CN111793705A

CN111793705A - 白肉灵芝z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法

Info

Publication number: CN111793705A
Application number: CN202010530800.XA
Authority: CN
Inventors: 黄龙花; 梁晓薇; 莫伟鹏; 吴晓贤; 卓丽君; 刘远超; 胡惠萍
Original assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111793705B; CN113122458A

Abstract

本发明公开了一种白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。本发明针对不同的白肉灵芝菌株进行ISSR分子标记的扩增，最终找到野生白肉灵芝Z160097的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到野生白肉灵芝Z160097专有的特征性核苷酸序列，建立野生白肉灵芝Z160097的快速准确鉴定方法。野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其的快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。

Description

白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。

背景技术：

灵芝是著名的药用真菌之一，千百年来一直被民间视为仙草，被历代医药家视为延年益寿、滋补强健、扶正固本的神奇珍品，经过大量临床研究，灵芝具有调节免疫、防治心血管系统疾病、抗肿瘤、保肝解毒、抗神经衰弱、降血糖等功效。灵芝属(Ganoderma)是由芬兰植物学家P.Karsten于1881年建立的，并以灵芝G.1ucidum(W.Cur.Fr.)Karst.作为本属的代表种。白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)是新发现的灵芝属中国特有种(Li etal.,2014)，是本专利发明人之一的胡惠萍等人于2011年在调查西藏林芝地区的野生食药用菌资源时，采集到的生长在青冈树(Cyclobalanopsis glauca)上的野生灵芝。通常夏秋季散生至群生于青冈树腐木上，靠近树干基部，分布于西藏与四川等西南地区，可药用，目前药材市场上与灵芝(俗称赤芝)(G.lingzhi)混淆使用。白肉灵芝在形态特征上与灵芝、亮盖灵芝/漆光灵芝(G.lucidum)和四川灵芝(G.sichuanense)等均较相似，因此在没有被定为灵芝属新种之前，在四川和西藏等地，采集、收购和售卖灵芝的采集者和商贩称之为“白肉灵芝”、“白灵芝”、“藏白芝”或“藏白灵芝”，在当地被视为高品质的种类，售价往往比一般的灵芝高数倍。白肉灵芝的多糖含量比普通灵芝高2-4倍，灵芝三萜含量达到普通品种120％以上，动物实验及细胞实验都表明其具有强烈的抑制肿瘤的作用。这一特点让白肉灵芝的批发价每斤一般可达400元，大约是内地普通灵芝价格的6-8倍。

野生白肉灵芝Z160097栽培性状稳定良好，活性成分含量高，并且拥有自主产权，具有极好的开发利用价值。因此，快速且准确地鉴别野生白肉灵芝Z160097的方法和技术是优质野生白肉灵芝菌株商业化生产的重要技术保障，对其的开发利用具有重要的意义。

DNA是生物遗传信息的载体，每个生物物种乃至个体均具有独特的特征性核苷酸序列，且具有一定的稳定性，不会受到环境或培养等条件的影响而改变，是该生物物种或个体区别于其它生物物种或个体的重要标志，因而是用来鉴定物种或个体的可靠依据。随着分子生物学技术的快速发展，真菌的快速准确检测鉴定已成为可能。目前常用的分子标记鉴定方法主要有RAPD、AFLP、RFLP、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。本发明旨在应用各种分子标记找到目标菌株的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到目标菌株专有的特征性核苷酸，建立目标菌株的快速准确鉴定技术方法。目前，已有部分用于鉴定真菌菌株的核苷酸特征序列获得专利，但由于野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法。

本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特异引物，所述的特异引物如下所示：

Z97-F：5'-GGTCAACGTAGGCTACGCAG-3'(如SEQ ID NO.3所示)；

Z97-R：5'-GACACGCACACGAGAAAAAG-3'(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明的第三个目的是提供一种白肉灵芝Z160097的快速鉴定试剂盒，包括上述的特异引物。

本发明的第四个目的是提供一种白肉灵芝Z160097的鉴别方法，包括以下步骤：提取待测白肉灵芝的基因组DNA作为模板，以上述的特异引物Z97-F和Z97-R进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，若扩增出条带，则说明待测白肉灵芝是白肉灵芝Z160097，若没有扩增出条带，则说明待测白肉灵芝不是白肉灵芝Z160097。

优选，所述的PCR扩增的反应体系为20μL：包括DNA模板2μL、10μmol/L引物Z97-F 2μL、10μmol/L引物Z97-R 2μL、2×PCR Taqmix 10μL和ddH₂O 4μL。

