CN114766285A

CN114766285A - 一种白肉灵芝菌株l4495及其栽培方法与应用

Info

Publication number: CN114766285A
Application number: CN202210455471.6A
Authority: CN
Inventors: 何俊; 李树红; 李娥贤; 叶洋; 罗红梅; 方晓军
Original assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114766285B

Abstract

本发明涉及一种白肉灵芝菌株L4495及栽培方法与应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62104。本发明通过液体发酵培养的方法制作菌种，将获得的液体菌种接种于栽培袋中，发菌完成后种植于经济林下，发现经济林下种植相较设施栽培投入少、管理简单、品质高、效益好，栽培白肉灵芝L4495多糖含量在1.58%，三萜含量在3.26%。本发明驯化得到了适宜林下栽培的白肉灵芝野生菌株资源，开展液体深层发酵培养，为灵芝属的种质资源异地保护和进一步开发利用奠定基础。另外，白肉灵芝菌株L4495的子实体或者发酵液可用于制备抗肿瘤的药物。

Description

一种白肉灵芝菌株L4495及其栽培方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种白肉灵芝菌株L4495及栽培方法与应用。

背景技术

灵芝Ganoderma spp.隶属于担子菌门Basidiomycota多孔菌目Polyporals灵芝科Ganodermataceae灵芝属Ganoderma，被誉为百草之王，子实体生长常见夏、秋季单生、群生腐生在枯立木、倒木、树桩或活立木上，是中国名贵传统中药材，在我国已有2000多年的药用历史。明代李时珍的《本草纲目》记载灵芝：其味苦平、无毒、补中益气、增智慧、好颜色，久食轻身不老，延年神仙。现代医学研究证明，灵芝中三萜、多糖类等活性成分对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著效果。

白肉灵芝是我国西南高原地区灵芝属的重要种类之一，过去很长时间被认为是亮盖灵芝，直到2015年鉴定为灵芝属新种，才被人们广泛认识。目前研究报道表明白肉灵芝活性成分多糖和三萜含量高于赤芝、紫芝等其他品种；野生白灵芝多糖和三萜类化合物显著高于其他灵芝品种。通过人工驯化栽培的白肉灵芝，其活性成分多糖和三萜含量较野生白肉灵芝有所提高。而云南栽培白肉灵芝因有独特的高原气候滋养，活性成分和功效远远高于普通灵芝，产品价格往往比普通灵芝高数倍，市场开发前景广阔。

本申请的灵芝属菌株是在云南省楚雄州武定县插甸镇老木坝村山上采集并分离的新菌种，经研究，未见该菌种的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种白肉灵芝菌株L4495液体发酵及林下栽培方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种白肉灵芝菌株L4495，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62104。

本发明同时提供上述白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)，无菌条件下通过取白肉灵芝菌株L4495组织，接种到PDA培养基的上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养9-11d；

步骤(2)，将步骤(1)培养好的菌种接种于液体培养基中，置于摇床中26-28℃、140-160r/min培养11-13天；

其中，液体培养基为：可溶性淀粉5.9-6.1g，黄豆粉0.48-0.51g，磷酸二氢钾0.29-0.31g，MgSO₄·7H₂O 0.48-0.52g，VB₂ 0.09-0.11g，水200mL；pH＝6.9-7.1；

步骤(3)，将步骤(2)培养好的液体菌种接种至栽培袋中，置于23-25℃培养室中暗培养至菌丝长满栽培袋；

栽培袋中栽培基质包括按照质量分数计的如下组分：阔叶树木屑66-68份、麸皮19-21份、甘蔗渣10-12份、石膏0.98-1.02份、石灰1.98-2.02份；含水量60-65％

步骤(4)，将步骤(3)培养好的栽培袋运至经济林下覆土栽培，待子实体长至成熟，菌盖边缘仅有1-2mm淡黄边时采收子实体。

进一步，优选的是，步骤(1)中，取1-1.5cm白肉灵芝菌株L4495组织接种到PDA培养基中。

进一步，优选的是，步骤(2)中，取蚕豆粒大小的1至2块接种于液体培养基中；

液体培养基为：可溶性淀粉6.03g，黄豆粉0.49g，磷酸二氢钾0.3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，VB₂ 0.1g，水200mL；pH＝6.93；

