CN112673900A - 一种皱盖假芝菌种及其栽培、采摘、保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种皱盖假芝菌种及其栽培方法,所述皱盖假芝菌种的18s序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，28S序列为为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，ITS序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述皱盖假芝菌种，芝柄粗壮直径0.5‑1.2cm，柄长7cm‑30cm，芝盖厚硬直径可达3‑15cm，厚0.5‑1.0cm，成熟部位漆黑，幼嫩部位雪白，香味浓郁，品相、口感上乘，可在无中国台湾相思椴木成分的培养料中生存，且菌丝生长速度快，是目前发现皱盖假芝中最优菌种。

Description

一种皱盖假芝菌种及其栽培、采摘、保存方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种皱盖假芝新菌种及其栽培、采摘、保存方法。

背景技术

皱盖假芝(Amauroderma rugosum)，又名黑假芝、乌芝、黑芝，属于真菌门，层菌纲，非褶菌目，灵芝科，假芝属。因其子实体在硬物触划损伤后会分泌出如血一样的红色汁液，因此又称为血灵芝、香血灵芝。皱盖假芝子实体菌盖肾型、半圆形，具辐射的深皱纹和细微绒毛，往往有同心环带，边缘薄，后期增厚呈平截、波浪状(赵继鼎、张小青《中国真菌志》第十八卷)，是一种热带亚热带地区特有的珍稀药用真菌(赵继鼎，1992；毕志树，1994)。《神农本草经》中早有记载：黑芝“咸，平，无毒”，主治“癃”，“利水道，益肾气，通九窍，聪察”。近年研究表明，皱盖假芝的多糖含量较高(肖自添等，2013)，很有研究前景。

最新研究表明，皱盖假芝多糖治疗肿瘤，尤其是乳腺癌，效果显著(潘鸿辉，2019，专利申请号：CN110078842A)；皱盖假芝的醇提物和云芝的水提物对EV71肠道病毒引起的疾病的预防和治疗的效果显著，并没有明显的副作用(潘鸿辉，2019，专利申请号：CN110464743A)；皱盖假芝提取液可以显著延长果蝇的寿命，能使小鼠肝MDA水平降低，具有抗脂质过氧化的作用，表明具有抗氧化作用，且表现出量效关系(王谦，2014)。近年来涌现出来的对皱盖假芝的研究，也显现出了皱盖假芝的研究价值和广阔的前景。

野生皱盖假芝主要分布在中国(福建、云南、海南、贵州、广西、广东等省)、澳大利亚、南非等地，自然产量极为稀少，又因长期过度采摘，致使野生资源濒临枯竭。在我国华南地区也有采摘、销售野生皱盖假芝的传统习惯(黄年来，2010；戴玉成等，2008)，价格高、供不应求，极具开发利用价值。由于野生皱盖假芝生长速度缓慢，对气候要求高，产量极低，优品率更低，野生采摘的皱盖假芝品相也常常参差不齐，保鲜也不好处理，仅靠自然供给远远不能满足人们的需求，所以人工栽培出高产量、高品质的皱盖假芝越来越急迫。

目前人工栽培皱盖假芝还处于起步阶段，李志芳申请了“一种血灵芝的培育方法”专利(授权公告号：CN 104350953B)，用10-16％的相思树木材颗粒栽培血灵芝；宿彤申请了“一种血灵芝的培育方法”专利(申请公布号： CN 109429893A)，配方中有12-18％的相思木腐木渣；陈丽丽等人申请了“一种乌芝新菌种及人工栽培方法”专利(申请公布号：CN111149618A)，配方中也含有相思；黄龙花等人申请了“一种皱盖假芝的人工栽培方法”专利(授权公告号：CN 103749151B)，用高粱、小米等栽培皱盖假芝，后熟期15天；肖自添等人申请了“一种乌芝子实体的培养方法”专利(授权公布号：CN 105660191B)，用石灰、复合肥等提供部分营养。目前皱盖假芝菌种的人工种植中缺乏高效生态，高转化率的方式，包括以下问题

