CN105660191A - 一种乌芝子实体的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乌芝子实体的培养方法，包括下列步骤：通过母种、摇瓶种、发酵种，得到乌芝液体菌种；接种到乌芝培养基菌包，待菌丝长满菌包，即获得乌芝生产菌包；待菌丝长满菌袋后，后熟7-15天后，转移至出芝房进行层架式筐栽出芝管理；出芝管理所用的栽培筐不低于菌包15cm，每个菌包间隔10-12cm，栽培筐子顶部及高出菌包部分用膜裹封住进行乌芝培养；待子实体原基形成后，继续培养得到可采收的乌芝子实体。本发明根据乌芝子实体生长发育特性和研究试验，探索出人工培养乌芝子实体的方案。本发明为人工栽培的食用菌种类增加了新的品种，为乌芝研究和商业开发奠定坚实的基础。

Description

一种乌芝子实体的培养方法

技术领域

本发明具体涉及一种乌芝子实体的培养方法。

背景技术

随着人类社会的发展，人类“崇尚自然，回归自然”的呼声越来越高，人们对天然药物和天然保健品的社会需求日益增涨。食药用真菌以其多方面的生物活性和安全无毒副作用而备受青睐，挖掘新的食药用菌资源并进行人工驯化栽培，已成为食药用真菌行业研究热点。灵芝作为“药用菌之王”，其保健、药用功效早已得到世界的认可。“灵芝”其实是人们对灵芝科不同灵芝种属的一个统称，广义的灵芝包括灵芝科属的很多种类。目前世界上已有超过25种野生灵芝生长的记载，但是已商业化利用的不足10%，绝大部分的野生灵芝资源仍未被开发利用。假芝属是灵芝科的一个重要亚属，在灵芝科家族中占有一席之地，目前报道假芝属有22个种，全部分布在热带、亚热带地区，其中邹盖假芝（Amaurodermarude）、乌芝（Amaurodermarugosum）、黑假芝（Amaurodermanigrum）已经明确具有药用价值，在抗肿瘤、抗癌、抗氧化、消炎和提高免疫机能等方面有奇特效果（ChunweiJiaoetal，2013；Pui-MunChanetal.，2013；林杰，1996）。

乌芝，又称假芝(Amaurodermarugosum)，为灵芝科假芝属真菌，是一种热带亚热带地区特有的珍稀药用真菌（赵继鼎，1992；毕志树，1994）。最新的研究结果表明乌芝具有消炎、抗氧化等作用（Pui-MunChanetal.，2013；吴兴亮等，2013），在马来西亚作为一种传统的民间中草药用于治疗神经性癫痫等有奇特效果（Y.S.Changetal.，2004；M.A.Azlizaetal.，2012），在我国华南地区也有采摘、销售野生乌芝的传统习惯（黄年来，2010；戴玉成等，2008），不仅价格高，且常常供不应求，极具开发利用价值。由于野生乌芝生长速度十分缓慢，产量极低，仅靠自然供给远远不能满足人们的需求，目前仍未有关于乌芝子实体培养的有关文献报道，为此开展乌芝子实体培养十分迫切。

目前，世界范围内对假芝属真菌驯化栽培的研究报道较少，仅少数真菌分类学者报道了其分类位置，采摘时间、地点等（上海农科院食用菌所，1991；Pelger，1973；AustralianFungi-ABlog，2007）。国内一些学者对皱盖假芝菌丝液体深层发酵条件（郑用林等，2007；马海昇等，2007；夏险等，2012；王谦等，2005）及引种袋料栽培（张红红等，2014）、富硒菌株筛选等做了一些报道（张晓等，2012）；黄龙花等申请了“一种皱盖假芝的人工栽培方法”专利（申请号：CN201310737785.6），通过修剪、通气刺激等管理方式实现皱盖假芝的人工栽培。但是，目前没有关于乌芝子实体培养的相关文献报道。

乌芝（也称假芝）的子实体的生长特性与目前栽培的赤灵芝、紫灵芝等常规灵芝品种不同，采用常规灵芝栽培管理方式不能很好的获得乌芝子实体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乌芝子实体的培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种乌芝子实体的培养方法，包括下列步骤：