进一步，优选的是，步骤(2)中，摇床培养温度为27℃，摇床培养转速为150r/min；

进一步，优选的是，步骤(3)中，将步骤(2)培养好的液体菌种以每袋20ml的量接种至栽培袋中，置于23-25℃培养室中暗培养25-35天至菌丝长满栽培袋。

进一步，优选的是，步骤(4)中，在经济林下覆土栽培的具体方法为：选取背阴保水、林木茂盛的经济林地块，地上挖出29-31cm深，95-105cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出29-31cm深、39-41cm长、14-16cm宽的畦，将步骤(3)培养好的栽培袋上表面开3-4cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土3-5cm栽培。

进一步，优选的是，步骤(4)中，栽培后120至150天，子实体长至成熟。

本发明还提供上述灵芝属菌株L4495的菌丝体或者发酵液在制备抗肿瘤的药物中的应用。

采用液体摇床发酵具有生长周期短、成本价格低、产量大、可适于工厂化生产等优点。本发明以云南省楚雄州武定县插甸镇老木坝村山上采集的一株野生灵芝进行分类鉴定，以液体摇床发酵培养制作液体菌种。液体菌种接种于栽培袋中，发菌后将其运到武定县插甸镇老木坝村林下栽培，由于栽培地与野生菌株采集地为同一地段，海拔以及气候条件适宜，栽培白肉灵芝出芝整齐、产量高，商品性状好，多糖和三萜含量比野生菌株略有提高。

插甸镇老木坝村本地青壮年多已外出务工，留村人员多为老人小孩，劳动强度大的产业已不适应在当地推广，而林下灵芝栽培是粗放型管理，正好适应当地的实情。将林下灵芝种植做为当地特有品牌、特色产业做大做强，对全面提升产业技术创新能力和综合生产能力，将起到积极推动作用。

本发明白肉灵芝属菌株L4495含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。采用2020版《中华人民共和国药典》药用灵芝多糖、三萜含量检测方法进行检测，多糖含量在1.58％，三萜含量在3.26％。灵芝多糖具有广泛的药理活性，能降血糖，降血脂，抗血栓，抗氧化，清除自由基，抗衰老，抗辐射，抗肿瘤，促进血流循环，调节免疫，调节核酸、蛋白质代谢，促进DNA合成，促进人体脐血LAK细胞增殖。灵芝三萜类化合物具有抗炎、镇痛、镇静、抗衰老、毒杀肿瘤细胞、抗缺氧等作用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明提供一种灵芝属菌株L4495，通过对该菌株进行形态鉴定、多基因序列比对分析确定了该菌株分类学地位，属于高活性物质来源的白肉灵芝Ganodermaleucocontextum。

本发明以该菌株菌丝体生物量干重为主要指标，对其进行液体摇床发酵培养。其中，最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为黄豆粉，最适无机盐磷酸二氢钾与硫酸镁比值为3:5，在温度27℃、pH＝7和摇床转速150r/min培养12天，可获得的菌丝体生物量为5.78g/L。

本发明以采集于云南省楚雄州武定县插甸镇老木坝村的野生白肉灵芝菌株L4495分离菌种，并制做液体菌种接种于栽培菌袋中，将菌袋运到武定县插甸镇老木坝村林下栽培，由于栽培地与野生菌株采集地为同一地段，海拔以及气候条件适宜，栽培白肉灵芝多糖含量为1.58％，三萜含量为3.26％。经济果林下种植产出白肉灵芝袋均鲜重130g，生物学效率15％，菌盖均长10.5-15.6cm，宽3-5cm，栽培白肉灵芝L4495色泽鲜艳，菌肉肥厚，商品性状优异。

云南省楚雄州武定县插甸镇老木坝村森林覆盖率99％，属高海拔冷凉地区，境内立体气候明显，野生食用菌物种多样性丰富。本发明经过多年的努力，分离驯化了当地灵芝菌种，采用液体发酵培养接种于栽培菌袋中，发菌完成后将菌袋运到野生菌株来源地进行林下种植试验示范。种植模式主要采用林下原生态种植和核桃林下套种两种，与设施栽培相比投入少、管理简单、品质高、效益好。另一方面，由于栽培地与采集地为同一地段，海拔以及气候条件适宜，栽培白肉灵芝出芝整齐、产量高，商品性状好，多糖和三萜含量比野生菌株略有提高。目前每亩灵芝收益可达5000多元，比种植传统作物增加了一到两倍的收益。白肉灵芝菌株L4495在当地经济林下栽培成功，有助于推动高寒山区白肉灵芝的栽培生产，对当地高原特色现代食用菌产业发展，促进产业打造和乡村振兴建设有积极的推动作用。