1、目前种植皱盖假芝的方法需要用到大量的中国台湾相思树的枝叶与木材，中国台湾相思树拉丁学名：Acacia confusa，属于生态林，砍树种芝，大量使用不符合国家生态响应，实际生产产量也跟不上，相应配方从原料产量到经济效益上，无法工厂化大批量生产。主要是因为在栽培技术上没有突破，没有找到脱离它的寄生树种的栽培配料和生长环境，以及没有筛选到更合适的菌种。

2、现有技术在皱盖假芝的干燥、储存上没有和其他食药用菌区分开，导致干品芝都不能保存住其特有的“血”，有效成分受到很大影响，开发潜力也大大受限，而且品相参差不齐。主要是因为对皱盖假芝的研究不够深，在皱盖假芝的干燥技术上没有突破。

3、现有皱盖假芝野生鲜品在市场上没有售卖，触碰及泡水后无红色“血水”流出，无法体现出“血灵芝”，因此野生产品均为干品，多称为乌芝、黑芝。主要是因为没有工厂化生产，从而不能保证在生长的最佳时期采摘，以及没研发出好的采摘后保存鲜品的方法。

4、现有栽培方法栽培皱盖假芝的芝型普遍芝柄细长、芝盖薄而软，因为没有进行菌种选育，没有选育出芝柄粗壮，芝盖厚实的品种品相相对较差。

发明内容

发明人提供一种新的皱盖假芝菌种，其子实体成熟部分漆黑、幼嫩部分雪白，生长速度快，芝型好，杆粗壮坚硬，并提供了该菌株的栽培方法和采摘和干燥方法。

为实现上述目的，本发明的第一方面，发明人提供了一种皱盖假芝菌种, 所述皱盖假芝菌种的18s序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，28S序列为为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，ITS序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

所述皱盖假芝菌种由发明人对野生菌株进行紫外诱变及定向筛选后得到突变株，在分离纯化后提取DNA，进行18s、28s、ITS序列的测序。

进一步的，所述皱盖假芝菌种，名称为RFC，拉丁分类名为：Amauroderma rugosumRFC，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020534；地址为中国武汉武汉大学；保藏日期为2020年9月23日。

目前已有的皱盖假芝菌种芝柄细脆易断、芝盖薄软，呈黑灰色；而新皱盖假芝菌种RFC：芝柄粗壮直径0.5-1.2cm，柄长7cm-30cm，芝盖厚硬直径可达3-15cm，厚0.5-1.0cm，成熟部位漆黑，幼嫩部位雪白，香味浓郁，品相、口感上乘，可在无相思树干成分的培养料中生存，且生长速度快，是目前发现皱盖假芝中最优菌种。该皱盖假芝新菌种在提高免疫力、安神、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等领域具有巨大的开发潜力，具备生长适宜温度范围较广、无后熟期、生长速度快、抗逆性与抗病性强等适合工厂化大规模栽培的优点。

本发明第二方面，发明人提供了本发明第一方面所述的皱盖假芝菌种的栽培方法，所述栽培方法包括以下步骤：

母种制备：将本发明第一方面所述的皱盖假芝菌种接入母体培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；

原种制备：将母种接入含原种培养料的菌袋，22-28℃条件下培养至菌丝长满菌袋，获得原种；所述原种培养料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；栽培前处理：将原种接入含栽培料的菌袋，22-28℃、空气相对湿度为70-80％，避光、缺氧条件下培养至菌丝长满菌袋；所述栽培料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；

出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。

进一步的，所述出芝步骤：出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％。

进一步的，所述原种制备步骤中，采用的原种培养料包括以下质量份的组分：干基料55-155质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份；所述干基料包括30-120质量份的主料与25-35质量份的辅料，所述主料包括木屑、竹屑、五节芒、玉米秸秆、棉籽壳、巨菌草、芦苇、芦竹、芒萁、斑茅或其组合物；所述辅料包括麦麸、米糠或其组合物。