1)挑取乌芝纯菌丝体培养得到乌芝母种；

2)挑取乌芝母种进行扩大摇瓶培养，得到乌芝摇瓶种；

3)将乌芝摇瓶种进一步扩大至发酵罐中培养4-6d，得乌芝液体菌种；

4)将乌芝液体菌种接种到乌芝培养基菌包，待菌丝长满菌包，即获得乌芝生产菌包；

5)后熟7-15天后，将乌芝生产菌包转移至出芝房进行层架式筐栽出芝管理；出芝管理所用的栽培筐不低于菌包15cm，每个菌包间隔10-12cm，栽培筐顶部及高出菌包部分用膜包裹封住进行乌芝培养；待子实体原基形成后，继续培养，待乌芝成熟后进行采收，得到乌芝子实体。

优选的，步骤1)～步骤4)的培养条件为黑暗、24～27℃的温度和60%-75%的空气相对湿度。

优选的，步骤1)～步骤3)所用的培养基，包含下列重量百分比的组分：去皮马铃薯16%-24%、葡萄糖1.6%-2.4%、蛋白胨0.16%-0.24%、牛肉膏0%-0.2%、磷酸二氢钾0.24%-0.36%、硫酸镁0.12%-0.18%，VB₁0.024%-0.0036%、pH7-8。

优选的，步骤1）中的培养基中加入适量的琼脂。

优选的，步骤3）中的培养基中还需加入适量消泡剂。

优选的，步骤3)中，接种量为发酵罐培养液体积的8%-12%，通气量为体积比（0.8-1.2）：（0.8-1.2）。

优选的，步骤4）中乌芝培养基菌包中的培养基，包含下列重量百分比的组分：20-25%棉籽壳、18-22%杂木屑、18-22%玉米芯、8-12%花生壳、8-12%大豆秆、4-6%麦麸、1.6-2.4%玉米粉、4-6%咖啡渣、0.8-1.2%蔗糖、0.8-1.2%碳酸钙、1.6-2.4%石灰、0.8-1.2%复合肥。

优选的，步骤4）中乌芝培养基菌包的制作方法如下：将培养基各组分按重量称好，加水混合均匀，蔗糖溶于水中一同加入，调整基质含水量为58%-62%，pH值7-8，压制成型。

优选的，步骤4）接种量为3%-5%，按质量百分比计。

优选的，步骤5）中的培养条件为空气相对湿度80%-90%，提供充足氧气以及散射光，避免阳光直射，温度控制在25-30℃。

优选的，步骤5）中的层架式筐栽出芝管理中，栽培筐顶部及高出菌包部分用一层保鲜膜包裹。

优选的，步骤5）中的层架式筐栽出芝管理中，将封好膜的栽培筐整齐摆放在栽培架上，层距高于栽培筐不少于10cm，层架数视房间高度而定，最高一层架子距离屋顶不少于1m。

优选的，步骤5）中乌芝成熟的判断标准为：当子实体边缘没有白色边，菌盖完全变灰褐色，用力触碰、划割子实体均不再出现红色液体，再经7-10天时间让菌盖增厚，即可进行采收。

本发明的有益效果：

本发明根据乌芝子实体生长发育特性和研究试验，探索出人工培养乌芝子实体的方案。本发明为人工栽培的食用菌种类增加了新的品种，为乌芝研究和商业开发奠定坚实的基础。

本发明采用乌芝液体菌种做生产用种，大大缩短了制种时间，液体菌种从母种到液体菌种培养仅需20-27天，比固体制种时间缩短60%-70%。栽培菌包接种液体生产种后萌发快，长势好，经30-40天即可长满菌包，层架式筐栽出芝管理方式能很好地获得乌芝子实体，且节省制种、栽培房间面积，高效、简单、快捷。乌芝子实体经培养50-60天左右即可采收。利用本发明培育的乌芝子实体商品性好，生物转化率高，子实体粗多糖含量高，品质好。本发明具有简单、高效、易于工厂化、规模化操作的特点。