附图说明

图1为野生白肉灵芝L4495形态鉴定图；其中，a，b:担子果(子实体)；c:子实体下表面；d：菌盖切面形态；e，f：担孢子；g，h：纯培养菌丝体；i:纯培养；j，k，l：液体发酵菌丝体形态。标尺：e，f＝21um；g，h＝25um；j＝35um；k，l＝18um；

图2为白肉灵芝菌株L4495不同碳源液体发酵对比结果；

图3为白肉灵芝菌株L4495不同氮源液体发酵对比结果；

图4为白肉灵芝菌株L4495不同温度液体发酵对比结果；

图5为白肉灵芝菌株L4495不同pH液体发酵对比结果；

图6为白肉灵芝菌株L4495不同无机盐液体发酵对比结果；

图7为白肉灵芝菌株L4495液体摇瓶培养生长图；

图8驯化栽培的白肉灵芝L4495子实体；

图9白肉灵芝L4495核桃林下栽培出菇情况；其中，a：白肉灵芝林下栽培前准备；b：小拱棚栽培模式；c：拱棚内子实体生长情况；d、e：子实体成熟期；

白肉灵芝属菌株(Ganoderma leucocontextum)L4495，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62104，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

1鉴定方法

1.1形态鉴定

通过相机和电子显微镜对本发明菌株、菌孔、孢子体、菌丝体、菌球进行初步形态鉴定，依据野生子实体宏观和微观形态特征，对菌株进行初步形态学鉴定，结果如图1。

菌株子实体形态呈扇形；菌盖下面为白色，边缘薄而钝；菌盖表面为褐色，有光泽、褶皱明显(图1a，b)；菌孔分布均匀(图1c)；菌肉呈木质化，质地均匀(图1d)；孢子体椭圆形，在其表面有网状孔格(图1e，f)；菌丝体无色透明，壁薄，具有分枝(图1g，h)；液体发酵后菌丝体呈现球形，无色透明，边缘有分枝(图1j，k，l)；固体培养菌落呈白色，放射状生长，边缘比较稀疏，中心浓密(图1i)。

1.2分子系统发育分析

通过无菌操作技术，将经表面消毒的菌株菌盖撕开，用镊子从菌肉挑取适量大小的组织放入离心管内。采用Ezup离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取菌株DNA。

选择四个基因片段：ITS、LSU、TEF-1a和RBP2，具体引物的碱基组成如表1，采用RNA聚合酶链反应(PCR)技术扩增ITS(ITS5/ITS4)、nLSU(LR0R/LR5)、TEF1-α(983F/1567R)和RPB2(fRrbp2-6F/fRrbp2-7cR)基因。PCR反应体系(25μl)包括：2.5μl PCR反应缓冲液、2.5μl 0.2％BSA、2μl dNTP(2.5mmol)、浓度为100pmol/μl的上下游引物各0.5μl、、1μl DNA溶液和16μl无菌ddH₂O。

表1

注：碱基包括a、t、c、g，引物中出现其他字母代表简并碱基。

扩增反应为：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃50s，共35个循环；最后72℃10min，扩增完成产物放置于4℃保存。将扩增得到的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序回来的序列用BioEdit软件选取序列，通过NCBI网站Nucleotide BLAST确定所属分类学地位。确定该菌株与灵芝菌株G86相似度为99.82％，确定为为白肉灵芝Ganoderma leucocontextum。

L4495菌株的特征序列：ITS、nrLSU、tef1α、rpb2如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示。

实施例1

白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，无菌条件下通过取白肉灵芝菌株L4495组织，接种到PDA培养基的上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养10d；

步骤(2)，将步骤(1)培养好的菌种接种于液体培养基中，置于摇床中27℃、150r/min培养12天；

其中，液体培养基为：可溶性淀粉6g，黄豆粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，VB₂ 0.1g，水200mL；pH＝7；

步骤(3)，将步骤(2)培养好的液体菌种接种至栽培袋中，置于24℃培养室中暗培养至菌丝长满栽培袋；

栽培袋中栽培基质包括按照质量分数计的如下组分：阔叶树木屑67份、麸皮20份、甘蔗渣11份、石膏1份、石灰2份；含水量60-65％

实施例2

白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，无菌条件下通过取白肉灵芝菌株L4495组织，接种到PDA培养基的上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养9d；

