CN114292759A - 一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌。本发明提供的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，其保藏号为GDMCC No:62066。该菌株能够消除烟草土壤的连作障碍问题，增加连作烟田的烟草产量，提高经济效益。

Description

一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体涉及一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌。

背景技术

随着我国农业向规模化、集约化方向发展，连片种植和多年连续种植同一种作物是现代农业的基本形态，倒茬轮作愈来愈困难。多年连作引发了土壤微生态恶化、土传病虫害高发等一系列问题，使得农业连作障碍问题日益加剧，给农业生产带来巨大的危害和经济损失，严重制约我国农业的可持续发展。

连作障碍是指连续在同一土壤上栽培同种作物或近缘作物引起的作物生长发育异常。一般表现为生长发育不良、产量和品质下降、局部死苗等。连作障碍问题主要是由于长年连续栽培同一种作物，导致土壤中的病原菌高发。烟草的连作障碍问题成为制约烟草产业发展的重要因素，目前尚无理想的治理手段。以菌治菌是防治烟草连作障碍比较有前景的手段，筛选具有防治连作障碍功能的菌株是目前最主要的研究领域。

尖孢镰刀菌是很多植物的病原真菌，也是烟草根腐病的病原菌，此病在连作烟田中高发。镰刀菌引起植物感染，主要与镰刀菌中含有的致病因子有关。如果镰刀菌中不含有致病因子，则不会引起宿主得病，反而还有可能通过竞争性生长，抑制含有致病因子的尖孢镰刀菌和其它真菌的生长，从而达到防治烟草连作障碍的效果。

发明内容

一方面，本发明提供一株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，菌株号为Y④38，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏号为GDMCC No:62066，该菌株对连作引起的烟田连作障碍具有显著的防治作用。

本发明提供的菌株Y④38是从植物八角莲中分离所得。该菌株在PDA平板培养基上培养7天后，菌落突起絮状，菌丝白色质密且略带有紫色，菌落高3～5mm，菌落背面紫色加深，呈环状。其小型分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子呈镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖生或顶生，球形。

菌株Y④38具有序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的ITS序列。ITS(Internal Transcribed Spacer)是内转录间隔区，是位于真菌核糖体RNA(rRNA)基因转录区或对应多顺反子rRNA前体中大、小亚基rRNA之间的核酸序列，其长度和序列变化较大，可用于对真菌的种、属进行分类鉴定。序列比对结果显示，菌株Y④38的ITS序列与已知尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的ITS序列的同源性为99.60％。

所述尖孢镰刀菌的培养物也属于本发明的保护范围。所述培养物是将尖孢镰刀菌Y④38接种到固体培养基或液体培养基中培养得到的物质，包含菌体及其代谢产物。所述代谢产物是指尖孢镰刀菌Y④38在代谢过程中产生的多种代谢产物，包括初级代谢产物和次级代谢产物。

在本发明的一些实施例中，所述培养物是将所述尖孢镰刀菌接种到液体培养基中培养得到的发酵液。

本发明还提供一种菌剂，其特征在于，含有所述尖孢镰刀菌。所述菌剂可以包含载体；所述载体为固体载体或液体载体；所述固体载体可以是生物材料，例如秸秆、稻草、花生壳、麦麸；所述液体载体可以是水。所述菌剂中可以添加表面活性剂、稳定剂或pH调节剂。

在本发明的一些实施例中，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。所述固体菌剂可以是粉剂或颗粒剂。

本发明还提供所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括培养所述尖孢镰刀菌并将所述尖孢镰刀菌或其培养物制成菌剂。

在本发明的一些实施例中，所述菌剂为液体菌剂，其制备方法为：将所述尖孢镰刀菌接种于液体培养基中，培养得到的发酵液为液体菌剂，液体菌剂也可以用水稀释后使用。在本发明的另一些实施例中，所述菌剂为固体菌剂，其制备方法为：将所述尖孢镰刀菌接种于液体培养基中，培养得到发酵液，向发酵液中加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉。还在本发明的另一些实施例中，所述菌剂为固体菌剂，其制备方法为：将所述尖孢镰刀菌接种于液体培养基中，培养得到发酵液，将发酵液冷冻干燥后制成纯的菌粉。

