CN110862930B

CN110862930B - 一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法

Info

Publication number: CN110862930B
Application number: CN201911260177.4A
Authority: CN
Inventors: 刘新锐; 谢宝贵; 邓优锦
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: FUJIAN JIANNING RIXIN EDIBLE MUSHROOM INDUSTRY TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN110862930A

Abstract

本发明提供了一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法，属于茶树菇领域。本发明以白色茶树菇Ag.c0002和野生型茶树菇‘茶5’为亲本进行杂交选育出抗逆性强、产量高、子实体白色，朵形好，具有很好地开发应用前景的白色茶树菇（Agrocybe cylindracea）BC5。该菌种已于2019年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 20191017。同时提供了对该菌株专一性强、操作简便的分子标记鉴定方法。

Description

一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法

技术领域

本发明属于茶树菇领域，更涉及一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法。

背景技术

茶树菇Agrocybe cylindracea，中文名称为柱头田头菇，是我们熟悉的一种珍稀食用菌，其营养价值很高，味道鲜美，深受人们喜爱，同时还是民间传统药用菌，享有“中华神菇”之称。

子实体颜色是一个重要的商品性状，野生型茶树菇的子实体颜色为浅褐色或褐色（统称为褐色），白色是野生型出现的一个变异性状，属于珍稀的一个品种。目前栽培的茶树菇子实体颜色主要是褐色的品种，白色品种比较少，且种植的白色品种是自然变异的菌株，未经过性状的改良，产量比较低，然而在价格上，当前白色茶树菇的市场价格比褐色的高，干品白色茶树菇一斤比褐色的高约10元，具有较好的经济效益。

本发明开展白色茶树菇的育种，通过出菇筛选，获得一个性状比较好的白色茶树杂交种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种白色茶树菇，其分类命名为白色茶树菇（Agrocybe cylindracea）BC5，该菌株已于2019年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20191017。

上述白色茶树菇菌株（Agrocybe cylindracea）BC5，简称白色茶树菇BC5是以白色茶树菇和褐色茶树菇进行多次杂交选育的白色茶树菇BC5，其继承了白色茶树菇子实体白色的性状，又遗传了褐色茶树菇抗逆性强、产量高等优良性状，打破了现有白色茶树菇基因资源较单一的局面。白色茶树菇BC5子实体白色，朵形好，抗逆较好，栽培周期同常规的茶树菇，产量高，具有很好地开发应用前景。

白色茶树菇BC5（CCTCC NO: M 20191017）的母种培养基为马铃薯葡萄糖培养基，即培养基是PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000mL；培养条件为常规的茶树菇培养，无特殊要求。

本发明还提供了所述白色茶树菇的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS(Internal transcribed spacer转录间隔区)-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。

所述特异酶切片段标记的产生：在4～6 μL ITS-PCR扩增产物中, 加入1 μL AccⅡ酶的酶切Buffer，0.4～0.6 μL AccⅡ酶, 2.4～ 4.6 μL ddH₂O，总体积10 μL，37℃水浴3.5～4 h，取酶切产物用于电泳检测；

所述酶切产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为680～695 bp、520～535 bp和150～165 bp的DNA标记条带，是白色茶树菇（Agrocybe cylindracea）BC5标记。其中电泳条件为：取酶切产物10μL，与1μL上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％溴酚蓝, 40% 蔗糖。

ITS-PCR扩增反应体系：1.2 μl 含量80~150 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2μl 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1 μl 浓度为10 μmol/L的ITS1, ITS1序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的ITS4，ITS4序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’，0.3 μl 酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17 μlddH₂O；

ITS-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性0.8 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min, 35个循环;72℃延伸10 min。

本发明具有以下优点：

1、白色茶树菇BC5含有白色茶树菇与野生型茶树菇的基因，其子实体在颜色上继承了白色茶树菇白色的性状，和野生型茶树菇的抗逆性好、产量高等优良性状，具有很好的开发应用前景。

2、白色茶树菇BC5的分子标记鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。

3、专一性强：本发明充分利用酶的专一性和高效性，且本发明使用的酶对白色茶树菇BC5具有特异性，产生特异识别性的标记片段，非白色茶树菇与野生型茶树的杂种得不到这种效果。