步骤(2)，将步骤(1)培养好的菌种接种于液体培养基中，置于摇床中26℃、140r/min培养11天；

其中，液体培养基为：可溶性淀粉5.9g，黄豆粉0.48g，磷酸二氢钾0.29g，MgSO₄·7H₂O 0.48g，VB₂ 0.09g，水200mL；pH＝6.9；

步骤(3)，将步骤(2)培养好的液体菌种接种至栽培袋中，置于23℃培养室中暗培养至菌丝长满栽培袋；

栽培袋中栽培基质包括按照质量分数计的如下组分：阔叶树木屑66份、麸皮19份、甘蔗渣10份、石膏0.98份、石灰1.98份；含水量60-65％

步骤(1)中，取1cm白肉灵芝菌株L4495组织接种到PDA培养基中。

步骤(2)中，取蚕豆粒大小的1接种于液体培养基中；

步骤(3)中，将步骤(2)培养好的液体菌种以每袋20ml的量接种至栽培袋中，置于23℃培养室中暗培养35天。

步骤(4)中，在经济林下覆土栽培的具体方法为：选取背阴保水、林木茂盛的经济林地块，地上挖出29cm深，95cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出29cm深、39cm长、14cm宽的畦，将步骤(3)培养好的栽培袋上表面开3cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土3cm栽培。

步骤(4)中，栽培后135天，子实体长至成熟。

实施例3

白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，无菌条件下通过取白肉灵芝菌株L4495组织，接种到PDA培养基的上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养11d；

步骤(2)，将步骤(1)培养好的菌种接种于液体培养基中，置于摇床中28℃、160r/min培养13天；

其中，液体培养基为：可溶性淀粉6.1g，黄豆粉0.51g，磷酸二氢钾0.31g，MgSO₄·7H₂O 0.52g，VB₂ 0.11g，水200mL；pH＝7.1；

步骤(3)，将步骤(2)培养好的液体菌种接种至栽培袋中，置于25℃培养室中暗培养至菌丝长满栽培袋；

栽培袋中栽培基质包括按照质量分数计的如下组分：阔叶树木屑68份、麸皮21份、甘蔗渣12份、石膏1.02份、石灰2.02份；含水量60-65％

步骤(1)中，取1.5cm白肉灵芝菌株L4495组织接种到PDA培养基中。

步骤(2)中，取蚕豆粒大小的2块接种于液体培养基中；

步骤(3)中，将步骤(2)培养好的液体菌种以每袋20ml的量接种至栽培袋中，置于25℃培养室中暗培养25天。

步骤(4)中，在经济林下覆土栽培的具体方法为：选取背阴保水、林木茂盛的经济林地块，地上挖出31cm深，105cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出31cm深、41cm长、16cm宽的畦，将步骤(3)培养好的栽培袋上表面开4cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土5cm栽培。

步骤(4)中，栽培后150天，子实体长至成熟。

实施例4

白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，包括如下步骤：

其中，液体培养基为：可溶性淀粉6.03g，黄豆粉0.49g，磷酸二氢钾0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，VB₂ 0.1g，水200mL；pH＝6.93；

步骤(1)中，取1.2m白肉灵芝菌株L4495组织接种到PDA培养基中。

步骤(2)中，取蚕豆粒大小的2块接种于液体培养基中；

步骤(3)中，将步骤(2)培养好的液体菌种以每袋20ml的量接种至栽培袋中，置于24℃培养室中暗培养30天至菌丝长满栽培袋。

步骤(4)中，在经济林下覆土栽培的具体方法为：选取背阴保水、林木茂盛的经济林地块，地上挖出30cm深，100cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出30cm深、40cm长、15cm宽的畦，将步骤(3)培养好的栽培袋上表面开3.5cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土4cm栽培。

步骤(4)中，栽培后120天，子实体长至成熟。

应用实例

1液体培养

1.1材料

1.1.1实验样品

采集于云南省楚雄州武定县插甸镇老木坝村山上，编号L4495。

1.1.2仪器

仪器：立式恒温培养振荡器，电子卤素水分测定仪(上海菁海仪器有限公司)，溶剂过滤器(天津市科亿隆实验设备有限公司)。

1.1.3培养基

PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，1L蒸馏水，pH自然。培养基制作及灭菌方法，将200g削皮马铃薯剁碎加水至1L煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣得到马铃薯淀粉液1L，依次将琼脂18g、葡萄糖20g放入搅拌煮至沸腾，倒入2个500ml锥形瓶中，盖上专用石棉网纸，用橡筋扎紧，防止培养基高温扑出。高温高压，121℃灭菌25min，气压降为0时取出，在超净工作台上，酒精灯旁倒入直径5cm平板中，倒入量为平板下层高度的1/3，冷却待用。

