CN113308384B - 一种冬虫夏草菌株及其用途 - Google Patents

一种冬虫夏草菌株及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌株及其用途，将从冬虫夏草子实体中筛选出的产香冬虫夏草菌株或其发酵液接种至烟叶表面，在一定条件下进行发酵，可以显著提升烟叶香气质和香气量，降低刺激和杂气，增加甜润感。

Description

一种冬虫夏草菌株及其用途
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种冬虫夏草菌株及其用途。
背景技术
烟草吃味不足，可以通过添加烟草香精香料来弥补。烟草香料主要分为人工合成和天然香料两大类。人工合成香料是非天然的，会给人体健康带来危害。天然香料主要来源于动物、植物和微生物，其中动物、植物香料资源有限，产量有限，不能满足日益增长的市场需求。微生物发酵制备天然香料具有生产周期短，不受气候影响，反应条件温和、选择性高、效率高等特点，受到越来越多的关注。
我国菌种资源丰富，冬虫夏草(Chinese cordyceps)为我国重要的食药同源菌种资源，合理开发和利用我国天然菌种资源，筛选产香冬虫夏草菌株(Ophiocordycepssinensis)，将其用于烟草发酵增香和生产天然烟用香料，提升烟叶品质，增加烟叶的可用性，对提升烟叶使用价值、开发和生产不加香卷烟具有重要意义。
发明内容
本发明旨在提供一种产香冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)；
本发明的另一个目的是提供了冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)及其制品在烟草中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种冬虫夏草菌株(Ophiocordyceps sinensis)，已于2021年6月17日藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.22451。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的冬虫夏草在烟株组织发酵的用途。
本发明的第三个方面是提供一种冬虫夏草发酵液制备方法，包括以下步骤：
(1)提供一种冬虫夏草菌株；所述冬虫夏草菌株的保藏号为CGMCC No.22451；
(2)将菌种按照体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养5-7天得到种子液；
(3)取种子液按体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养5-7天，获得发酵液。
本发明的第四个方面是提供本发明第三个方面所述的种子液或发酵液在烟株组织发酵的用途。具体使用方法为：将上述发酵液或种子液，按照烟叶重量的5-30％，加入到烟叶中，置于25-45℃下发酵5-15天。
本发明的第五个方面是提供一种烟用生物香料，制备方法包括以下步骤：
(1)提供一种冬虫夏草菌株；所述冬虫夏草菌株的保藏号为CGMCC No.22451；
(2)将菌种按照体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养5-7天得到种子液；
(3)取种子液按体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养5-7天，获得发酵液；
(4)将上述种子液或发酵液于5000-10000rpm离心10-20min，取上清液；并将上清液经-80℃预冻24h后，真空冷冻干燥得到烟用生物香料。
本发明的第六个方面是提供本发明第五个方面所述的烟用生物香料在烟用原料或成品烟中的用途，所述烟用原料包括烟叶、烟丝、梗丝、薄片、卷纸或滤嘴；所述成品烟包括卷烟、雪茄或电子烟。
本发明的有益效果在于：
本发明将筛选出的产香冬虫夏草菌株或其发酵液接种至烟叶表面，在一定条件下进行发酵，可以显著提升烟叶香气质和香气量、增加甜润感。
将冬虫夏草菌株或其发酵液作为烟用生物香料，添加至卷烟或雪茄烟中，其与烟草具有较好的协调性，能够丰富烟香，降低杂气和刺激性，增加甜感。该烟用生物香料制备工艺简单，原料来源丰富，成本低廉，使用方便。将该烟用香料用于烟用原料或成品烟的加香加料，能够满足人们对绿色、健康卷烟产品的需求，因此具有显著的工业应用价值和广阔的推广应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施实例1
菌株的富集、纯化及筛选：
取冬虫夏草子实体(四川藏区)，用10％84消毒液浸泡4-5min，用无菌蒸馏水清洗干净。将清洗干净的冬虫夏草子实体用无菌手术刀切取黄豆大小，置于含1％氯霉素的烟草提取物固体培养基上。将培养皿置于28℃、相对湿度75％恒温恒湿箱培养5-7天。待菌丝体长出后，在培养皿4周和中心位置，用无菌接种铲截取黄豆大小带琼脂块的菌丝体，置于含1％氯霉素的烟草提取物培养基中，置于摇床中28℃、150rpm培养5-7天，通过嗅香，筛选产香培养物。将培养物梯度稀释后涂布于烟草提取物固体培养基上，得到单菌落，将单菌落接入烟草提取物培养基中，通过嗅香，筛选产香培养物。将具有香气的培养物梯度稀释涂布于烟草提取物固体培养基中，得到冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)菌株，编号为SCT-F1。
所述的烟草提取物培养基为：烟叶10.0g加水100mL超声提取30min后过滤；马铃薯10.0g加100mL水煮烂过滤；葡萄糖10.0g；蒸馏水800mL；pH自然；琼脂18g；115℃灭菌20min。
实施实例2
菌株的18S rRNA分子鉴定及生物学特征：
使用引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS8(5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3')对菌株的18S rRNA区分子片段进行PCR扩增，然后经琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行测序，得到该菌株的18S rRNA序列。
所述冬虫夏草菌株培养形态描述如下：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基上菌落表面干燥，菌丝大而蓬松、不透明，与培养基结合牢固，菌落正面颜色为白色、背面为紫色。
将该序列与GenBank中已登录的部分菌株基因序列进行相似性比较，同源性达到100％，结合形态学鉴定结果，表明该菌株SCT-F1属于冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)。