进一步的，可将不易吸水的主料提前浸泡在水中一天以上，再沥至不流状水后再进行原种培养料的制备。

进一步的，所述栽培前处理步骤中，采用的栽培料包括以下质量份的组分：干基料50-150质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份；所述干基料包括30-120质量份的主料与20-30质量份的辅料，所述主料包括木屑、竹屑、五节芒、玉米秸秆、棉籽壳、巨菌草、芦苇、芦竹、芒萁、斑茅或其组合物；所述辅料包括麦麸、米糠或其组合物。

原种培养料和栽培料中加入石膏和轻质碳酸钙使得原种培养料和栽培料的pH值维持在5.4-5.6，而皱盖假芝菌丝生长的最佳pH值为5-5.5，由于固所述原种制备步骤以及栽培前处理、栽培过程中均存在发菌过程，pH值为5.5的弱酸性，更加适宜皱盖假芝菌丝的生长；另一方面在本发明中原种培养料和栽培料成分基本相同，只是营养和氮源适当增加，在促进营养生长及菌丝活力的同时，能够维持发菌过程中生长环境的相似性及稳定性。

进一步的，所述原种培养料和栽培料的含水量为60-65％。

进一步的，所述母种制备步骤中，采用的母体培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯15-25％、琼脂1-2％、葡萄糖1-2％、鱼粉0.1-2％、磷酸二氢钾0.1-0.2％，余量为水。

进一步的，所述原种制备和栽培前处理步骤在无菌条件下进行，含原种培养料的菌袋与含栽培料的菌袋在接种前进行108℃-125℃，2小时以上的高压灭菌处理。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述皱盖假芝菌种的采摘和干燥方法，包括以下步骤：

采摘：按照本发明第二方面所述的栽培方法对本发明第一方面所述的皱盖假芝菌种进行栽培，当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；进一步的，采摘子实体时拿芝柄，皱盖假芝芝盖朝下，不破坏芝盖背后的白毛,避免磕碰,放在收纳筐里只放一层。

干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，在120℃以下进行干燥。

采摘下来的皱盖假芝子实体可放在通风良好的房间阴干或40-120℃烘干、晾干或晒干。该干燥步骤可以保存住皱盖假芝中的红色汁液不被氧化，也就是保存住皱盖假芝的“血”，可更好的长期稳定地保存活性成分，有利于功效的体现及深度开发。并且品相上乘。

保存方法也可以为鲜品保存，容器要求密封度较高、有适当通气的坚硬容器，具体可以用食用级别的热熔胶将子实体剪下来的一端固定在底座，容器里面放吸水的海绵保持80％-110％的空气含水量，全程低温。该方法可以将皱盖假芝鲜品保存7天左右，可以保持子实体白色部分损伤后有“血”流出。

区别于现有技术，上述技术方案至少包括以下有益效果：提供了一种具有 ITS、18s、28s新序列的皱盖假芝菌种RFC，芝柄粗壮直径0.5-1.2cm，柄长 7cm-30cm，芝盖厚硬直径可达3-15cm，厚0.5-1.0cm，成熟部位漆黑，幼嫩部位雪白，香味浓郁，品相、口感上乘，可在无相思树干成分的培养料中生存，且生长速度快，是目前发现皱盖假芝中最优菌种。有栽培技术中需要中国台湾相思椴木栽培或者在该栽培过程中加入一定比例中国台湾相思椴木，本技术可以完全不需要中国台湾相思的成分就可以栽培，即可使用多种现阶段菇厂大量使用的原料，也可使用一些可持续性的野草、牧草资源，更适合工厂化大量生产，也更符合国家生态要求。

附图说明

图1为本发明皱盖假芝菌种RFC菌种与对比的其他菌种1号皱盖假芝菌， 2号皱盖假芝菌种生长对比图；

图2为本发明皱盖假芝菌种RFC菌种与对比其他菌种1号皱盖假芝菌，2 号皱盖假芝菌种生长速度对比图；

图3为本发明实施1中栽种的皱盖假芝菌种RFC菌种与对比其他菌种1 号皱盖假芝菌，2号皱盖假芝菌种的成熟子实体对比图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