液体培养基：为提高实验数据的科学性和准确性，所有实验均为五个重复，所配制溶液均为200mL。

实验组：葡萄糖5g，蛋白胨0.5g，磷酸二氢钾0.6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，VB₂ 0.1g，水200mL，24℃恒温摇床培养。

碳源：200mL实验组中蛋白胨为固定氮源，设碳源空白为对照组，分别以葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽浸粉、蔗糖、乳糖为碳源，置于24℃恒温摇床培养。。

氮源：200mL实验组中葡萄糖为固定碳源，设氮源空白为对照组，分别以蛋白胨、酵母粉、氯化铵、尿素、黄豆粉为氮源，置于24℃恒温摇床培养。

温度：200mL实验组为基础，温度差为3℃，分别设为15℃，18℃，21℃，24℃，27℃，30℃。

pH：200mL实验组为基础，pH设为3，4，5，6，7，8，9，10，24℃恒温摇床培养。

无机盐：200mL实验组为基础，磷酸二氢钾与硫酸镁的比值设为0:0，1:1，5:3，3:5，1:3，3:1，24℃恒温摇床培养。

具体如表2所示。

表2液体培养基配方

备注，本发明条件是pH＝6.93，27℃、150r/min培养12天。

1.2液体摇床发酵培养研究

1.2.1菌种扩繁

将保存在4℃冰箱的菌株取出，室温活化2h，并转入到新配置的PDA培养基平板上进行复壮，置于24℃的培养箱里发菌培养备用。

1.2.2摇瓶培养基配制

按照表1分别配置不同的液体培养基各200mL，置于250mL锥形瓶中封口，将配置好的培养基放置在121KPa，30℃灭菌锅中灭菌，灭菌后置于超净工作台中冷却备用。

1.2.3灭菌

将实验所需要的工具，如手术刀，直径5mm打孔器、酒精灯、酒精棉放置于超净工作台中紫外线灭菌25min。

1.2.4接种

将实验所需要的手术刀，直径5mm打孔器，酒精灯，酒精棉球等工具放置于超净工作台中灭菌25min。点燃酒精灯，用酒精棉球分别对擦拭打孔器和手术刀后放置在酒精灯上灼烧，待冷却后取出实验前培养好的菌种平板，用打孔器在平板上打出直径大小相同的孔，再用手术刀轻轻取下培养基表面的菌种，接入到配置好培养基的锥形瓶中，每瓶分别接入六块大小相同的菌种。

1.2.5摇床培养和观察

将接种完成的锥形瓶放置在相应培养温度的立式恒温培养振荡器中进行培养，培养参数为150r/min，12d。每相隔一天对接有菌种的锥形瓶每组随机抽查三瓶进行观察和拍照记录。

1.2.6生物量测定

取出锥形瓶，将瓶中的培养基倒入溶剂过滤器中进行过滤，将过滤完成的菌球放入电子卤素水分测定仪中烘干并对其进行生物量测定。

1.3生产制种

采用优化后的液体培养基(可溶性淀粉6.03g、黄豆粉0.49g、磷酸二氢钾0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、VB₂ 0.1g，水200mL；pH＝6.93，27℃、150r/min培养12天)培养液体菌种，以每袋菌液量20ml用注射器注射接入灵芝固体袋料栽培菌种的袋口部位。

栽培种培养基配方：按重量份数计，阔叶树木屑66-68份、麸皮19-21份、甘蔗渣10-12份、石膏0.98-1.02份、石灰1.98-2.02份。含水量60-65％。用直径15-17cm、长25-45cm、厚3-4丝米的聚丙烯塑料袋作为栽培袋。将培养料拌好后，焖放半小时后装料。装好袋后及时灭菌，以防培养料发酵变质。灭菌时，将料袋分层排放在高压蒸汽锅内，经121℃下高压灭菌2h，出锅后待料温降到30℃以下即可接种。