实施实例3
将冬虫夏草接种于烟草提取物培养基中，置于恒温摇床中28℃、200rpm，培养7天。取种子液按体积比2％的接种量，接种于烟草提取物培养基，置于恒温摇床中28℃、150rpm培养7天。将培养液：水：烟叶按照质量比1:1:8，均匀喷洒于烤烟烟叶表面，置于恒温恒湿箱中30℃、75％相对湿度培养15天，将处理好的烟叶置于60℃条件下烘干至水分含量12％，获得发酵烟叶。
所述烟草提取物培养基同实施实例1。
发酵烟叶经过切丝后卷制成烟支，由专业评吸人员进行感官质量评价，结果发现与未发酵样对比，发酵烟叶的感官质量明显提升，具体表现为：烟香丰富、协调，略带菌香，烟气柔和，杂气和刺激性显著降低，甜润感提升。经测定，发酵烟叶中烟碱、1-戊烯-3-酮和乙酸等刺激性化合物含量降低，具有香气的丁二酮、3-乙酰基吡啶、3-甲基-1,2-环戊二酮、苯甲醛、5-羟甲基糠醛、香茶酮、2-苯乙醇、大马士酮、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、2-乙酰基吡咯、2-糠醛、茄酮和新植二烯等化合物含量增加。
实施实例4
将冬虫夏草接种于烟草提取物培养基中，置于恒温摇床中28℃、200rpm，培养7天。取种子液按体积比2％的接种量，接种于烟草提取物培养基，置于恒温摇床中28℃、150rpm培养5天。将发酵液于5000rpm离心20min，取上清液。将发酵液上清液经-20℃预冻24h后，真空冷冻干燥，即得烟用生物香料。
烟草提取物培养基同实施实例1。
烟用生物香料用50％乙醇溶解后，按照烟丝质量0.05％、0.10％和0.20％的比例加入烟丝，进行感官评定，结果发现与空白样对比，加入烟用香料的卷烟感官质量明显提升，评吸结果见表1。
表1 烟用生物香料(冬虫夏草发酵物)的卷烟加香评吸结果
Figure BDA0003165155280000061
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 四川中烟工业有限责任公司
<120> 一种冬虫夏草菌株及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1662
<212> DNA
<213> 冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)
<400> 1
gaccgagttt ggagagcttt ccggccctga gtggtagttg cccacctctc tgggccagtc 60
cggacgcctc actgagccat tcaatcggta gtagcgacgg gcggtgtgta caaagggcag 120
ggacgtaatc aacgcaagct gatgacttgc gcttactagg gattcctcgt tgaagagcaa 180
taattgcaat gctctatccc cagcacgacg gagtttaaca agattacccg gacctttcgg 240
acaaggaagt actcgctggc tccgtcagtg tagcgcgcgt gcggcccaga acatctaagg 300
gcatcacaga cctgttattg cctcaaactt ccatcggctt gagccgatag tccctctaag 360
aagccagcgt actgccaaag caatacgggc tatttagcag gttaaggtct cgttcgttat 420
cgcaattaag cagacaaatc actccaccaa ctaagaacgg ccatgcacca ccacccacaa 480
aatcaagaaa gagctctcaa tctgtcaatc ctcattgtgt ctggacctgg tgagtttccc 540
cgtgttgagt caaattaagc cgcaggctcc acccctggtg gtgcccttcc gtcaatttct 600
ttaagtttca gccttgcgac catactcccc ctggagccca agcactttga tttctcgtaa 660
ggtgccgaac gggtcaaaaa ataacaccgt ccgatcccta gtcggcatag tttatggtta 720
agactacgac ggtatctgat cgtcttcgat cccctaactt tcgttcctga ttaatgaaaa 780
catccttggc aaatgctttc gcagtagtta gtcttcaata aatccaagaa tttcacctct 840
gacaattgaa tactgatgcc cccgactgtc cctattaatc attacggcgg tcctagaaac 900
caacaaaata gaaccacacg tcctattcta ttattccatg ctaatgtatt cgagcatagg 960
cctgcctgga gcactctaat tttttcacag taaaagtcct gtttccccgc cacacccagt 1020
gaagggcatg gggttccaca gagggaaagg cccggccgga ccagtacacg cggtgaggcg 1080
gaccggccag ccaggcccaa ggttcaacta cgagcttttt aaccacaaca actttaatat 1140
acgctattgg agctggaatt accgcggctg ctggcaccag acttgccctc caattgttcc 1200
tcgttaaggg atttaaattg tactcattcc aattacaaga cccaaaagag ccctgtatca 1260
gtatttattg tcactacctc cccgtgtcgg gattgggtaa tttgcgcgcc tgctgccttc 1320
cttggatgta gtagccgttt ctcaggctcc ttctccgggg tcgagcccta accctccgtt 1380
acccgttgca accatgtttg gccaataccc aaacatcgaa agttgatagg gaagaaattt 1440
gaatgaacca tcgccggcac aaggccatgc gattcgagga gttatcatga atcaccagtg 1500
agccccgaag ggcattggtt tttaatctaa taaatacatc ccttccgaag tcgggatttt 1560
tagcatgtat tagctctaga attaccacgg ttatccaagt agtaaggtac tatcaaataa 1620
acgataactt atataatgag ccattcgcag tttcgctgta ta 1662