优选，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃45s、53℃45s、72℃30s，30个循环；72℃5min。

本发明针对不同的白肉灵芝菌株进行ISSR分子标记的扩增，最终找到野生白肉灵芝Z160097的特异条带，并进行克隆测序，再设计特异引物，从而找到野生白肉灵芝Z160097专有的特征性核苷酸序列，建立野生白肉灵芝Z160097的快速准确鉴定方法。野生白肉灵芝Z160097是分布范围极小的新物种，其的快速准确鉴定将为其产业化开发和产权保护奠定基础。

本发明的白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)Z160097于2020年4月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：60965。

附图说明：

图1是白肉灵芝成熟子实体。

图2是葡萄糖的标准曲线。

图3是白肉灵芝的ISSR(857)分子标记图；其中，1-24分别为表3中序号1-24的白肉灵芝菌株。

图4是野生白肉灵芝Z160097的特异引物设计位点。

图5是野生白肉灵芝Z160097的特异引物对特异性验证；其中，1-24分别为表3中序号1-24的白肉灵芝菌株。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明的具体实施方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

实验样品

野生白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)Z160097和3个性状优良的市场流通菌株。具体见下表1：

表1栽培菌株

菌株编号	来源	备注
			Z160097	西藏林芝噶郎湖	野生菌株
I150021	西藏林芝科技局	市场流通菌株
			I160015	米林红太阳科技示范农场	市场流通菌株
I160016	米林红太阳科技示范农场	市场流通菌株

实验步骤

1.白肉灵芝人工栽培

栽培料配方：棉籽壳31％、木屑58％、麸皮10％和碳酸钙1％，水分62％，pH自然；养菌房内25℃恒温遮光培养，约30-40天后菌丝长满菌袋，进入出芝房，控制温度在15-18℃之间，空气相对湿度85-90％之间，光照约为100-200lux，二氧化碳含量刚出芝时控制在2000ppm以上，待出原基后，温度和空气相对湿度不变，调整光照约200-300lux，继续保持二氧化碳含量在2000ppm以上。在菌柄伸长期结束，进入开菌期时，温度继续保持15-18℃之间，调整空气相对湿度90-95％之间，光照约300-500lux，保持二氧化碳含量小于1200ppm。

2.子实体采收及样品处理

待白肉灵芝菌盖边缘由浅黄色变成红褐色，开始喷粉约一周后，即可采收(如图1)。将子实体60℃烘干后，进行粉碎，混匀备用。

3.多糖含量测定

(1)硫酸蒽酮溶液的制备：精密称取蒽酮0.1g，加入硫酸100mL使溶解，摇匀备用。

(2)供试品溶液制备：白肉灵芝子实体样品粉碎，精密称取2.00g样品加入60mL纯水，加热回流4h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将了滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60mL，加热回流3h，趁热过滤，合并滤液，旋蒸蒸干水分，残渣用5mL水溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75mL，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3mL，定容至25mL，得到供试品溶液。

(3)对照品溶液的制备：精密称取无水葡萄糖20mg，定容至100mL，浓度为0.2mg/mL。

(4)标准曲线的制备：精密称量对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分别置于10mL具塞试管中，各加水至2.0mL，迅速精密加入步骤(1)制备的硫酸蒽酮溶液6mL，立即摇匀，静置15分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(5)测定：精密量取供试品溶液1mL，加入1mL纯水，置10mL具塞试管中，迅速精密加入步骤(1)制备的硫酸蒽酮溶液6mL，立即摇匀，静置15分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，根据标准曲线计算白肉灵芝各样品的多糖含量。

结果分析

通过绘制标准曲线(如图2)，得到葡萄糖浓度与光密度值之间的关系，得到回归方程为y＝10.716x+0.0074(R²＝0.9992)，由于R值大于0.995，证明所得到的回归方程线性良好。基于该回归方程，计算得白肉灵芝各样品的多糖得率如表2：

表2白肉灵芝栽培菌株的多糖得率

由上表2可以看出，野生白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)Z160097(该菌于2020年4月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：60965)的多糖含量远高于其他市场流通菌株，是个有开发利用前景的优质野生种。

