CN110894470B - 一种适合工厂化栽培的香菇菌种农香5号及其分子鉴定方法 - Google Patents

一种适合工厂化栽培的香菇菌种农香5号及其分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种香菇‘农香5号’及其分子标记鉴定方法，属于香菇领域。本发明以香菇‘808’和香菇‘L26’为亲本进行杂交选育出菌种稳定性好、出菇温度高、出菇时间短、子实体朵形好、潮次之间短，产量高，具有很好地开发应用前景的‘农香5号’香菇菌种。该菌种已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20191018。同时提供了该菌种专一性强、操作简便的分子标记鉴定方法。

Description

一种适合工厂化栽培的香菇菌种农香5号及其分子鉴定方法
技术领域
本发明属于香菇领域，具体涉及一种香菇‘农香5号’及其分子标记鉴定方法。
背景技术
香菇Lentinus edodes又名花菇、冬菇、香信、香蕈等，其营养价值很高，味道鲜美，是被人们广泛所知的一种食用菌，同时也是我国产量最大的食用菌。随着近年香菇产业的不断升级以及环境气候的变化，香菇传统的栽培模式暴露出不稳定、“靠天吃饭”、产量与品质难于保证的问题越来越严重，已较难适应香菇产业日益激烈竞争的要求，以机械化生产、智能化调控、周年化栽培为特征的工厂化生产是香菇产业升级发展方向。
香菇工厂化栽培成功的秘诀有4 点：一是降低病菌的损耗率，二是实现短期高产，三是防止连作障碍，四是采用性能稳定的菌种（木村荣一. 日本的香菇工厂化栽培.食药用菌，2015，23（3）：157~161），其中，菌种是关键、是基础。因此，本发明根据香菇工厂化栽培菌种的要求，杂交选育菌龄短、产量高、朵形好、抗逆性好、且稳定的香菇菌种以实现香菇的工厂化栽培。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香菇‘农香5号’及其分子标记鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种香菇（Lentinus edodes）‘农香5号’，该菌株的分类命名为：香菇（Lentinula edodes）农香5号，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO: M 20191018。
本发明的香菇（Lentinus edodes）‘农香5号’，简称‘农香5号’是以香菇‘808’和香菇‘L26’为亲本进行杂交选育而成，其继承了两个亲本的优良性状。‘农香5号’菌种稳定性好，属中高温型，菌龄在75 d出菇，子实体朵形好、潮次之间短，产量高，两潮平均每袋产量在310～350g，具有很好地开发应用前景。
香菇‘农香5号’（CCTCC NO: M 20191018）的母种培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000mL；培养条件为常规的香菇培养，无特殊要求。
本发明还提供了所述香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、特异片段PCR扩增和PCR产物的电泳检测。
所述特异片段PCR扩增是由6对引物分别对‘农香5号’的DNA进行PCR扩增，经电泳检测分别得到单一的标记片段，6对引物序列和用这6对引物分别扩增‘农香5号’的DNA得到的标记片段大小见表1；
表1 特异标记扩增信息
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述PCR产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有一个片段出现，且片段大小与对应的引物相符（各引物对应的片段大小见表1），是香菇（Lentinus edodes）‘农香5号’的标记。其中电泳条件为：取PCR产物5μL，与1μL上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％溴酚蓝, 40% 蔗糖。
PCR扩增反应体系：1～1.5 μl 含量80~150 ng的DNA，12.5μl Premix Taq（带染料），1 μl 浓度为10 μmol/L的正向引物, 1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物,9～9.5 μlddH2O，总体积25 μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，Tm退火30 sec，72℃延伸X,35个循环;72℃延伸10 min。其中各引物的Tm和72℃延伸X见表2。
表2 特异标记产生PCR扩增反应程序信息
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明具有以下优点：
1、香菇‘农香5号’含香菇‘808’和香菇‘L26’两个亲本的基因，其‘农香5号’菌种稳定性好，属中高温型品种，能在较高温度下出菇，菌龄短，抗杂性好，子实体朵形好，潮次之间短，产量高等优点，具有很好地开发应用前景。
2、香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。
3、专一性强：本发明在对香菇基因测序、生物信息分析的基础上，设计香菇‘农香5号’的特异识别性的标记片段。