本发明提供了一种适宜于乌芝生长的菌包培养基，其中包括以下成分：棉籽壳、杂木屑、玉米芯、花生壳、大豆秆、麦麸、玉米粉、咖啡渣、蔗糖、碳酸钙、石灰、复合肥。所述培养基，专门针对乌芝生长优选设计，富含氮源、碳源、矿物质、维生素等，并充分利用农林及加工业的下脚料，特别是咖啡渣等世界性头号消费废弃物，变废为宝，减轻对环境的压力的同时，拓宽食用菌生产原材料来源。利用此培养基，乌芝在生长中可以获得充分的养分，生产出的乌芝子实体商品性好，生物转化率为10%-20%，子实体粗多糖含量高（3.22%），品质好。相较于一般灵芝，中华寺灵芝的粗多糖仅为0.76%，南韩赤为0.75%（李鑫龙,赵鑫,吴杰,等.中华寺灵芝引种驯化栽培及主要营养成分评价[J].时珍国医国药,2009,20(9):2267-2269.）。

本发明采取层架式筐式栽培技术，是驯化栽培成功因素之一。栽培筐要求高于菌包15cm以上，且在栽培筐顶部及高出菌包部分用一层保鲜膜封住，层架式筐式栽培技术为乌芝子实体生长发育提供一个适合的小环境，此外，保鲜膜具有良好的透气性，不影响栽培框内外氧气的交流，使子实体更健康的生长，获得商品性好、产量高的乌芝子实体。

本发明首次公开了乌芝采收的判断标准为：当子实体边缘没有白色边，菌盖完全变灰褐色，用力触碰、划割子实体均不再出现红色液体，再经7-10天时间让菌盖增厚，即可进行采收。一般情况下，乌芝子实体生长50-60天即可发育成熟，传统的判断方法是：当子实体边缘没有白边，菌盖完全变灰褐色时，进行采摘。但是本研究发现，虽然菌盖不再横向分化，但是用力触碰、划割子实体仍会出现红色液体，此时采摘得到的乌芝子实体产量和品质均未达到最佳水平。如果等待菌盖继续纵向生长，此过程中如果没有精准的时间控制和判断方法，往往导致乌芝生长进入衰老期，获得的子实体品质反而会下降，如粗多糖的含量反而下降，此外，商品性也会受影响，甚至会导致病虫害的发生。所以本发明经过反复实验总结出上述标准。此时获得的子实体更加厚实，多糖等有效成分积累更多，能获得最高产量和最佳品质。

附图说明

图1为乌芝采收标准效果图；

图2为对比例1所获乌芝与本发明的对比效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

乌芝采集来源：①从野外采集到新鲜的乌芝子实体，通过组织分离，获得乌芝一级试管母种；②从正规的科研单位购买、引进乌芝一级试管母种。

实施例1

一种乌芝的培养方法，该方法步骤如下：

（1）、挑取部分乌芝纯菌丝体（0.5cm²）接种到新的试管培养基中（培养基配方为：去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.3%、琼脂2%、硫酸镁0.15%，VB₁0.003%、pH7-8），在一定条件下（黑暗、环境温度25±1℃、空气相对湿度60%-75%等适宜条件）培养10-15天，获得可供繁殖的菌种—一级种（母种）。

（2）、用已灭菌的接种勾勾取试管母种0.5cm²种块10块，接种至装100mL液体培养基的250mL三角瓶中（培养基配方为：去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、牛肉膏0.2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%，VB₁0.003%、pH7-8），置旋转式摇床，26±1℃，120-150rpm振荡培养5-7d，得摇瓶种，备用。

（3）、将培养好的三角瓶液体种在无菌条件下接种至装有10L液体培养基的小型发菌罐中（培养基配方为：去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、牛肉膏0.2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、VB₁0.003%、消泡剂0.05%，pH7-8），接种量为10%（V:V），26±1℃，通气量1:1（V:V），培养5d，得液体菌种备用。