实施例2

实验样品

白肉灵芝市场栽培菌株及野生菌株。具体见下表3：

表3白肉灵芝实验菌株

实验步骤

1.白肉灵芝基因组DNA模板的提取：

白肉灵芝接种于PDA平板上，25℃暗培养7-10天，收集菌丝体，研磨成粉后按照Magen(美基生物)的HiPure Fungal DNA Kit Ⅱ真菌DNA提取试剂盒的说明书，进行总DNA提取，获得白肉灵芝的基因组总DNA。

2.野生白肉灵芝Z160097的特异条带探索：

以野生白肉灵芝Z160097以及23个白肉灵芝菌株(包括19个市场流通白肉灵芝菌株和4个野生白肉灵芝菌株)(见表3)的基因组总DNA为模板，ISSR引物(加拿大哥伦比亚大学公布的ISSR引物)为扩增引物。

反应体系为20μL总体积：DNA模板2μL，引物(10μmol/L)2μL，2×PCR Taqmix 10μL，ddH₂O 6μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃45sec，40℃-60℃(不同ISSR引物退火温度不同，先梯度摸索获得各引物最佳退火温度)45sec，72℃1min，30cycle；72℃8min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，分析不同菌株在同一引物下的多样性条带，最终找到野生白肉灵芝Z160097的特异条带，即：以857：5'-ACA CAC ACA CAC ACA CYG-3'(如SEQ ID NO.1所示)为引物，在46℃的退火温度下进行的PCR，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，发现所有白肉灵芝实验菌株仅野生白肉灵芝Z160097在约1500bp处有亮条带，其余菌株均未发现该条带。结果如图3。

3.野生白肉灵芝Z160097的特异条带回收克隆测序及特异性引物对的设计

将获得的野生白肉灵芝Z160097的特异条带进行切胶回收，T载体克隆，测序，得到长1479bp的特异序列(如SEQ ID NO.2所示)。

然后基于该特异序列设计特异引物对。Z97-F：5'-GGT CAA CGT AGG CTA CGC AG-3'(如SEQ ID NO.3所示)和Z97-R：5'-GAC ACG CAC ACG AGA AAA AG-3'(如SEQ ID NO.4所示)。如图4。

4.特异引物对的验证

1)以野生白肉灵芝Z160097的基因组DNA作为模版，以Z97-F和Z97-R作为引物，反应体系为50μL总体积：DNA模板5μL，上下游引物(10μmol/L)各4μL，2×PCR Taqmix 25μL，ddH₂O 12μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，53℃45s，72℃30s，30cycle；72℃5min。将PCR产物进行条带回收，送华大基因测序。结果发现序列即为所设计引物的中间区段序列，长599bp(如SEQ ID NO.5所示)。

2)以野生白肉灵芝Z160097以及23个白肉灵芝菌株(包括19个市场流通白肉灵芝菌株和4个野生白肉灵芝菌株)(见表3)的基因组DNA作为模版，以Z97-F和Z97-R作为引物，反应体系为20μL总体积：DNA模板2μL，上下游引物(10μmol/L)各2μL，2×PCR Taqmix 10μL，ddH₂O 4μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，53℃45s，72℃30s，30cycle；72℃5min，将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳成像查看结果(见图5)。

5.结果分析

由图5可以看出，野生白肉灵芝Z160097能够扩增出大小599bp的特异性片段，而其他白肉灵芝样品均没有扩增到该片段，这表明本发明的野生白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物具有极高的特异性，因此可以用于野生白肉灵芝Z160097的快速鉴定。

序列表

<110> 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列及其特异引物、试剂盒和鉴别方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acacacacac acacacyg 18

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 白肉灵芝Z160097(Ganoderma leucocontextum Z160097)