所述尖孢镰刀菌或所述培养物或所述菌剂在防治烟草连作障碍中的应用也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明还提供一种防治烟草连作障碍的方法，其特征在于，向烟草根部施加所述尖孢镰刀菌或所述培养物或所述菌剂。

在本发明的一些实施例中，所述方法采用如下(1)－(6)中的任何一种方式施加所述尖孢镰刀菌：

(1)在土壤中挖出与烟苗根部大小相对应的栽培穴，放入烟苗，将所述尖孢镰刀菌的菌液浇在烟苗的根部，菌液用量为10ml-100ml/株，根据烟苗根部的大小进行调整，根部大则菌液用量大；

(2)将所述尖孢镰刀菌的菌液和任意比例的浇根用水混合后，在栽培烟草时浇入栽培穴中，或者是覆土后进行浇灌；

(3)将所述尖孢镰刀菌的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，在栽培烟草时将干燥的菌粉施用于烟草栽培穴中；

(4)将所述尖孢镰刀菌的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培烟草时浇入烟草的根部；

(5)将所述尖孢镰刀菌的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，在栽培烟草时将纯的菌粉施用于烟草栽培穴中；

(6)将所述尖孢镰刀菌的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培烟草时浇入烟草的根部。

在本发明的一些实施例中，所述菌液的制备方法如下：将所述尖孢镰刀菌接种于PDA液体培养基中，于120～150rpm，25～27℃培养2～7天。

在本发明的一些实施例中，所述PDA液体培养基的制备方法为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加去离子水1000ml，文火煮半小时，用双层纱布过滤，用去离子水将滤液添加至1000ml，自然pH。放入高压灭菌锅中121℃灭菌20min。

在本发明的一些实施例中，可以将尖孢镰刀菌Y④38与其它生防菌株联用，或者与能够增强尖孢镰刀菌Y④38活力的物质联用，以增强烟草连作障碍的防治效果。

经实验证明，本发明提供的尖孢镰刀菌Y④38(Fusarium oxysporum Y④38)对烟草具有明显的促生作用；在连作烟田中施用时，能够消除烟草土壤的连作障碍问题，增加连作烟田的烟草产量，提高经济效益。本发明提供的防治烟草连作障碍的方法，具有绿色、安全、环保的特点，并且防病效果显著。

本发明提供的尖孢镰刀菌Y④38的保藏信息如下：

生物材料名称：Fusarium oxysporum Y④38

分类学名称：Fusarium oxysporum

保藏日期：2021年11月15日

保藏编号：GDMCC No:62066

保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)

地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1显示了生长在PDA培养基平板上的菌株Y④38的正面形态图与背面形态图。

图2显示了菌株Y④38的分生孢子。

图3显示了菌株Y④38的系统发育树。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明。需要理解的是，下述实施例仅用于对本发明的技术方案进行解释和说明，而非用于限制本发明的保护范围。任何熟悉本领域技术的人员在本发明公开的技术范围内对下述实施例所做的修饰或改变，均应涵盖在本发明的保护范围内。

以下实施例中使用的供试烟草品种为‘红花大金元’，购买自玉溪中烟种子有限责任公司。

以下实施例中使用的培养基：

PDA液体培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎。加去离子水1000ml，文火煮半小时，用双层纱布过滤，用去离子水将滤液添加至1000ml，加入葡萄糖20g，自然pH。将配制好的培养基放入高压灭菌锅中，121℃灭菌20min，备用。

PDA固体培养基：在PDA液体培养基中添加琼脂至终浓度为17g/L。将配制好的培养基放入高压灭菌锅中，121℃灭菌20min，备用。实施例中提到的PDA平板培养基和PDA斜面培养基均属于PDA固体培养基。