（4）、利用棉籽壳、杂木屑、玉米芯、花生壳、大豆秆、麦麸、玉米粉、咖啡渣、蔗糖、碳酸钙、石灰、复合肥等为原材料，配制含水量为58%～62%，pH值7～8的培养基。培养基配方按重量百分比计：由23%棉籽壳、20%杂木屑、20%玉米芯、10%花生壳、10%大豆秆、5%麦麸、2%玉米粉、5%咖啡渣、1%蔗糖、1%碳酸钙、2%石灰、1%复合肥组成。将所需培养料按重量称好，加水混合均匀，蔗糖直接溶于水中一同加入，调整基质含水量为58%-62%，pH值7-8。调配好的培养基装袋或装瓶，进行高压（121℃,0.15MPa，3h）或常压（100℃,10-12h）灭菌，冷却后在无菌条件下接入乌芝液体种，接种量为3%-5%，在黑暗和一定温度（26±1℃）、湿度（空气相对湿度65%-75%）条件下进行培养30-50天，菌丝长满菌包，即获得乌芝生产菌包。

（5）、菌丝长满菌袋后，后熟7-13天即可拿到出芝房进行层架式筐栽出芝管理。出芝房要求有足够的散射光，避免阳光直射，温度控制在25-30℃。打开菌包袋口，去除表面老种块，整齐放于栽培筐中，栽培筐高于菌包15cm以上，每个菌包间隔10cm，防止子实体生长过程中相互接触影响正常生长，栽培筐子顶部及栽培筐四周高出菌包部分（15cm），用一层保鲜膜封住，为乌芝子实体生长发育提供一个适合的小环境。封好膜的栽培筐整齐摆放在栽培架上，层距高于栽培筐10cm以上即可，层架数视房间高度而定，但最高一层架子离屋顶应不少于1m。给予空气相对湿度80%-90%，充足氧气，诱导乌芝原基形成，经5-10天诱导即出现原基。子实体原基形成后，继续给予80%-90%的空气相对湿度，温度保持25-30℃，加强通风换气，并给予足够的散射光，但不能阳光直射，再经30-40天培养后即可形成可采收的子实体。

（6）、当子实体边缘没有白色边，菌盖完全变灰褐色时，用力触碰、划割子实体均不再出现红色液体，再经7-10天时间让菌盖增厚，即可进行采收。采收时把乌芝子实体整个从培养基上摘下来，注意避免损伤菌丝，以免影响下一批子实体的生长。可反复采收2-3批。

采收标准见图1：其中图1a和1b为未成熟的乌芝的正、侧面，此时子实体边缘呈白色，划割子实体出现红色液体；图1c和1d为成熟的乌芝的正、侧面，此时子实体边缘呈灰褐色，划割子实体没有出现红色液体。

乌芝成分检测

对实施例1所获得的乌芝进行成分的检测，结果见表1。

表1乌芝成分检测结果

粗多糖，也就是俗称的灵芝多糖，灵芝多糖具有免疫调节，抗肿瘤，抗衰老，清除氧自由基，活血化瘀，抗凝血，降血糖及护肝等的功效。从表1可知，本发明所获的乌芝子实体粗多糖含量高达3.22%，生物转化率10%-20%，品质好，具有良好的市场前景。

本发明的人工培养乌芝子实体的方法，为人工栽培的食用菌种类增加了新的品种，为乌芝研究和商业开发奠定坚实的基础。

对比例1

利用张红红等人的文章《粤北地区血芝袋料栽培技术初探》（张红红，巫宝花.粤北地区血芝袋料栽培技术初探[J].特种经济动植物，2014，17（5）：44-45）中所提到的灵芝培养方法栽培乌芝，和本发明方法进行对比。

所获得子实体较实施例1所获得的乌芝子实体低、矮，且容易发生杂菌污染，反复采收1-2批。效果图见图2。其中图2a和2b为对比例1乌芝效果图，图2c和2d为实施例1培养的乌芝效果图。

从图2可知，普通培养条件下乌芝生长缓慢，子实体原基和幼芝阶段容易受伤，子实体菌柄短、菌盖薄，商品性差，且容易受杂菌污染；而本发明培养的乌芝，正常健康生长，子实体圆正、健壮，菌柄长，菌盖厚，商品性好，原基和幼芝阶段受杂菌感染几率大大降低。