4、香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。在一般的分子实验室即能完成检测，无需要特殊的仪器设备。
附图说明
图1为香菇‘农香5号’第二潮出菇时子实体形态。
图2为‘农香5号’特异性识别标记电泳图。其中，1～18为泳道编号，1、4、7、10、13、16泳道代表‘808’，2、5、8、11、14、17泳道为‘农香5号’，3、6、9、12、15、18代表‘L26’；泳道1～3的引物为LeP1，标记片段大小为791 bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道4～6的引物为LeP2，标记片段大小为939 bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道7～9的引物为LeP3，标记片段大小为1409 bp，是香菇‘808’和‘农香5号’共有；泳道10～12的引物为LeP4，标记片段大小为1742 bp，是香菇是‘农香5号’和‘L26’共有；泳道13～15的引物为LeP5，标记片段大小为803 bp，是香菇‘农香5号’和‘L26’共有；泳道16～18的引物为LeP6，标记片段大小为962bp，是香菇‘农香5号’和‘L26’共有；当6对引物都对‘农香5号’基因组检测时都产生对应大小的标志片段，则为香菇‘农香5号’，M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1：香菇‘农香5号’的选育
香菇‘农香5号’的选育，包括以下步骤：
（1）对香菇‘L26’、‘L087’、‘L.0344’、‘L0227’进行出菇实验，收集其孢子，并进行孢子萌发实验，获得4个香菇菌株的单孢菌株，每个菌株选择长势良好的单孢菌株各2个，共8个单孢菌株。
（2）选择香菇菌株‘农香2号’、‘808’、‘闽丰1号’、‘Cr33’、‘申香10号’、‘L18’、‘L236’、‘武香1号’、‘L0249’、‘L.0359’10个，分别与8个单菌株进行双-单配对，配对组合数为80，获得63个杂交子。
（3）对63个杂交子在PDA培养基上连续转接3次后，观察其菌丝生长速度，淘汰生长速度较慢的杂交子23个，余下40个杂交子制作菌种作出菇实验。
（4）40个杂交子的出菇性状采用直观法筛选，根据出菇快慢、整齐度、子实体朵形初步筛选出5个杂交子进行下一轮筛选。
（5）经第二轮出菇实验，发现杂交编号为‘LH17’的杂交子具有出菇快、整齐度好、朵形好的优点，其亲本为香菇‘808’和‘L26’。此后，香菇杂交子‘LH17’经多次出菇，性状稳定，周期短，能在较高温度下出菇，出菇时整齐度好、抗逆性较好、产量较高，子实体朵形好，继承了其两个亲本较优的性状。将香菇杂交子‘LH17’命名为‘农香5号’。
香菇‘农香5号’已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 20191018。
所述香菇‘农香2号’由第一发明人刘新锐选育，‘L26’、‘L087’、‘808’、‘闽丰1号’、‘Cr33’、‘申香10号’、‘L18’、‘L236’、‘武香1号’菌株购买于市场，（参考文献有：[1]沈学香，尚晓冬，汪虹，等．十株香菇菌株间的营养体不亲合性[J]．食用菌学报，2009，16（2）：1-5．[2]谢福泉，谢宝贵，羿红，等．福建省袋栽香菇主要菌株交配型测定及品种鉴别[J]．福建农林大学学报（自然科学版），2004，33（4）：521-526）
‘L.0344’、‘L0227’‘L0249’、‘L.0359’这四个菌株由第一发明人刘新锐野外采集。
‘L.0344’、‘L.0359’参考文献为：刘新锐，袁滨，谢宝贵，等．三明野生香菇交配型因子分析[J]．食药用菌，2014，22（6）：326-328．
‘L0227’‘L.0249’参考文献为：刘靖宇，刘新锐，邓优锦，等．双向核迁移在香菇遗传和育种中的应用研究[J]．菌物学报，2011，30（5）：774-781．
实施例2：
香菇‘农香5号’（CCTCC NO: M 20191018）的工厂化栽培，包括以下步骤：
（1）香菇‘农香5号’菌种制作
将‘农香5号’菌株在PDA培养上活化2次，转接于香菇原种常规培养基，25℃恒温培养至长满原种瓶。待原种长好后，按马求凤方法进行液体菌种制作（马求凤. 香菇菌株“18”液体菌种生产试验及优势分析. 福建热作科技，2017，42（2）：21-22），得到‘农香5号’的液体菌种。
（2）香菇‘农香5号’的菌包制作、培养、菌包转色与出菇管理
栽培香菇‘农香5号’的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌均同常规的香菇，选用菌袋为18cm×35cm规格的聚丙烯塑料袋，装料干重约400克，液体接种按按马求凤方法进行接种（马求凤. 香菇菌株“18”液体菌种生产试验及优势分析. 福建热作科技，2017，42（2）：21-22）。
接种后菌包放于有温控系统的菇房进行培养，培养温度控制在24～26 ℃，CO2浓度控制在5000 ppm以下，进行黑暗培养，35～40 d长满菌包。菌丝布满菌包后进行刺孔通氧，菇房温度设置在19～23 ℃，湿度控制在55-70％，100～300勒克斯的白天光照，总菌龄在75～80天时进入出菇管理。
将培养好的‘农香5号’菌包进行振动、拉入11～14 ℃的菇房刺激15 h，刺激后温度设置在17～20 ℃，继续培养1～2 d脱袋，菇房湿度控制在75%～85%，CO2浓度在3000 ppm以下，光照强度500～1 000 勒克斯，只在白天开灯照明，5 d后即长出子实体，达到商品性状时采收。