若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1、尖孢镰刀菌Y④38的分离、纯化和鉴定

1、菌株分离和纯化

本发明的尖孢镰刀菌Y④38是从采自云南省昆明市的植物八角莲中分离获得的。菌株分离和纯化的方法如下：

取八角莲的根、茎、叶，用无菌水冲洗干净，然后剪成0.5～1cm长的小段；在无菌条件下，用质量分数为0.11％的HgCl₂溶液对根、茎、叶的小段进行表面消毒6～8min；用无菌水将消毒液冲洗干净后，再用体积分数为75％的乙醇溶液对根、茎、叶的小段进行表面消毒3～5s；用无菌水将乙醇溶液冲洗干净后，将根、茎、叶的小段接种于PDA平板培养基中，25℃恒温培养，待从根、茎、叶内长出真菌菌丝后，挑取尖端菌丝接种到PDA平板培养基中，重复接种两次后，将真菌保存在PDA斜面培养基中，放置于4℃冰箱中保存备用。

我们从八角莲中共分离到45株待测菌株，然后按照如下方法对待测菌株进行筛选：以烟草品种‘红花大金元’作为试验材料，将烟苗培育至五叶期，挑取形态大小一致的烟苗移栽至花盆中，土壤使用烟田三年连作土。将筛选到的菌株分别从PDA斜面培养基接种到无菌的PDA平板培养基中进行活化，将活化后的菌株接种到无菌的PDA液体培养基中，放入120r/min的摇床中培养，温度设置为28℃，培养2-4d；将培养好的菌液过滤出真菌菌丝体，将菌丝体埋到烟苗的根部，并用无菌土覆盖。待烟苗栽培至旺长期，对烟草植株的株高、茎围、最大叶长、最大叶宽进行测量和比较，筛选到了一株能够有效防治烟草连作障碍的菌株，命名为菌株Y④38。

2、菌株Y④38的形态观察

菌株培养：配制PDA固体培养基，121℃高压灭菌20min后，将灭菌的培养基倒入培养皿中制成平板，平均每个培养皿15-20ml，冷却凝固后备用。将保存在PDA斜面培养基上的菌株Y④38用灭菌竹签挑取菌丝，接种到新制的PDA平板培养基上进行培养，培养温度为25℃，每天光照16h/黑暗8h，培养时间为2-7天。

菌落形态观察：如图1所示，菌株Y④38在PDA平板培养基上培养7天后，菌落突起絮状，菌丝白色质密且略带有紫色，菌落高3～5mm，菌落背面紫色加深，呈环状。

分生孢子形态观察：在PDA平板培养基上接种菌株Y④38，在琼脂上接种点周围插入无菌的盖玻片，培养7天后，取下盖玻片，在盖玻片上滴一点无菌水。用显微镜观察分生孢子形态并拍照。如图2所示，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，单胞，卵形；大型分生孢子呈镰刀形，少许弯曲，多数为3隔。厚垣孢子尖生或顶生，球形。

3、菌株Y④38的分子鉴定

(1)菌株Y④38的DNA提取

首先将保存在PDA斜面培养基上的菌株Y④38接种到新制的PDA平板培养基上进行活化，然后按以下步骤提取DNA：取25μL真菌细胞裂解液(TAKARA公司，Lysis Buffer ForMicroorganism To Direct PCR，CAT#9164)于灭菌的200μL Eppendorf管中，挑取适量的室温下培养5-6天的Y④38真菌菌丝体没入真菌细胞裂解液中。将Eppendorf管放入PCR仪中，于85℃孵育20min，然后在超速离心机中于13000r/min离心2.5min，取上清液作为DNA模板。

(2)PCR扩增ITS区

采用提取的DNA作为PCR模板，利用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增菌株Y④38的ITS(Internal Transcribed Spacer)，对ITS进行DNA测序，将测序得到的ITS序列与已知真菌的ITS序列进行比对。

引物ITS1的核苷酸序列为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID NO:3)；

引物ITS4的核苷酸序列为：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO:4)。

PCR扩增使用50μL的反应体系，包括1.0μL的基因组DNA，引物ITS1(10μmol/L)和引物ITS4(10μmol/L)各1.0μL，无菌水22μL，2×PCR扩增缓冲液25μL(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂)。