新皱盖假芝菌种RFC，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020534，为发明人对野生菌株进行紫外诱变及定向筛选后得到突变株，在分离纯化后，其18s序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，28S序列为为 SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，ITS序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

一、野外采集与外形品质、筛选

气温在22-28℃的降雨量大的季节，雨后时间段到福建各地的中国台湾相思树林下，寻找新皱盖假芝子实体。采集新鲜且状态好的子实体，并进行外形与品质的初步筛选，筛选出芝杆粗壮，笔直成熟部位漆黑，幼嫩生长部位雪白且芝体紧实，香味浓郁的子实体样品6朵。

二、分离与纯化

将野外采集的新鲜样品外部用75％医用酒精快速擦拭后放入超净台，样品对半掰开，用手术刀切取里面鲜活部分放入母种培养基(母体培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯15-25％、琼脂1-2％、葡萄糖1-2％、鱼粉0.1-2％、磷酸二氢钾0.1-0.2％，余量为水)，22-28℃培养3天左右可见菌恢复并开始进入平板生长，进行分离菌种。其后选取生长旺盛，没有污染的菌丝，转移到干净的母种培养基上，22-28℃培养，完成菌种纯化。

三、菌种脱毒

为了从分离纯化的菌丝中培育出适合的新品种，首先对其进行脱毒处理，使其生长更加旺盛有活力。将纯化的菌丝接入含5-30mg/Kg利巴韦林的母种培养基培养皿中，选择生长旺盛且快速的菌丝尖端1mm左右用手术刀切下，转移到相同的脱毒培养基中，重复3次，获得脱毒效果稳定、生长更加旺盛强壮的株系，完成脱毒复壮。

四、诱变与定向筛选驯化

获得刚脱毒复壮的菌种，此时的菌种在母种培养基中生长十分旺盛快速，且在模拟原生生长条件的中国台湾相思树木材与枝叶比例大(10％以上)的栽培料上可以旺盛生长。但在中国台湾相思树原料比例低的配方(10％以下，比如5％) 上生长变得显著放缓，且菌丝变弱，在没有中国台湾相思原料的配方上，菌丝生长进一步放缓变弱，表现为生长困难。

通过紫外诱变、及定向筛选，获得突变株系：

首先，将脱毒后长一半培养皿的菌丝体，开盖，放到15W，260nm的紫外线下，距离20cm左右，照射8-10分钟后，在昏暗条件下，取各方向尖端1mm 以内菌丝少量，一共做100个平板以上，再转移到相同的母种培养基中， 22-28℃暗培养，全程尽量避光防止菌丝体光修复。

将菌丝体末端1cm处接种于中国台湾相思比例为10％的栽培料试管上，菌丝生长至二分之一到三分之二时，选取其中相对生长更加旺盛株系的最末端菌丝 1-2mm长的部分，接入新的中国台湾相思比例减半的栽培料试管，继续生长。筛选重复6次，相思比例以10％、5％、2.5％、1.25％、0.625％、0.3125％、0％规律递减，最后0％相思比例再重复一次。最后得到一株在无相思培养基上正常旺盛生长、遗传稳定，且可正常出芝，长出的子实体外形和品质均显著优于现有常规品种的新品种皱盖假芝株系RFC，该株系可以在没有含中国台湾相思的培养料环境中大规模工厂化栽培，且生长速度快，比正常皱盖假芝菌种快25％以上。

图1中划线为接种后每隔三天画一次线，可以看出本发明菌种RFC菌丝生长速度明显比1号和2号皱盖假芝菌种生长速度快，而且，菌丝为白色。图2显示本发明菌种RFC菌丝平均生长速度为0.432cm，1号菌种平均生长速度为0.345cm，2号菌种平均生长速度为0.303cm。图1中可以看到本发明菌种RFC菌丝生长旺盛，1号和2号菌种菌丝要弱很多。

作为对比的其他菌种1号皱盖假芝学名Amauroderma rugosum；XLZ001 的ITS序列；NCBI Genbank号MN744354；其他菌种2号皱盖假芝学名 Amauroderma rugosum；RFZ520的ITS序列；NCBI Genbank号MT860727。