将料袋放入消毒后的接种室内，将菌种撒在料袋培养基上，每个料袋用菌液量为20～22ml。接种室在使用前用4g/m³的35％的甲醛水溶液喷雾消毒，并在接种前用75％的酒精或浓度为30％甲酚皂溶液对接种人员的手、菌种瓶(袋)外壁和接种工具进行擦抹消毒。接种时，解袋、注射菌种、扎口和堆放等工序进行流水作业，严格按照无菌操作要求进行。料袋接种后置于20-24℃培养室中进行暗培养。

1.4具体栽培及管理

将菌袋运送至武定县插甸镇老木坝村，选择地势平坦、无污染源、透光率为40-50％，背阴保水的经济林。栽培前，将地上挖出30cm深，100cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出30cm深，40cm长，15cm宽的畦，将沟槽和畦内及边缘撒上石灰粉，用量为150g/m²，将菌袋上表面用剪刀开出3-4cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土3-5cm栽培。

2结果与分析

2.1碳源对比试验结果

分别用空白、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽浸粉、蔗糖、乳糖作为碳源，接入菌种在摇床培养中以菌球形态出现，实验结果显示，培养基中所测菌种生物量的平均值从大到小依次为可溶性淀粉>麦芽浸粉>蔗糖>葡萄糖>乳糖>空白，且可溶性淀粉远高于其他碳源，如图2。

2.2氮源对比试验结果

分别用空白、蛋白胨、酵母粉、氯化铵、尿素、黄豆粉作为氮源，接入菌种在摇床培养中以菌球形态出现，实验结果显示，所测培养基中的菌种生物量的平均值从大到小依次为黄豆粉>酵母粉>蛋白胨>氯化铵>空白>尿素，其中黄豆粉培养基中菌种生物量平均值相对于其他实验组菌种生物量的平均值更高，如图3。

2.3液体摇床发酵温度对比试验结果

分别设置15℃、18℃、21℃、24℃、27℃、30℃六个梯度的温度，接入菌种在摇床培养中以菌球形态出现，实验结果显示，所测培养基中的菌种生物量的平均值从大到小依次为27℃>18℃>24℃>21℃>15℃>30℃，其中27℃培养基中菌种生物量平均值相对于其他实验组菌种生物量的平均值更高。

2.4液体摇床发酵pH值对比试验结果

分别改变培养基中的pH值，实验结果显示，所测培养基中的菌种生物量的平均值从大到小依次为pH＝7>pH＝6>pH＝9>pH＝8>pH＝10>pH＝4>pH＝5>pH＝3，当pH＝7时，菌种生物量的平均值相对于其他实验组菌种生物量的平均值更高。

2.5液体摇床发酵无机盐对比试验结果

分别改变培养基中无机盐的配比，实验结果显示，所测培养基中菌种生物量的平均值从大到小依次为W3>W2>W4>W1>W0>W5，无机盐筛选实验中菌种生物量的平均值相差较小，多组数据比较，编号为W3的实验组中菌种生物量的平均值相对较高。

白肉灵芝菌株L4495液体摇瓶培养生长图如图7所示；

2.6生产制种结果

母种平均生长周期13天，液体菌种渗透性好，18-20天菌丝可长满栽培袋，同期生产的固体菌种接种栽培袋，需要30-45天菌丝才长满栽培袋。白肉灵芝由于自身抗逆性相较差，污染率也相对较高为5％-10％。

2.7出芝管理及采摘

最佳栽培时间为3月下旬至4月中上旬，5月份栽培的白肉灵芝当年基本不出芝，至第二年出芝则畸形芝数量增多，且产量下降。至5月份第一轮春雨过后，菌袋开孔处开始出现白色瘤状原基，让其在自然条件下生长，8月至9月中旬，白肉灵芝长至成熟，芝盖边缘仅有1-2mm淡黄色圈，芝盖不再增大增厚时进行采收。采收原则是成熟一朵采收一朵，选择晴天采收。采收时，将灵芝从芝柄的基部剪下，留0.5cm～1.0cm柄蒂，灵芝采收后，在阳光下单个排列晒干或低温烘箱40℃烘干，灵芝含水量在13％以下，用塑料袋包装贮存。

由于栽培地与野生菌株采集地为同一地段，海拔以及气候条件适宜，经济果林下种植产出白肉灵芝袋均鲜重130g，生物学效率15％，菌盖均长10.5-15.6cm，宽3-5cm，栽培白肉灵芝L4495色泽鲜艳，菌肉肥厚，商品性状优异。栽培白肉灵芝多糖含量为1.58％，三萜含量为3.26％。