采收一潮后，清洁菇房，菇房温度设置在23～25 ℃，湿度55%～80%，停止光照，休养10～15 d进行注水，菇房温度设置在17～20 ℃，进入下一潮出菇管理。
香菇‘农香5号’每个菌包第1、2潮合计采收310～350 g的鲜菇，形态特征见图1，子实体单生，菇形圆整，菌盖中间浅褐色，边缘偏白色，表面有绒毛，菌盖直径4.4～6.1 cm，厚度1.6～2.4 cm，菌肉结实、白色，菌柄柱状，粗细均匀，长3.4～4.4 cm，表面有纤毛。香菇‘农香5号’的栽培周期短，出菇温度较高，出菇整齐，产量较高，休养时间短，具有很好地开发应用前景。
香菇工厂化栽培最早在日本，其食用菌品种与技术的研发都位居世界领先地位，日本国内香菇工厂化栽培主要的品种为北研607，705、森SR1、千曲CS-2等，在我国香菇工厂化栽培中，使用较多的是日本森SR1、千曲CS-2品种。
与日本品种相比，‘农香5号’具有以下优点：‘农香5号’菌龄为75～80 d，而日本品种为90～100 d；‘农香5号’最适合出菇温度控制17-20 ℃，日本品种为12-18 ℃；转下一潮时间上（即休养时间），‘农香5号’最短10 d，日本品种在20 d；因此，‘农香5号’在耗能上比日本品种更少。
实施例3：香菇‘农香5号’（CCTCC NO: M 20191018 ）的分子标记鉴定方法
香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：
（1）菌丝培养和收集
1、将香菇‘农香5号’、‘808’和‘L26’转接至含100ml PDA液体培养基的250 ml广口三角瓶中，其中香菇‘808’和‘L26’购买于市场；
2、放置在25℃摇床上，转速90～130 r/min培养5～8 d；
3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗菌丝，滤纸吸干水分；
4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。
（2）CTAB法提取基因组DNA
提取香菇‘农香5号’、‘808’和‘L26’等菌株基因组DNA提取的具体操作步骤，按照陶永新等的方法（Tao Y, Xie B, Yang Z, et al. Identification and expressionanalysis of a new glycoside hydrolase family 55 exo-β-1, 3-glucanase-encodinggene in Volvariella volvacea suggests a role in fruiting body development[J].Gene, 2013, 527(1):154-160.）进行，提取的DNA放-20℃保存备用。
（3）香菇‘农香5号’特异标记引物设计
将香菇‘农香5号’、‘808’、‘L26’等菌株的基因组DNA送往北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组的二代测序，测序数据量为3～4G的clean data，对这些基因组数据进行生物信息分析，寻找杂交子‘农香5号’与亲本‘808’、‘L26’特有的基因，并进行引物设计，引物信息如下：
1、引物LeP1的正向引物序列为5’-GCGGACCTTGTCCGGTATAG-3’，反向引物序列为5’- TCCAGCGAATGGCTTCAAAC-3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出791 bp的标记片段，而‘L26’无该标记片段。
2、引物LeP2的正向引物序列为5’- GGGCCATGCCAACGAGTATC -3’，反向引物序列为5’- GCAGGCGATGCGAATTGAAG -3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出939 bp的标记片段，而‘L26’无该标记片段。
3、引物LeP3的正向引物序列为5’- TCGGTCTCGCCATCAAGTTC -3’，反向引物序列为5’- CTATCGCAAGTTCGGATTCG -3’，此引物对‘农香5号’与‘808’的基因组能够扩增出约1409bp的标记片段，而‘L26’无该标记片段。
4、引物LeP43的正向引物序列为5’- GGCAGAGGTTGCATCTAAAG -3’，反向引物序列为5’- ACAGATGGCTACTACGAACC -3’，此引物对‘农香5号’与‘L26’的基因组能够扩增出1742bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。
5、引物LeP53的正向引物序列为5’- GCGACGTCATAGGTCCTTTG -3’，反向引物序列为5’- CAGTAAGGATCTGGGCTATG -3’，此引物对‘农香5号’与‘L26’的基因组能够扩增出803bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。
6、引物LeP63的正向引物序列为5’- AGCGCGGACATGTTAATCAG -3’，反向引物序列为5’- CGACGTCCTATCTGCTAATC -3’，此引物对‘农香5号’与‘L26’的基因组能够扩增出962bp的标记片段，而‘808’无该标记片段。