Claims (6)

1.一种冬虫夏草菌株(Ophiocordyceps sinensis)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CGMCC No.22451。
2.如权利要求1所述的冬虫夏草在烟叶发酵的用途。
3.一种冬虫夏草发酵液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供一种冬虫夏草菌株；所述冬虫夏草菌株的保藏号为CGMCC No.22451；
(2)将上述菌株按照体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养24-36h得到种子液；
(3)取种子液按体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养24-36h，获得发酵液。
4.如权利要求3中所述的种子液或发酵液在烟叶发酵的用途。
5.一种烟用生物香料，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
(1)提供一种冬虫夏草菌株；所述冬虫夏草菌株的保藏号为CGMCC No.22451；
(2)将上述菌株按照体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养24-36h得到种子液；
(3)取种子液按体积比1-3％的接种量接种于烟草提取物培养基中，28-30℃、150-200rpm恒温摇床培养24-36h，获得发酵液；
(4)将上述种子液或发酵液于5000-10000rpm离心10-20min，取上清液；并将上清液经-80℃预冻24h后，真空冷冻干燥得到烟用生物香料。
6.如权利要求5所述的烟用生物香料在烟用原料或成品烟中的用途，所述烟用原料包括烟叶、烟丝、梗丝、薄片、卷纸或滤嘴；所述成品烟包括卷烟、雪茄或电子烟。
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