其中，驯化栽培的白肉灵芝L4495子实体图如图8所示；白肉灵芝L4495核桃林下栽培出菇情况如图9所示。

2.8本发明结果

采用本发明的条件：

液体培养基：可溶性淀粉6.03g，黄豆粉0.49g，磷酸二氢钾0.3g，MgSO4·7H2O0.5g，VB2 0.1g，水200mL；pH＝6.93，27℃、150r/min培养12天，获得的菌丝体生物量干重为28.9g/L。液体菌种接种到栽培袋中，发菌完成后运送到武定县插甸镇老木坝村经济林下种植，栽培白肉灵芝L4495出芝整齐，商品性状好。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种白肉灵芝菌株L4495及栽培方法与应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 1(人工序列)

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 3(人工序列)

<400> 3

acccgctgaa cttaagc 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 4(人工序列)

<400> 4

tcctgaggga aacttcg 17

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 5(人工序列)

<400> 5

gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 6(人工序列)

<400> 6

achgtrccra taccaccrat ctt 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 7(人工序列)

<400> 7

tggggyatgg tntgyccygc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 8(人工序列)

<400> 8

cccatrgctt gyttrcccat 20

<210> 9

<211> 510

<212> DNA

<213> 9(人工序列)

<400> 9

taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tcgagttctg actgggttgt 60

agctggcctt ccgaggcacg tgcacgccct gctcatccac tctacacctg tgcacttact 120

gtgggtttca gatctgcgaa gcgtgctcct tgcggggctt cgtgaagcgc gtctgtgcct 180

gcgtttatca caaactctat aaagtattag aatgtgtatt gcgatgtaac gcatctatat 240

acaactttca gcaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 300

taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc 360

cttggtattc cgaggagcat gcctgtttga gtgtcatgaa atcttcaacc tacaagcttt 420

tgcggtttgt aggcttggac ttggaggctt gtcggccctc ttcggtcggc tcctcttaaa 480

tgcattagct tgattccttg cggatcggct 510

<210> 10

<211> 871

<212> DNA

<213> 10(人工序列)

<400> 10

ggttcgatta gtctttcgcc cccatgccca tatttgacga tcgatttgca cgtcagaacc 60

gctgcgagcc tccaccagag tttcctctgg cttcacccta tacaggcata gttcaccttc 120

tttcgggtcc ggccccgtat gctcttactc aaatccatcc gagaacatca ggatcggtcg 180

gagatgcgcc gaagctctct cctacgttca ctttcattac gcgtaggggt ttgacacccg 240

aacactcgca tacgaagacg actccttggt ccgtgtttca agacgggtcg ttgatgacca 300

ttacgccagc atccttgcag agcgcgaacc tcagtccatc ccagggtatt acgcagtggg 360

ctataacact cccgagggag ccacattccc agagccttta tcccccggaa cgaactgatg 420

ctggcctgag caggcagagt gcaccgcgga gaaccacgga tgatcaacct gctcaagtct 480

ggtcatgaac gcttcccttt caacaatttc acgtactttt taaccctctt ttcaaagtgc 540

ttttcatctt tcgatcactc tacttgtgcg ctatcggtct ctggccggta tttagcttta 600

gaagacgtat acctcccatt tagagcagca ttcccaaact actcgactcg tcgaaggagt 660

ttcacagagg ctaggcatcc aaccgtacgg ggctctcacc ctctatggcg tcccgttcca 720

gggaactcgg aaggcacgtc gccagaaaca tcctctacaa attacaactc gggcttgcgc 780

cagatttcaa atttgagctg ttgccgcttc actcgccgtt actagggcaa tccctgttgg 840

tttcttttcc tccgcttatt gatatgctta a 871

<210> 11

<211> 541

<212> DNA

<213> 11(人工序列)

<400> 11

atcatcgccg ctggtaccgg tgagttcgag gctggtatct ccaaggatgg ccagacccgc 60

gagcacgccc ttcttgcctt caccctcggt gtcaggcagc tcatcgtcgc cgtcaacaag 120

atggacacca ccaaggttcg tcgtcgcgtg aatcaacata cgcgcytgct ctgactcgag 180

ttcgcagtgg tccgaagacc gtttcaacga aatcatcaag gagacgtcca ccttcatcaa 240

gaaggtcggt tacaacccga aggcggttgc gttcgtcccc atctctggct ggcacggcga 300

caacatgttg gaggagtcca gcaagtgagt gtgtgcgcta tactgtctga tgactcgtca 360

ccctgaccct tatattttag catgacctgg tacaagggtt ggacgaagga gaccaaggct 420

ggtgttgtca aggggaagac ccttttggac gctattgatg ctattgagcc ccccgtccgt 480

ccctccgaca agcccctccg tctccctctc caggatgtct acaaratcgg tggtatcggc 540

a 541

<210> 12

<211> 774

<212> DNA

<213> 12(人工序列)