（4）特异片段PCR扩增
PCR扩增反应体系：1.2 μl 含量100 ng的DNA，12.5μl Premix Taq（带染料），1 μl浓度为10 μmol/L的正向引物, 1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物，9.3 μl ddH2O；
引物LeP1-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，57℃退火30sec，72℃延伸50 sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
引物LeP2-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min, 35个循环;72℃延伸10 min。
引物LeP3-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min30sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
引物LeP4-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min50sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
引物LeP5-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸55sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
引物LeP6-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min, 35个循环;72℃延伸10 min。
（5）PCR产物的电泳检测
取PCR产物5 μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5×TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳30—40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示，引物LeP1、1～3泳道显示的分子量为791 bp，引物LeP2、4～6泳道显示的分子量为939 bp，引物LeP3、7～9泳道显示的分子量为1409 bp，引物LeP4、10～12泳道显示的分子量为1742 bp，引物LeP5、13～15泳道显示的分子量为803 bp，引物LeP6、16～18泳道显示的分子量为962 bp的DNA标记条带，是香菇‘农香5号’的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。其中泳道2、5、8、11、14、17代表‘农香5号’，泳道1、4、7、10、13、16代表‘808’，泳道3、6、9、12、15、18代表‘L26’。
（6）试剂与仪器
CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/LNaCl，pH 8.0;
CTAB 沉淀液：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA，pH 8.0;
CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；
氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；
TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；
0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA;
Premix Taq (Ex Taq Version 2.0)带染料的和PCR扩增试剂，均购自大连宝生物公司。
主要仪器：
SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司
灭菌锅：上海三申
HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验室
冷冻离心机：Sigma 3K30
PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg
掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机
SDC-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司
凝胶成像系统：TANON-2008
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种适合工厂化栽培的香菇菌种‘农香5号’及其分子鉴定方法
<130> 12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP1正向引物
<400> 1
gcggaccttg tccggtatag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP1反向引物
<400> 2