4、白色茶树菇BC5的分子标记鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。在一般的分子实验室即可以完成检测，无需要特殊的仪器设备。

附图说明

图1为白色茶树菇BC5子实体。

图2为AccⅡ酶的酶切电泳图。其中，1～5为泳道编号，2～4泳道显示的分子量为690bp，530 bp和160 bp的DNA标记条带，是白色茶树菇BC5的标志；1泳道显示的分子量为530 bp和160 bp是白色茶树菇Ag.c0002的标志；5泳道显示的分子量为690 bp是野生型茶树菇‘茶5’的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1：白色茶树菇BC5的筛选

以白色茶树菇Ag.c0002和野生型茶树菇‘茶5’为亲本。通过原生质体单核化技术获得白色茶树菇Ag.c0002的两个单核体‘2-1’和‘2-2’ （刘新锐，陈威龙，周一卓，等.柱状田头菇白色变种遗传分析.菌物学报，2019，38(9): 1450-1456）。

（1）第一次杂交与筛选：‘茶5’分别与‘2-1’和‘2-2’配对，获得杂交子‘H3’和‘H4’。

（2）杂交子‘H3’和‘H4’的单胞菌株的筛选：将杂交子‘H3’和‘H4’按茶树菇常规的栽培方法进行出菇试验，分别弹射其担孢子，开展孢子萌发实验，获得‘H3’单孢菌株40个，‘H4’单孢菌株38个。‘H3’单孢菌株分别与‘2-2’配对、H4’单孢菌株分别与‘2-1’配对，配对后进行出菇实验，看配对后的子实体颜色，若子实体白色则是携带白色性状的基因，若是褐色，则携带的是野生型颜色的基因。

（3）第二次杂交与筛选：根据单孢菌株在PDA培养基上的生长速度与菌落特征，挑选‘H3’生长良好的单孢且携带白色性状的菌株10个，分别与挑选‘H4’ 生长良好的单孢且携带白色性状的菌株12个进行单-单杂交，共配对120组，获得120个杂交子，对这120个杂交子先进行在PDA上的生长速度观察，淘汰长势很慢的20个，先随机选择长势快的杂交子30个进入出菇实验。这30个杂交子出菇实验，观察其菌包污染情况、出菇快慢、子实体外观、菌盖开伞快慢、产量，发现杂交子BC5的性状优良。白色茶树菇BC5经多次出菇，子实体白色、菌盖半球形、柄较长较粗，抗逆性较好、产量较高，继承了其两个亲本较优的性状。

已于2019年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址: 中国·武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 20191017。所述茶树菇‘茶5’来自福建建宁县茶树菇栽培场。

实施例2：白色茶树菇BC5（CCTCC NO: M 20191017）的出菇试验，包括以下步骤：

（1）白色茶树菇BC5菌种制作

将白色茶树菇BC5菌株在PDA培养上活化2次，转接于茶树菇原种常规培养基，25℃恒温培养至长满原种瓶。

（2）白色茶树菇BC5栽培管理

栽培白色茶树菇BC5时的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和发菌管理及后熟期管理同常规茶树菇。栽培管理参照黄年来等主编的中国食用菌-茶树菇（黄年来，林志彬，陈国梁，主编．中国食药用菌学．上海：上海科技文献出版社．2010，607～619.）

白色茶树菇BC5形态特征见图1，子实体白色，菌盖半球形、表面较光滑，盖大小2～4 cm，菌柄实心、长8～12 cm。白色茶树菇BC5的栽培周期同常规的茶树菇，出菇较集中，单袋平均产量350～420 g，具有很好地开发应用前景。

白色茶树菇BC5与亲本白色茶树菇Ag.c0002、野生型茶树菇‘茶5’、及现有白色品种“As-F”的农艺性状比较见表1。

表1

表1结果表明，本发明的白色茶树菇BC5相比于亲本野生型茶树菇‘茶5’的茶褐色，菇体颜色呈白色；相比于亲本白色茶树菇Ag.c0002及现有白色品种“As-F”其菌丝涨势增强，抗逆性增强，出菇更快，产量大幅提升。本发明的色茶树菇BC5的农艺性状显著由于其亲本性状及现有茶树菇白色品种的性状，取得了1+1>2的显著效果。