PCR程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸60秒，35个循环；10℃保存。

反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统观察目的条带的扩增情况。

(3)测序和比对

将PCR产物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行测序，得到菌株Y④38的ITS，其中ITS1序列和ITS2序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。将菌株Y④38的ITS1序列与NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已知真菌的ITS1序列进行BLAST分析。结果显示，菌株Y④38的ITS1序列与Fusarium oxysporum的ITS1序列的同源性为99.60％，因此菌株Y④38属于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

菌株Y④38的ITS1序列：

TCGAAGATCACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCTAAAGGGGGAAGAAATCCTCACA(SEQ ID NO:1)。

菌株Y④38的ITS2序列：

GGGGCATTCTCCTGATCCGAGGTCACATTCAGAAGTTGGGGTTTAACGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGAGGAACGCGAATTAACGCGAGTCCCAACACCAAGCTGTGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTATGGTTTTACTCAGAAGTTACATATAGAAAACAGAGTTTAGGGGTCCTCTGGCGGGCCGTCCCGTTTTACCGGGAGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACAAGTGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGCACCCTTTAACGAAGGGATCATTACCGGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTTGTGAACATACCACCTTGTTGCCACCGAAGATATCAGCCCC(SEQ IDNO:2)。

(4)系统发育树的构建

利用MEGA7.0软件进行菌株系统发育分析，用Maximum Likelihood进行系统发育树的构建，bootstrap值设为1000。菌株Y④38的系统发育树如图3所示，其中每个菌株后面的编号为该菌株的ITS1序列的NCBI登录号。

4、菌株Y④38的专利保藏

2021年11月15日将菌株Y④38送广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进行专利保藏，保藏编号为GDMCC No:62066。保藏中心的地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，邮编510070；联系电话为020-87137633；电子邮箱为gdmcc@gdim.cn。

实施例2、尖孢镰刀菌Y④38对烟草的促生作用

实验组1：将菌株Y④38接种于无菌的PDA液体培养基中，于120rpm，25℃发酵培养5天。发酵结束后，将菌液按照每盆50ml的用量加入常规营养土基质中，栽入健壮、整齐、五叶期的‘红花大金元’烟苗，每盆栽种烟苗一棵。其余栽培管理措施与烟草正常的栽培管理措施相同。对照组1：用无菌的PDA液体培养基代替菌液进行实验，其余操作同实验组1。实验组1和对照组1各栽培7株烟苗，均置于日光温室中进行培养，温度10-30℃，每天光照13h/黑暗11h，培养90天后统计烟草植株的茎围、株高、最大叶长、最大叶宽等生长指标并计算平均值。结果如表1所示，实验组1的各项生长指标均优于对照组1。

表1

	茎围(cm)	株高(cm)	最大叶长(cm)	最大叶宽(cm)
					实验组1	11.4	169.3	81.4	36.2
对照组1	9.8	157.2	67.2	30.5

实验组2：将菌株Y④38接种于无菌的PDA液体培养基中，于120rpm，25℃发酵培养5天后，将菌液分别稀释10倍、20倍、30倍、40倍、50倍，用于对烟草进行灌根处理。灌根处理方法：使用常规营养土基质，将健壮、整齐、五叶期的‘红花大金元’烟苗栽入花盆中，每盆栽种烟苗一棵，将稀释的菌液浇灌于烟苗的根部，浇灌量为50ml/棵。栽种烟苗时浇灌一次，隔30天再浇灌一次，总共浇灌两次。其余栽培管理措施和烟草正常的栽培管理措施相同。对照组2：用无菌的PDA液体培养基代替菌液进行实验，其余操作同实验组2。实验组2和对照组2各栽培7株烟苗，均置于日光温室中进行培养，温度10-30℃，每天光照13h/黑暗11h，培养90天后统计烟草植株的茎围、株高、最大叶长、最大叶宽等生长指标并计算平均值。结果如表2所示，实验组2的各项生长指标均优于对照组2。