<400> 2

tcgattacac acacacacac actgatgccg gtcttccatt gccagccaag agcggatcta 60

ctgacttctg ggagcgccac tgcaacaccg tcaacctgat accaggcaag ctgagcaagg 120

gcaagggcaa ggtcacccaa caggccctct ctgtaagcat gttcaaatgt cgcggcctgc 180

ccaaagctga tttattttgt agactcagaa gccgcatact tgccatcgct gtctgtccac 240

catgtgggcg ggcggcgagg gaggacgtga taaccataag aagggatatt gttctgatgg 300

cgtcaagcag aggccggtcg cagttgacgg tgtcatggag gagcttctgc cctggccaca 360

gcccaatgcg atctttacga agggcgacac cttctggcct aagtgtttca ccgcagctgt 420

ccacgagttg tacaacaccg tcatcgtcgg tcacggtctc ggcggcacca aagcaatgga 480

gtatatggcc ttcgcagata tgcttcgcgc gcacctagtt gtccttcctc ccaccgagac 540

ggagccctct attgttcgtt tcaagctcta ccgcgggctt gcgcttggcg agcagcctga 600

acagctgtct gatctggtga cgatcgacgg cgtcaactac ttgcatctca gctacttgtc 660

ggaagagggt ttccacgagg tagcagccct cgccactggg tcaacgtagg ctacgcagtt 720

gtcaaggctg catgccatgc ctggttgcag gatctccaac gtgttcgttg tcactctgga 780

cctggagcgc agcctggaag tactcgactg cctgtgggag aacaagcgtg gtcagcgcac 840

acatcgggcg cagacagcgc gctgtcgcgt tctttccgta tcctttccca caccatcata 900

tctcctgttt ctcacccgtt ttcccgccct cgtgtctctc cgtcacctcg tggtcctccc 960

attccgccat catatcttca tcctatcttc atcctgccgt cgtctctgcc gtctcccggg 1020

gcacgctccg ctgccatcat ctcctccgtc atctcttcca tcgtctcctg gggtacagcg 1080

cgagcatgcg cggcctgctc aagctgccgg atcttcaacg tgcgggagtg cgcacgatcg 1140

cgctgctgac cgccgatgct cactgttgcc ctacgtgcgc ggggttgctt tcgctcccaa 1200

ggtatcagag acgagagtgc atgtgggatg tgggagtcgt gcggtcgtca tcctttcttg 1260

tcgttcttat ctgcaggctt tttctcgtgt gcgtgtctgc tcgtcttgct gtacttacta 1320

atattgtcca cctttcgaga cccgcagtct gtcgtactgt acaagtataa tttgttccgg 1380

ttccatatct gtgtatgtgt ggcccgcctc cctctgtata atctaatctc tcggaatgta 1440

tatcatcatg cctggtgttt cggtgtgtgt gtgtgcgta 1479

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcaacgta ggctacgcag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gacacgcaca cgagaaaaag 20

<210> 5

<211> 599

<212> DNA

<213> 白肉灵芝Z160097(Ganoderma leucocontextum Z160097)

<400> 5

ggtcaacgta ggctacgcag ttgtcaaggc tgcatgccat gcctggttgc aggatctcca 60

acgtgttcgt tgtcactctg gacctggagc gcagcctgga agtactcgac tgcctgtggg 120

agaacaagcg tggtcagcgc acacatcggg cgcagacagc gcgctgtcgc gttctttccg 180

tatcctttcc cacaccatca tatctcctgt ttctcacccg ttttcccgcc ctcgtgtctc 240

tccgtcacct cgtggtcctc ccattccgcc atcatatctt catcctatct tcatcctgcc 300

gtcgtctctg ccgtctcccg gggcacgctc cgctgccatc atctcctccg tcatctcttc 360

catcgtctcc tggggtacag cgcgagcatg cgcggcctgc tcaagctgcc ggatcttcaa 420

cgtgcgggag tgcgcacgat cgcgctgctg accgccgatg ctcactgttg ccctacgtgc 480

gcggggttgc tttcgctccc aaggtatcag agacgagagt gcatgtggga tgtgggagtc 540

gtgcggtcgt catcctttct tgtcgttctt atctgcaggc tttttctcgt gtgcgtgtc 599

Claims

1.一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特征性核苷酸序列，其特征在于，所述的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种用于鉴别白肉灵芝Z160097的特异引物，其特征在于，所述的特异引物如下所示：

Z97-F：5'-GGTCAACGTAGGCTACGCAG-3'；

Z97-R：5'-GACACGCACACGAGAAAAAG-3'。

3.一种白肉灵芝Z160097的快速鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的特异引物。

4.一种白肉灵芝Z160097的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测白肉灵芝的基因组DNA作为模板，以权利要求2所述的特异引物Z97-F和Z97-R进行PCR扩增，将PCR产物进行电泳检测，若扩增出条带，则说明待测白肉灵芝是白肉灵芝Z160097，若没有扩增出条带，则说明待测白肉灵芝不是白肉灵芝Z160097。

5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为20μL：包括DNA模板2μL、10μmol/L引物Z97-F 2μL、10μmol/L引物Z97-R 2μL、2×PCR Taqmix 10μL和ddH₂O 4μL。

6.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃45s、53℃45s、72℃30s，30个循环；72℃5min。