实施例3：白色茶树菇BC5（CCTCC NO: M 20191017）的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：

（1）菌丝培养和收集

1、将白色茶树菇BC5、野生型茶树菇‘茶5’和白色茶树菇Ag.c0002转接含100mlPDA液体培养基的250 ml广口三角瓶中，其中茶树菇‘茶5’来自福建建宁县茶树菇栽培场；

2、放置在25℃摇床上，转速90～130 r/min培养7～10 d；

3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；

4、称取0.5～1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20℃备用。

（2）CTAB法提取基因组DNA

茶树菇基因组DNA提取的具体操作步骤，按照陶永新等的方法（Tao Y, Xie B,Yang Z, et al. Identification and expression analysis of a new glycosidehydrolase family 55 exo-β-1, 3-glucanase-encoding gene in Volvariellavolvacea suggests a role in fruiting body development[J]. Gene, 2013, 527(1):154-160.）进行，提取的DNA放-20℃保存备用。

（3）ITS-PCR扩增

ITS-PCR扩增反应体系：1.2 μl 含量80~150 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2μl 浓度为2.5 mmol/L的dNTP，1 μl浓度为10 μmol/L的ITS1, ITS1序列为5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的ITS4，ITS4序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’，0.3 μl 酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17 μlddH₂O；

（4）特异酶切片段标记的产生

5 μl ITS-PCR扩增产物, 1 μl AccⅡ酶的酶切Buffer, 0.5 μl AccⅡ酶, 3.5 μl ddH₂O，37 ℃水浴4 h。

（5）酶切产物的电泳检测

取AccⅡ酶的酶切产物10 μl，与1 μl上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上（含EB染料），同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5 × TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳45 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示， 2～4泳道显示的分子量为690 bp，530 bp和160 bp的DNA标记条带，是白色茶树菇BC5的标志；1泳道显示的分子量为530 bp和160 bp是白色茶树菇Ag.c0002的标志；5泳道显示的分子量为690 bp是野生型茶树菇‘茶5’的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。图2结果表明：白色茶树菇BC5同时携带白色茶树菇Ag.c0002和野生型茶树菇‘茶5’的DNA标记条带。

（6）试剂与仪器

CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/LNaCl，pH 8.0;

CTAB 沉淀液：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA，pH 8.0;

CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；

氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；

TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；

0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA;

上样缓冲液：0.1％溴酚蓝, 40% 蔗糖；

EB：10 mg/mL溴化乙锭；

AccⅡ酶和PCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。

主要仪器：

SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司

灭菌锅：上海三申

HYG-A全温摇瓶柜：太仓市实验室

冷冻离心机：Sigma 3K30

PCR扩增仪：Eppendorf AG22331 Hamburg

掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机

SDC-6节能型智能恒温槽：宁波新芝生物科技股份有限公司

凝胶成像系统：TANON-2008。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种白色茶树菇及其分子标记鉴定方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS1

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS4

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种白色茶树菇，其特征在于：所述白色茶树菇其分类命名为：白色茶树菇（Agrocybe cylindracea）BC5，已于2019年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 20191017。

2.一种如权利要求1所述的白色茶树菇的分子标记鉴定方法，其特征在于：包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；

所述特异酶切片段标记的产生：在4～6 μL ITS-PCR扩增产物中, 加入1 μL AccⅡ酶的酶切Buffer，0.4～0.6 μL AccⅡ酶, 2.4～4.6 μL ddH₂O，总体积10 μL，37℃水浴3.5～4 h，取酶切产物用于电泳检测；

所述酶切产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为680～695bp、520～535 bp和150～165bp的DNA标记条带，是白色茶树菇（Agrocybe cylindracea）BC5标记。

3.根据权利要求2所述的白色茶树菇的分子标记鉴定方法，其特征在于：所述ITS-PCR扩增的反应体系：1.2 μl 含量80~150 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2 μl 浓度为2.5m mol/L的 dNTP，1 μl 浓度为10 μmol/L的ITS1, ITS1序列为5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的ITS4，ITS4序列为5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’，0.3 μl酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17 μl ddH₂O；

ITS-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸0.8～1 min, 30～35个循环;72℃延伸10 min。