而本发明的新皱盖假芝菌种RFC：芝柄粗壮、直径0.5-1.2cm，柄长 7cm-30cm，芝杆的木栓质程度高，芝盖厚硬、直径为3-15cm，厚0.5-1.0cm，成熟深色部位漆黑，幼嫩白色部位雪白，香味浓郁，品相、口感上乘。所述皱盖假芝菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M2020534。

五、纯化测序：

组织分离纯化：无菌水清洗定向筛选驯化的RFC皱盖假芝子实体，用手术刀从掰开的面切下干净无污染内部组织并将分离的皱盖假芝子实体组织接种于母种培养基上，在24-28℃恒温培养接种后的培养皿7-10天，进而获得分离纯化的菌种。在分离纯化中，培养基为马铃薯20％，琼脂1.5％、葡萄糖 2％、鱼粉0.1％、磷酸二氢钾0.1％、余量为水；在24-28℃恒温培养接种后的培养皿10天。

DNA测序：提取分离纯化的新皱盖假芝菌种RFC的DNA→PCR得ITS、18s、 28s序列→TA克隆→测序、NCBI数据库比对，获得该新菌种皱盖假芝的ITS、 18s、28s序列，均与已知所有品种不同。

实施例1新皱盖假芝菌种RFC的栽培、采集、干燥方法

S1母种制备：采用母种培养基，制备试管斜面，将新皱盖假芝菌种RFC 接入试管斜面，在22-28℃恒温培养接种的试管，进而获得母种；

母种培养基配方为：马铃薯20％，琼脂1.5％、葡萄糖1％、鱼粉0.2％、磷酸二氢钾0.1％、余量为水。

S2原种制备：含水率63％、pH值为5.4-5.6原种培养料装入菌袋中并封口，于108℃-125℃高压灭菌3小时。无菌条件下将母种接入装有原种培养料的灭菌菌袋中，在22-28℃条件下培养至菌丝长满菌袋；原种培养料包括木屑 40％，玉米芯25％、麦麸30％、玉米粉1.9％、磷酸二氢钾0.1％、石膏1.5％、轻质碳酸钙1.5％，含水量63％；

S3栽培前处理：含水率63％、pH值为5.4-5.6栽培料，装入菌袋中并封口，于121℃-125℃高压灭菌3小时。取得原种在无菌条件下接入装有栽培料的灭菌菌袋中，封口，将接好菌的菌袋转入消毒后的培养室培养架上，避光培养，在温度为22-25℃、空气相对湿度为70-80％条件下进行发菌管理至菌丝长满菌袋；栽培料的配方为木屑40％，玉米芯30％、麦麸25％、玉米粉1.9％、磷酸二氢钾0.1％、石膏1.5％、轻质碳酸钙1.5％。

S4出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％。

S5采摘：当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；孔面有白毛还带血,

S6干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，消毒后在120℃以下进行干燥。

本发明实施1中栽种的皱盖假芝菌种RFC菌种与对比1号皱盖假芝菌，2 号皱盖假芝菌种的成熟子实体对比图如图3所示。由图3可知，皱盖假芝菌种RFC的芝柄粗壮修长，芝盖较大、厚实，所以相较于其他菌种(对比1和对比2)产出的子实体转化率更高。1号和2号皱盖假芝子实体数量少均只有三根，芝柄细且不长、粗细不均匀，芝盖直径小、薄而软，成熟部位颜色是灰褐色，幼嫩部位为灰白色。本发明获得的皱盖假芝RFC芝柄粗壮、直又长，芝盖厚实，成熟部位颜色漆黑，幼嫩部位雪白，且芝柄表面遇水后有较弱的漆样光泽。

实施例2新皱盖假芝菌种RFC的栽培、采集、干燥方法

S1母种制备：采用母种培养基，制备试管斜面，将新皱盖假芝菌种RFC 接入试管斜面，在22-28℃恒温培养接种的试管，进而获得母种；母种培养基配方为：马铃薯25％，琼脂1.3％、葡萄糖1.5％、鱼粉0.2％、磷酸二氢钾0.1％、余量为水。