表2

实验组3：将菌株Y④38接种于无菌的PDA液体培养基中，于120rpm，25℃发酵培养5天。向培养好的菌液中加入高温高压灭菌后的麦麸，添加比例为1L菌株发酵液中加入1kg麦麸，将其充分混匀后放入电热鼓风干燥箱中，条件为55℃，烘干3h，将处理好的菌粉保存在常温干燥处。将健壮、整齐、五叶期的‘红花大金元’烟苗栽入常规营养土基质中，将干燥的菌粉在栽培烟草时直接施用于烟草根部，每株10克菌粉。栽种烟苗时施用一次，隔30天再施用一次，共施用两次。其余栽培管理措施和烟草正常的栽培管理措施相同。对照组3：用无菌的PDA液体培养基代替菌液进行实验，其余操作同实验组3。实验组3和对照组3各栽培7株烟苗，均置于日光温室中进行培养，温度10-30℃，每天光照13h/黑暗11h，培养90天后统计烟草植株的茎围、株高、最大叶长、最大叶宽等生长指标并计算平均值。结果如表3所示，实验组3的各项生长指标均优于对照组3。

表3

	茎围(cm)	株高(cm)	最大叶长(cm)	最大叶宽(cm)
					实验组3	10.4	166.5	79.4	37.2
对照组3	9.2	150.5	63.3	25.5

实验组4：将实验组3中制作的菌粉加入1％(g/mL)的葡萄糖溶液中活化6-8个小时，每升葡萄糖溶液加入20g菌粉。将活化的菌液分别稀释10倍、20倍、30倍、40倍、50倍，用于对烟草进行灌根处理。灌根处理方法：将健壮、整齐、五叶期的‘红花大金元’烟苗栽入常规营养土基质中，将稀释的菌液浇灌于烟苗的根部，浇灌量为100ml/株。栽种烟苗时浇灌一次，隔30天再浇灌一次，总共浇灌两次。其余栽培管理措施和烟草正常的栽培管理措施相同。对照组4：用无菌的麦麸粉代替菌粉进行实验，其余操作同实验组4。实验组4和对照组4各栽培7株烟苗，均置于日光温室中进行培养，温度10-30℃，每天光照13h/黑暗11h，培养90天后统计烟草植株的茎围、株高、最大叶长、最大叶宽等生长指标并计算平均值。结果如表4所示，实验组4的各项生长指标均优于对照组4。

表4

实施例3、尖孢镰刀菌Y④38对烟草连作障碍的防效测定

选取云南省昆明市往年种植烟草的烟田作为试验地，按常规要求整理好烟田土壤。供试烟草(Nicotiana tabacum)品种为‘红花大金元’。选取健壮、整齐、五叶期的200株烟苗进行栽培，栽培的株距为50cm、左右间距为100cm、窝深为15cm。将菌株Y④38接种于无菌的PDA液体培养基中，于120rpm，25℃发酵培养5天，得菌液。随机选取100株烟苗作为实验组，将培养的菌液稀释5倍后对实验组的烟苗进行灌根处理。在每个烟苗栽培的穴内，按照常规烟苗栽培规范进行管理，将稀释的菌液浇灌于烟苗的根部，浇灌量为100ml/株。栽种烟苗时浇灌一次，隔30天再浇灌一次，总共浇灌两次。剩下的100株烟苗作为对照，用水代替菌液进行浇灌，其余操作同实验组。3个月后统计烟草植株的茎围、株高、最大叶长、最大叶宽等生长指标以及烟草根腐病的发病率，并计算各项指标的平均值。

