CN109136100B - 一株塔宾曲霉菌株及在发酵青砖茶上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及塔宾曲霉菌及在发酵青砖茶上的应用，属于微生物发酵技术应用领域。本发明的菌株为塔宾曲霉菌，命名为xingding‑1，保藏编号为CCTCC M 2017242；保藏时间为2017年5月5日；属于曲霉属真菌；其应用为发酵生产青砖茶。采用本发明的塔宾曲霉菌xingding‑1发酵青砖茶的方法为：液态培养塔宾曲霉菌xingding‑1，收集该真菌孢子，投放到青砖茶发酵茶堆中，控制温度、湿度进行发酵。本发明发酵青砖茶的方法，与传统青砖茶发酵方法相比，茶产品口感基本相似，发酵周期短，大大提高生产率。

Description

一株塔宾曲霉菌株及在发酵青砖茶上的应用
技术领域
本发明涉及塔宾曲霉菌的应用及其发酵青砖茶的方法，属于微生物发酵技术 应用领域。
背景技术
青砖茶是湖北特产黑茶之一，是利用发酵湿热作用与微生物转化共同作用产 生茶叶内质变化，其发酵周期长，品质特征突出。而相对于其它黑茶，青砖茶发 酵更充分，口感更加醇和，陈香凸显明显。
湖北青砖茶采用晒毛青叶为原料，经过发酵，成化，蒸压，烘干等程序制成。 其中发酵过程是决定青砖茶风味的关键过程。在前人对黑茶的研究中可知，发酵 过程的控制对改变茶的品质具有非常关键的作用。
根据前人研究发现，发酵过程中，影响茶叶品质风味形成的微生物主要有真 菌、酵母、细菌、放线菌等，其中丝状真菌为优势菌株，在发酵过程中起到重要 作用。
塔宾曲霉属于半知菌纲，在土壤中广泛存在，在青砖茶发酵生产中还未见发 现报道。在青砖茶的自然发酵过程中，本菌的过度生长会造成茶叶变质，因此， 在本发明中对本菌的定量添加以及适度控制发酵条件都做了限定，按照本方法可 以实现应用本菌完成青砖茶的发酵过程。
发明内容
本发明目的在于分离纯化一种可用于青砖茶发酵的塔宾曲霉菌株，以及该菌 株应用于青砖茶发酵的方法。
本发明从青砖茶发酵茶堆中分离纯化一株菌株；是丝状真菌。经鉴定，该菌 株是一种塔宾曲霉菌株(Aspergillus tubingensis)；命名为塔宾曲霉菌xingding-1； 保藏于中国典型培养物包藏中心；保藏编号为CCTCC M 2017242；保藏时间为 2017年5月5日。
本发明的塔宾曲霉菌xingding-1能够用于青砖茶的发酵生产。
采用本发明的塔宾曲霉菌xingding-1发酵生产青砖茶的方法为：液态培养塔宾曲霉菌xingding-1，富集其孢子制成孢子悬液并计数。按照每斤晒毛青茶投放十万 真菌孢子的比例进行接种。
具体采用塔宾曲霉菌菌株Aspergillus tubingensis xingding-1发酵青砖茶的方法如 下：
(1)斜面培养：塔宾曲霉菌xingding-1接种于斜面培养基上培养，得斜面菌株；
(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，得到种子 培养液；
(3)茶叶发酵：选取绿毛茶洒水至含湿量为20-30％，接种步骤(2)中收获的 菌种孢子后进行发酵，发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃， 湿度为90％，发酵3至4天以后，待茶堆温度升到47℃时，进行翻堆，翻堆后 茶堆会继续生长白色菌丝体，并伴随温度上升，待温度升到50-55℃时，茶叶颜 色全部转化成暗褐色，散发出酵香时，停止；
(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸后的茶叶放入成型装置成型， 成型后自然凉置，凉置时间为35-45小时，完成青砖茶散茶的制作。
所述的步骤(1)中，塔宾曲霉菌xingding-1接种于斜面培养基上，在28℃下培 养48小时，得斜面菌株；所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、 马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然pH，115℃灭菌20min。
所述的步骤(2)中，取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、 28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液；所用种子培养基，每1L中 含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，115℃灭 菌20min。
所述的步骤(3)中，绿毛茶洒水至含湿量为25％；接种步骤2中收获的菌种孢 子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵；发酵环境为无尘无污染恒温 培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％。
所述的步骤(4)中，将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min。
有益效果：
1、首次分离培养出能够用于青砖茶发酵生产的真菌菌株塔宾曲霉菌 xingding-1；