对比例2

根据付立忠等人在第二届全国食用菌中青年专家学术交流会发表的文章《灵芝不同生长发育期多糖和三萜含量变化规律》（付立忠,吴学谦,李明焱,等.灵芝不同生长发育期多糖和三萜含量变化规律[C]//第二届全国食用菌中青年专家学术交流会.2008.），文章结果表明，不同灵芝菌株在不同生长发育期的子实体粗多糖和三萜含量均存在显著或极显著差异，其中粗多糖含量多为现蕾期时最高，芝盖形成期有所降低，成熟期又有所增加，衰老期又大幅度降低，兼顾到产量和品质，一般都是成熟期采收的。根据文章提及的灵芝成熟期判断标准，对实施例1培养的乌芝，于乌芝菌盖不再生长扩大，子实体边缘淡黄色生长线刚刚消失，尚未弹射孢子时，进行乌芝子实体的采收。检测乌芝子实体粗多糖含量为2.35%。结果显示：对比例2采收的乌芝中的粗多糖含量明显低于本发明实施例1采收的乌芝的粗多糖含量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种乌芝子实体的培养方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）挑取乌芝纯菌丝体培养得到乌芝母种；

2）挑取乌芝母种进行扩大摇瓶培养，得到乌芝摇瓶种；

3）将乌芝摇瓶种进一步扩大至发酵罐中培养4-6d，得乌芝液体菌种；

4）将乌芝液体菌种接种到乌芝培养基菌包，待菌丝长满菌包，即获得乌芝生产菌包；

5）后熟7-15天后，将乌芝生产菌包转移至出芝房进行层架式筐栽出芝管理；出芝管理所用的栽培筐不低于菌包15cm，每个菌包间隔10-12cm，栽培筐顶部及高出菌包部分用膜包裹封住进行乌芝培养；待子实体原基形成后，继续培养，待乌芝成熟后进行采收，得到乌芝子实体。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)～步骤4)的培养条件为黑暗、24～27℃的温度和60%-75%的空气相对湿度。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)～步骤3)所用的培养基，包含下列重量百分比的组分：去皮马铃薯16%-24%、葡萄糖1.6%-2.4%、蛋白胨0.16%-0.24%、牛肉膏0%-0.2%、磷酸二氢钾0.24%-0.36%、硫酸镁0.12%-0.18%，VB₁0.024%-0.0036%、pH7-8。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3)中，接种量为发酵罐培养液体积的8%-12%，通气量为体积比（0.8-1.2）：（0.8-1.2）。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤4）中乌芝培养基菌包中的培养基，包含下列重量百分比的组分：20-25%棉籽壳、18-22%杂木屑、18-22%玉米芯、8-12%花生壳、8-12%大豆秆、4-6%麦麸、1.6-2.4%玉米粉、4-6%咖啡渣、0.8-1.2%蔗糖、0.8-1.2%碳酸钙、1.6-2.4%石灰、0.8-1.2%复合肥。

6.根据权利要求1或5所述的培养方法，其特征在于，步骤4）中乌芝培养基菌包的制作方法如下：将培养基各组分按重量称好，加水混合均匀，蔗糖溶于水中一同加入，调整基质含水量为58%-62%，pH值7-8，压制成型。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5）中的培养条件为空气相对湿度80%-90%，提供充足氧气以及散射光，避免阳光直射，温度控制在25-30℃。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5）中的层架式筐栽出芝管理中，栽培筐顶部及高出菌包部分用一层保鲜膜包裹。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5）中的层架式筐栽出芝管理中，将封好膜的栽培筐整齐摆放在栽培架上，层距高于栽培筐不少于10cm，层架数视房间高度而定，最高一层架子距离屋顶不少于1m。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5）中乌芝成熟的判断标准为：当子实体边缘没有白色边，菌盖完全变灰褐色，用力触碰、划割子实体均不再出现红色液体，再经7-10天时间让菌盖增厚，即可进行采收。