结果如表5所示，实验组的各项生长指标均优于对照组，并且实验组的烟草根腐病的发病率与对照组相比降低了50％。

表5连作烟田中栽培的烟草植株的各项指标

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省烟草公司昆明市公司

<120> 一株具有防治烟草连作障碍作用的尖孢镰刀菌

<130> P210857-YCK

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> Fusarium oxysporum

<400> 1

tcgaagatca ctcccaaacc cctgtgaaca taccacttgt tgcctcggcg gatcagcccg 60

ctcccggtaa aacgggacgg cccgccagag gacccctaaa ctctgttttc tatatgtaac 120

ttctgagtaa aaccataaat aaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat 180

cgatgaagaa cgcagcaaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc 240

gaatctttga acgcacattg cgcccgccag tattctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc 300

atttcaaccc tcaagcacag cttggtgttg ggactcgcgt taattcgcgt tcctcaaatt 360

gattggcggt cacgtcgagc ttccatagcg tagtagtaaa accctcgtta ctggtaatcg 420

tcgcggccac gccgttaaac cccaacttct gaatgttgac ctcggatcag gtaggaatac 480

ccgctgaact taagcatatc taaaggggga agaaatcctc aca 523

<210> 2

<211> 591

<212> DNA

<213> Fusarium oxysporum

<400> 2

ggggcattct cctgatccga ggtcacattc agaagttggg gtttaacggc gtggccgcga 60

cgattaccag taacgagggt tttactacta cgctatggaa gctcgacgtg accgccaatc 120

aatttgagga acgcgaatta acgcgagtcc caacaccaag ctgtgcttga gggttgaaat 180

gacgctcgaa caggcatgcc cgccagaata ctggcgggcg caatgtgcgt tcaaagattc 240

gatgattcac tgaattctgc aattcacatt acttatcgca ttttgctgcg ttcttcatcg 300

atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa gttttgattt atttatggtt ttactcagaa 360

gttacatata gaaaacagag tttaggggtc ctctggcggg ccgtcccgtt ttaccgggag 420

cgggctgatc cgccgaggca acaagtggta tgttcacagg ggtttgggag ttgtaaactc 480

ggtaatgatc cctccgcagg caccctttaa cgaagggatc attaccggag tttacaactc 540

ccaaacccct tgtgaacata ccaccttgtt gccaccgaag atatcagccc c 591

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ITS1的核苷酸序列

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物ITS4的核苷酸序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1.一株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，其保藏号为GDMCC No:62066。

2.权利要求1所述的尖孢镰刀菌的培养物。

3.根据权利要求2所述的培养物，其特征在于，所述培养物是将权利要求1所述的尖孢镰刀菌接种到液体培养基中培养得到的发酵液。

4.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的尖孢镰刀菌。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为固体菌剂或液体菌剂。

6.权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求1所述的尖孢镰刀菌并将所述尖孢镰刀菌或其培养物制成菌剂。

7.权利要求1所述的尖孢镰刀菌或权利要求2或3所述的培养物或权利要求4或5所述的菌剂在防治烟草连作障碍中的应用。

8.一种防治烟草连作障碍的方法，其特征在于，向烟草根部施加权利要求1所述的尖孢镰刀菌或权利要求2或3所述的培养物或权利要求4或5所述的菌剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用如下(1)－(6)中的任何一种方式施加所述尖孢镰刀菌：

(1)在土壤中挖出与烟苗根部大小相对应的栽培穴，放入烟苗，将所述尖孢镰刀菌的菌液浇在烟苗的根部，菌液用量为10ml-100ml/株；

(2)将所述尖孢镰刀菌的菌液和任意比例的浇根用水混合后，在栽培烟草时浇入栽培穴中，或者是覆土后进行浇灌；

(3)将所述尖孢镰刀菌的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，在栽培烟草时将干燥的菌粉施用于烟草栽培穴中；

(4)将所述尖孢镰刀菌的菌液加入灭菌后的麦麸，低温干燥后制成菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培烟草时浇入烟草的根部；

(5)将所述尖孢镰刀菌的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，在栽培烟草时将纯的菌粉施用于烟草栽培穴中；

(6)将所述尖孢镰刀菌的菌液进行冷冻干燥后制成纯的菌粉，将菌粉在营养液中活化后，在栽培烟草时浇入烟草的根部。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述菌液的制备方法如下：将所述尖孢镰刀菌接种于PDA液体培养基中，于120～150rpm，25～27℃培养2～7天。

Images