2、本发明利用真菌发酵方式生产青砖茶，大大缩短了青砖茶发酵周期，提 高生产效率；
3、本发明应用外加特定培养真菌菌株的方法，使发酵过程快速形成特定优 势菌群，应用于发酵生产青砖茶，生产方式具有新意。
保藏说明
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
地址：中国.武汉.武汉大学
保藏日期：2017年5月5日
保藏编号：CCTCC NO：M 2017242
分类命名：塔宾曲霉Aspergillus tubingensis xingding-1
附图说明
图1：本发明塔宾曲霉菌xingding-1在显微镜下形态特征；
图2：本发明塔宾曲霉菌xingding-1在PDA平板上正面的形态；
图3：本发明塔宾曲霉菌xingding-1在PDA平板上反面的形态；
图4：添加塔宾曲霉菌xingding-1发酵青砖茶茶堆样。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂活仪器为注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明所述的塔宾曲霉菌菌株分离自青砖茶生产渥堆工艺中正处于渥堆发酵中期的渥堆、有真菌菌丝生发的茶叶，即渥堆温度达到48-55℃时分离得到的菌株。
真菌分离步骤为：取5g发酵中期带有菌丝的茶样，浸入95ml无菌水中，之后 从中取1ml液体做梯度稀释到10-5，稀释完成后从中取200微升涂布于PDA平板 上培养3-5天，挑取菌落进一步纯化培养，即可得到本申请所述的塔宾曲霉菌菌 株。
发酵中期中分离菌株的优势在于：首先，发酵中期茶堆的温度最高，茶叶品质 转化最为明显，因此是茶叶内质转化的关键时期，此时分离的菌株是促进茶叶品 质形成的关键菌株；其二，由于发酵中期茶堆温度很高，不适宜大部分微生物的 生长繁殖，因此分离菌株的工作相对容易完成，分离到合适菌株的可能性也大大 提升；其三，依据青砖茶传统发酵生产经验，青砖茶的发酵较适宜温度和湿度要 求为发酵中期，为满足后续菌株的生产应用，需要筛选出能够在高温高湿环境下 生长繁殖的菌株，因此选择在此阶段完成对菌株的分离筛选工作。
实施例2塔宾曲霉菌菌株xingding-1的形态学鉴定；
菌株xingding-1分离自青砖茶发酵茶堆，显微镜观察其形态如图1所示。分 别在查氏琼脂、查氏酵母琼脂、麦芽汁琼脂等培养基质上培养，培养温度28℃， 培养时间2-5d，观察形态。
查氏琼脂上菌落较为平坦，营养菌丝呈现较规则圆形，质地丝绒状，菌落正 反面均为白色，气生菌丝未见。察氏酵母琼脂上菌落为白色、中央为黑色，菌落 形态为较规则圆形，气生菌丝未见，与查氏琼脂相比，生长更快。麦芽汁琼脂上 菌落为白色，无气生菌丝，生长较查氏琼脂快，较察氏酵母琼脂慢。参照《真菌 鉴定手册》(加入进参考文献)对xingding-1菌株进行形态学比对，确定xingding-1 菌株为Aspergillus tubingensis属菌。
实施例3菌株xingding-1分子鉴定：
提取菌株基因组DNA，利用ITS1与ITS4通用引物对该基因组DNA进行聚合 酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定DNA序列，并利用美 国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 数据库进行菌株比对。
(1)18S rDNA序列分析：
ITS1rDNA引物序列：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
ITS4rDNA引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
扩增获得18SrDNA序列，序列全长594bp。将该扩增所得18SrDNA序列与 GeneBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，从NCBI上查出与菌株 xingding-1同源性较高的菌株为Aspergillus tubingensis stain(MF599710.1)，同源性 达到99％。
(2)LSU rDNA序列分析：
NL1rDNA引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'
NL4rDNA引物序列：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'
扩增获得28SrDNA序列，序列全长498bp。将该扩增所得28SrDNA序列与 GeneBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，查出与菌株xingding-1同 源性较高的菌株为Aspergillus tubingensis stain(KY670607.1)，同源性达到99％,因 此可以判定xingding-1为塔宾曲霉菌株。序列已经提交至NCBI上GeneBank数据 库(序列号为MG679475)。塔宾曲霉菌xingding-1于2017年保藏于中国典型培 养物保藏中心(武汉大学)；保藏编号为CCTCC M 2017242；此生物材料已经存 活实验测试并通过该实验。
