其特征在于：所述菌株的培养步骤为：
(1)、种子培养：1g K2HPO4·3H2O，0.5g MgSO4·7H2O，3g NH4NO3，32g NaCl，20g蔗糖，15g琼脂粉，水1000ml，在无菌环境将冷冻保藏的菌种接种到培养基上，在28℃培养7天；
(2)、摇瓶培养：5g梗丝，加蒸馏水100ml，高压蒸汽灭菌；摇瓶装液量为10～30v/v％，摇床转速为150rpm，在无菌环境用接种环从种子培养平板取一环孢子，接入发酵培养基中，在28℃培养48h。
5.如权利要求4所述的微生物菌株，其特征在于：所述菌株的培养步骤还包括：
(3)、粗酶液的制备：将摇瓶培养好的发酵液用8层无菌纱布过滤，得到滤液即为粗酶液。
6.如权利要求1-5任一所述的微生物菌株的应用，其特征在于：所述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501用于降解梗丝中的果胶和纤维素。
7.如权利要求6所述的微生物菌株的应用，其特征在于：所述塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501用于降解梗丝中的果胶和纤维素，通过如下步骤获得：
(1)、将权利要求1所述的塔宾曲霉Aspergillus tubingensis GYC501进行发酵培养，获得粗酶液；
(2)、按梗丝重量的0.01％-0.5％称取步骤(1)所得的粗酶液用无菌蒸馏水或者0.1-0.2mol/L pH5.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行稀释，将稀释后的发酵液均匀喷洒到梗 丝中，使梗丝的含水量达到30-50％，将梗丝置于30-40℃条件下发酵，发酵时间12-48小时。
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