tccagcgaat ggcttcaaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP2正向引物
<400> 3
gggccatgcc aacgagtatc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP2反向引物
<400> 4
gcaggcgatg cgaattgaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP3正向引物
<400> 5
tcggtctcgc catcaagttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP3反向引物
<400> 6
ctatcgcaag ttcggattcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP4正向引物
<400> 7
ggcagaggtt gcatctaaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP4反向引物
<400> 8
acagatggct actacgaacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP5正向引物
<400> 9
gcgacgtcat aggtcctttg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP5反向引物
<400> 10
cagtaaggat ctgggctatg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP6正向引物
<400> 11
agcgcggaca tgttaatcag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> LeP6反向引物
<400> 12
cgacgtccta tctgctaatc 20

Claims (3)

1.一种香菇（Lentinula edodes）菌株‘农香5号’，其特征在于：该菌株的分类命名为：香菇（Lentinula edodes）农香5号，已于2019年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20191018。
2.一种如权利要求1所述的香菇‘农香5号’的分子标记鉴定方法，其特征在于：包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、特异片段PCR扩增、电泳检测，显示特异条带；
特异片段PCR扩增引物LeP1～LeP6的具体核苷酸序列为：
引物LeP1的正向序列为5’-GCGGACCTTGTCCGGTATAG-3’，反向序列为5’-TCCAGCGAATGGCTTCAAAC-3’；
引物LeP2的正向序列为5’- GGGCCATGCCAACGAGTATC -3’，反向序列为5’-GCAGGCGATGCGAATTGAAG -3’；
引物LeP3的正向序列为5’- TCGGTCTCGCCATCAAGTTC -3’，反向序列为5’-CTATCGCAAGTTCGGATTCG -3’；
引物LeP4的正向序列为5’- GGCAGAGGTTGCATCTAAAG -3’，反向序列为5’-ACAGATGGCTACTACGAACC -3’；
引物LeP5的正向序列为5’- GCGACGTCATAGGTCCTTTG -3’，反向序列为5’-CAGTAAGGATCTGGGCTATG -3’；
引物LeP6的正向序列为5’- AGCGCGGACATGTTAATCAG -3’，反向序列为5’-CGACGTCCTATCTGCTAATC -3’；
引物LeP1产生一条791 bp的条带，引物LeP2产生一条939 bp的条带，引物LeP3产生一条1409 bp的条带，引物LeP4产生一条1742 bp的条带，引物LeP5产生一条803 bp的条带，引物LeP6产生一条962bp的条带；6个引物同时检测得到对应大小的DNA标记条带，是香菇（Lentinus edodes）‘农香5号’的标记。
3.根据权利要求2所述的香菇（Lentinus edodes）‘农香5号’的分子标记鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：1～1.5 μl含量80~150 ng的DNA，12.5μl Premix Taq，1 μl 浓度为10 μmol/L的正向引物，1 μl 浓度为10 μmol/L的反向引物，9～9.5 μlddH2O，总体积25 μl；
PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，Tm退火30 sec，72 ℃延伸时间X, 35个循环；72 ℃延伸10 min；
其中引物LeP1的Tm为57 ℃，72℃延伸时间X为50 sec；引物LeP2的Tm为58 ℃，72℃延伸时间X为1 min；引物LeP3的Tm为56 ℃，72℃延伸时间X为1 min 30 sec；引物LeP4的Tm为55 ℃，72℃延伸时间X为1 min 50 sec；引物LeP5的Tm为56 ℃，72℃延伸时间X为55 sec；引物LeP6的Tm为55 ℃，72℃延伸时间X为1 min。
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