实施例4利用塔宾曲霉菌株进行青砖茶发酵实验：
(1)斜面培养：塔宾曲霉菌xingding-1接种于斜面培养基上，在28℃下培 养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、 马铃薯200.0g、琼脂15g，蒸馏水余量，自然pH，115℃灭菌20min。
(2)发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、 28℃的条件下恒温震荡培养48h，得到种子培养液。所用种子培养基，每1L中 含有的成分为：葡萄糖20.0g、马铃薯200.0g、蒸馏水余量，自然pH，115℃灭 菌20min。
(3)茶叶发酵：选取三级绿毛茶洒水至含湿量为25％。接种步骤2中收获的菌 种孢子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵。发酵环境为无尘无污染 恒温培养箱渥堆，控制温度为25℃，湿度为90％。发酵3至4天以后，发酵真 菌在茶堆表面繁殖生长，茶叶叶片上可见白色菌丝体，同时伴随着茶堆温度上升， 待茶堆温度升到47℃时，进行翻堆，翻堆后茶堆会继续生长白色菌丝体，并伴 随温度上升，待温度升到53℃左右，茶叶颜色全部转化成暗褐色，散发出酵香 时，停止。
(4)茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为100℃，蒸制时间为3min， 得到汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为40小时， 完成青砖茶散茶的制作。
实施例5发酵青砖茶的审评：
对发酵茶的审评参照《茶叶感官审评方法》，从外形、汤色、香气、滋味等 方面对本实验发酵生产的茶叶与传统生产方式生产的青砖茶进行对比，结果如表 1。结果显示运用本方法发酵生产的茶与传统方法生产的青砖茶品质上并无太大 差异，说明本方法可以用于青砖茶的生产，且本方法用时更短，生产效率更高。
表1本发明生产青砖茶与传统青砖茶审评对比
Figure BDA0001772308860000051
Figure BDA0001772308860000061

Claims (7)

1. 一株塔宾曲霉菌菌株 (Aspergillus tubingensis) xingding-1，于 2017 年 5月 5 号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO: M 2017242，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。
2. 权利要求 1 所述的塔宾曲霉菌菌株(Aspergillus tubingensis) xingding-1 在发酵青砖茶上的应用。
3. 权利要求 2 所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）斜面培养：塔宾曲霉菌 xingding-1 接种于斜面培养基上培养，在 25-28℃下培养45-48 小时，得斜面菌株；
（2）发酵菌种扩大培养：取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在 150-175rpm、25-28℃的条件下恒温震荡培养 45-48h，得到种子培养液；
（3）茶叶发酵：选取绿毛茶洒水至含湿量为 20-30%，接种步骤（2）的菌种孢子后在 20-28℃及湿度为 85-95%下发酵 3-4 天，待茶堆温度升到 47℃时，进行翻堆，待温度升到50-55℃时，停止发酵；
（4）茶叶蒸制成型：将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸后的茶叶放入成型装置成型，成型后自然凉置，凉置时间为 35-45 小时，完成青砖茶散茶的制作。
4. 权利要求 3 所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所用斜面培养基，每 1L中含有的成分为：葡萄糖 15-20.0g、马铃薯 150-200.0g、琼脂 10-15g，蒸馏水余量，自然 pH 下经灭菌所得。
5. 权利要求 3 所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所用种子培养基，每 1L中含有的成分为：葡萄糖 15-20 .0g、马铃薯 150-200.0g、蒸馏水余量，自然 pH下经灭菌所得。
6. 权利要求 3 所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，绿毛茶洒水至含湿量为25%；接种步骤（2）中收获的菌种孢子，按照每斤茶投放十万真菌孢子的比例进行发酵；发酵环境为无尘无污染恒温培养箱渥堆，控制温度为 25℃，湿度为90%。
7. 权利要求 3 所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，将发酵好的茶叶汽蒸，汽蒸温度为 100℃，蒸制时间为 3min。
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