<400> 12

gccgagacgc cagaaggaca ggcctgcggt ctagtcaaga acttgtcgct tatgtcttgc 60

atatccgtcg gcaccctctc tgcacccgtc atcgaattct tggaggagtg gggcctggag 120

tctctggagg agaatgctca tgcctcaaca ccttgyacca aggtcttcgt gaatggcgtt 180

tggatgggcg tccatcgaga tcctgtgaag ctcgtcagca cgctcaggaa gctccgtcgc 240

aaagatgaca tcaactgcga agtatccgtc gtccgtgaca ttcgagaacg cgagctccgt 300

ctctacacgg atgctggtcg cgtctgccga ccgctcttca tcgtcgagaa ccagcagctc 360

cttatccaga agaaacacat cgagagcttg gtccgtacca aggaagaccc gacgttgtcc 420

tacaactggg acagcctcct caaggacggt gtcatcgagc tgctagatgc cgaggaagag 480

gagacggtta tgatatgcat gacaccggag gatttggaga attcgaggct ccaggctgcc 540

ggtatcgacc cccatgcgga cgaggagatc gacccctcag ctcgattgaa ggcgccgacc 600

tccgcgcaya cgtggacgca ctgcgagatt cacccgagta tgatcttggg tgtctgtgcc 660

agtatcattc cgttccccga tcacaatcag gtgagctcag gttatgaagg cttcagtcga 720

agtactaacg tgcgtctagt cgcctcgtaa cacgtaccag tctgccatgg gcaa 774

Claims

1.一种白肉灵芝菌株L4495，其特征在于，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62104。

2.权利要求1所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），无菌条件下通过取白肉灵芝菌株L4495组织，接种到PDA培养基的上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养9-11d；

步骤（2），将步骤（1）培养好的菌种接种于液体培养基中，置于摇床中26-28℃、140-160r/min培养11-13天；

其中，液体培养基为：可溶性淀粉5.9-6.1g，黄豆粉0.48-0.51g，磷酸二氢钾0.29-0.31g，MgSO₄·7H₂O 0.48-0.52g，VB₂ 0.09-0.11g，水200mL；pH=6.9-7.1；

步骤（3），将步骤（2）培养好的液体菌种接种至栽培袋中，置于23-25℃培养室中暗培养至菌丝长满栽培袋；

栽培袋中栽培基质包括按照质量分数计的如下组分：阔叶树木屑66-68份、麸皮19-21份、甘蔗渣10-12份、石膏0.98-1.02份、石灰1.98-2.02份；含水量60-65%

步骤（4），将步骤（3）培养好的栽培袋运至经济林下覆土栽培，待子实体长至成熟，菌盖边缘仅有1-2mm淡黄边时采收子实体。

3.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（1）中，取1-1.5cm白肉灵芝菌株L4495组织接种到PDA培养基中。

4.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，取蚕豆粒大小的1至2块接种于液体培养基中；

液体培养基为：可溶性淀粉6.03g，黄豆粉0.49g，磷酸二氢钾0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，VB₂ 0.1g，水200mL；pH=6.93。

5.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，摇床培养温度为27℃，摇床培养转速为150r/min。

6.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）培养好的液体菌种以每袋20ml的量接种至栽培袋中，置于23-25℃培养室中暗培养25-35天至菌丝长满栽培袋。

7.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（4）中，在经济林下覆土栽培的具体方法为：选取背阴保水、林木茂盛的经济林地块，地上挖出29-31cm深，95-105cm宽的沟槽，林木稀疏且不能挖沟的地方挖出29-31cm深、39-41cm长、14-16cm宽的畦，将步骤（3）培养好的栽培袋上表面开3-4cm小孔竖立放到沟槽或畦中，覆土3-5cm栽培。

8.根据权利要求2所述的白肉灵芝属菌株L4495的栽培方法，其特征在于，步骤（4）中，栽培后120至150天，子实体长至成熟。

9.权利要求1所述灵芝属菌株L4495的菌丝体或者发酵液在制备抗肿瘤的药物中的应用。