S2原种制备：pH值为5.4-5.6原种培养料装入菌袋中并封口，于108℃ -125℃高压灭菌3小时。无菌条件下将母种接入装有原种培养料的灭菌菌袋中，在22-28℃条件下培养至菌丝长满菌袋；原种培养料包括竹屑40％，玉米芯21％、麦麸35％、玉米粉1.8％、磷酸二氢钾0.2％、石膏1％、轻质碳酸钙1％；含水量62％

S3栽培前处理：pH值为5.4-5.6栽培料，装入菌袋中并封口，于121℃ -125℃高压灭菌3小时。取得原种在无菌条件下接入装有栽培料的灭菌菌袋中，封口，将接好菌的菌袋转入消毒后的培养室培养架上，避光培养，在温度为22-25℃、空气相对湿度为70-80％条件下进行发菌管理至菌丝长满菌袋；竹屑40％，玉米芯36％、麦麸20％、玉米粉1.8％、磷酸二氢钾0.2％、石膏1％、轻质碳酸钙1％，含水量62％。

S4出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％；

S5采摘：当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；孔面有白毛还带血,

S6干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，消毒后在120℃以下进行干燥。

实施例3新皱盖假芝菌种RFC的栽培、采集、干燥方法

S1母种制备：采用母种培养基，制备试管斜面，将新皱盖假芝菌种RFC 接入试管斜面，在22-28℃恒温培养接种的试管，进而获得母种；母种培养基配方为：马铃薯22％，琼脂1.4％、葡萄糖1.7％、鱼粉0.2％、磷酸二氢钾0.1％、余量为水

S2原种制备：pH值为5.4-5.6原种培养料装入菌袋中并封口，于108℃ -125℃高压灭菌3小时。无菌条件下将母种接入装有原种培养料的灭菌菌袋中，在22-28℃条件下培养至菌丝长满菌袋；原种培养料包括竹屑40％，五节芒23％、麦麸33％、玉米粉1.6％、磷酸二氢钾0.2％、石膏1.1％、轻质碳酸钙 1.1％，含水量61％

S3栽培前处理：pH值为5.4-5.6栽培料，装入菌袋中并封口，于121℃ -125℃高压灭菌3小时。取得原种在无菌条件下接入装有栽培料的灭菌菌袋中，封口，将接好菌的菌袋转入消毒后的培养室培养架上，避光培养，在温度为22-25℃、空气相对湿度为70-80％条件下进行发菌管理至菌丝长满菌袋；竹屑40％，五节芒36％、麦麸20％、玉米粉1.6％、磷酸二氢钾0.2％、石膏1.1％、轻质碳酸钙1.1％，含水量61％

S4出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％；

S5采摘：当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；孔面有白毛还带血,

S6干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，消毒后在120℃以下进行干燥。

实施例4新皱盖假芝菌种RFC的栽培、采集、干燥方法

S1母种制备：采用母种培养基，制备试管斜面，将新皱盖假芝菌种RFC 接入试管斜面，在22-28℃恒温培养接种的试管，进而获得母种；母种培养基配方为：马铃薯22％，琼脂1.4％、葡萄糖1.7％、鱼粉0.2％、磷酸二氢钾0.1％、余量为水。

S2原种制备：pH值为5.4-5.6原种培养料装入菌袋中并封口，于121℃ -125℃高压灭菌3小时。无菌条件下将母种接入装有原种培养料的灭菌菌袋中，在22-28℃条件下培养至菌丝长满菌袋；原种培养料包括竹屑40％，芦苇 21％、麦麸35％、玉米粉1.2％、磷酸二氢钾0.2％、石膏和1.3％、轻质碳酸钙 1.3％，含水量60％

S3栽培前处理：pH值为5.4-5.6栽培料，装入菌袋中并封口，于108℃ -125℃高压灭菌3小时。取得原种在无菌条件下接入装有栽培料的灭菌菌袋中，封口，将接好菌的菌袋转入消毒后的培养室培养架上，避光培养，在温度为22-25℃、空气相对湿度为70-80％条件下进行发菌管理至菌丝长满菌袋；竹屑40％，芦苇36％、麦麸20％、玉米粉1.2％、磷酸二氢钾0.2％、石膏和1.3％、轻质碳酸钙1.3％，含水量60％。

S4出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％；

S5采摘：当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；孔面有白毛还带血,

S6干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，消毒后在120℃以下进行干燥。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州美利莎生物科技有限公司

<120> 一种皱盖假芝新菌种及其栽培、采摘、保存方法

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1136

<212> DNA

<213> 皱盖假芝 (Amauroderma rugosum )

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataaa caagtttgta 60

ctgtgaaact gcgaatggct cattaaatca gttatagttt atttgatggt accttgctac 120

atggataact gtggtaattc tagagctaat acatgcaatc aagccccgac ttccgggagg 180

ggtgtattta ttagataaaa aaccaacgcg gttcgccgct ccattggtga ttcataataa 240

cttctcgaat cgcatggcct tgcgccggcg atgcttcact caaatatctg ccctatcaac 300

tttcgatggt aggatagagg cctaccatgg attcaacggg taacggggaa taagggttcg 360

attccggaga gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa 420

attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg acaataataa caatatgggg ctctttcggg 480

tctcataatt ggaatgagta caatttaaat ctcttaacga ggaacaattg gagggcaagt 540

ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt tgttgcagtt 600

aaaaagctcg tagttgaact tcagacctgg ccgggcggtc tgcctaacgg tatgtactgt 660

ctggctgggt cttacctctt ggtgagccgg catgcccttc actgggtgtg tcggggaacc 720

aggactttta ccttgagaaa attagagtgt tcaaagcagg cctatgcccg aatacattag 780

catggaataa taaaatagga cgtgcggttc tattttgttg gtttctagag tcgccgtaat 840

gattaatagg gatagttggg ggcattagta ttcagttgct aggggtgaaa ttcttggatt 900

tactgaagac taactactgc gaaagcattt gccaaggatg ttttcattaa tcaagaacga 960

aggttagggg atcgaaaacg atcagatacc gttgtagtct taacagtaaa ctatgccgac 1020

tagggatcgg gcgatctcaa tcttatgtgt cgctcggcac cttacgagaa atcaaagtct 1080

ttgggttctg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta aaggaattga cggaag 1136

<210> 2

<211> 648

<212> DNA

<213> 皱盖假芝(Amauroderma rugosum)

<400> 2

gcatatcaat aagcggagga aaagaaacta acaaggattc ccctagtaac tgcgagtgaa 60

gcgggaaaag ctcaaattta aaatctggcg gtctttggcc gtccgagttg tagtctggag 120

aagtgctttc cgcgctggac cgtgtataag tctcttggaa cagagcgtca tagagggtga 180

gaatcccgtc tttgacacgg actaccagtg ctttgtgatg cgctctcaaa gagtcgagtt 240

gtttgggaat gcagctcaaa atgggtggtg aattccatct aaagctaaat attggcgaga 300

gaccgatagc gaacaagtac cgtgagggaa agatgaaaag cactttggaa agagagttaa 360

acagtacgtg aaattgctga aagggaaacg cttgaagtca gtcgcgttgt ctgggactca 420

gccttgcttt tgcttggtgc actttccgga tgacgggcca gcatcgattt tgaccgtcgg 480

aaaagggcta gggtaatgtg gcacctccgg gtgtgttata gactttagtc gcatacggcg 540

gtcgggatcg aggaacgcag cgcgccgtaa ggcaggggtt cgcccacttt cgcgcttagg 600

atgctggcgt aatggcttta aacgacccgt cttgaaacac ggaccaag 648

<210> 3

<211> 662

<212> DNA

<213> 皱盖假芝(Amauroderma rugosum)

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attatcgagt 60

cttgactggg ttgtagctgg ccttccgagg catgtgcacg ccctgctcat ccactctaca 120

cctgtgaact tactgtgggt ttcatatcgt gaagcgtgtc gtttaacggc tcgtgaagcg 180

gtctgtgcct gcgtttatta caaacccttg taaagtaata gaacgtgtat tgcgatgtaa 240

cgcatctata tacaactttc agcaacggat ctcttggctc tcgcatcgat gaagaacgca 300

gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 360

accttgcgct ccttggtatt ccgaggagca tgcctgtttg agtgtcatga aatcttcaac 420

ctaaaagcct ttgcgggttt gttaggcttg gacttggagg cttgtcggct cattagtcgg 480

ctcctcttaa atgcattagc ttggttcctt gcggatcggc tgtcggtgtg ataattgtca 540

acgccgcgac cgtgaagcgt ttggcgagct tctaaccgtc tcgttagaga cagattattg 600

acctctgacc tcaaatcagg taggactacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag 660

ga 662

Claims (10)

1.一种皱盖假芝菌种,其特征在于，所述皱盖假芝菌种的18s序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，28S序列为为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，ITS序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的皱盖假芝菌种,其特征在于，所述皱盖假芝菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020534。

3.权利要求1所述皱盖假芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培方法包括以下步骤：

母种制备：将权利要求1所述的皱盖假芝菌种接入母体培养料，22-28℃条件下培养，获得母种；

原种制备：将母种接入含原种培养料的菌袋，22-28℃缺氧条件下培养至菌丝长满菌袋，获得原种；所述原种培养料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；

栽培前处理：将原种接入含栽培料的菌袋，22-28℃、空气相对湿度为70-80％，避光、缺氧条件下培养至菌丝长满菌袋；所述栽培料的pH值为5.4-5.6，含水量为56-65％；

出芝：将栽培前处理后的菌袋移入22-28℃、空气相对湿度为80-120％的环境中，进行出芝栽培，至子实体生长成熟。

4.根据权利要求3所述皱盖假芝菌种的栽培方法，其特征在于，所述出芝步骤：出芝栽培前期，当芝柄高度小于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度大于0.1％；当芝柄高度大于5cm时，控制空气中二氧化碳浓度小于0.1％。

5.根据权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述原种制备步骤中，采用的原种培养料包括以下质量份的组分：干基料55-155质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份；所述干基料包括30-120质量份的主料与25-35质量份的辅料，所述主料包括木屑、竹屑、五节芒、玉米秸秆、棉籽壳、巨菌草、芦苇、芦竹、芒萁、斑茅或其组合物；所述辅料包括麦麸、米糠或其组合物。

6.根据权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述栽培前处理步骤中，采用的栽培料包括以下质量份的组分：干基料50-150质量份、玉米粉1-5质量份、磷酸二氢钾0.1-0.2质量份、石膏0.5-1质量份、轻质碳酸钙0.5-1质量份；所述干基料包括30-120质量份的主料与20-30质量份的辅料，所述主料包括木屑、竹屑、五节芒、玉米秸秆、棉籽壳、巨菌草、芦苇、芦竹、芒萁、斑茅或其组合物；所述辅料包括麦麸、米糠或其组合物。

7.根据权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述原种培养料和所述栽培料的含水量为60-65％。

8.根据权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述母种制备步骤中，采用的母体培养料由以下质量百分比含量的组分组成：马铃薯15-25％、琼脂1-2％、葡萄糖1-2％、鱼粉0.1-2％、磷酸二氢钾0.1-0.2％，余量为水。

9.根据权利要求3所述的栽培方法，其特征在于，所述原种制备和栽培前处理步骤在无菌条件下进行，含原种培养料的菌袋与含栽培料的菌袋在接种前进行108℃-125℃高压灭菌处理。

10.权利要求1所述皱盖假芝菌种的采摘和干燥方法，其特征在于，包括以下步骤：

采摘：按照权利要求3所述的栽培方法对权利要求1所述的皱盖假芝菌种进行栽培，当栽培料中出现原基后20-40天，在子实体生长到成熟、喷孢子前，子实体边缘的环状白边宽度减少至2mm以内，对子实体进行采摘；

干燥：将采摘下来的皱盖假芝子实体白色孔面朝上，在120℃以下进行干燥。

Images