CN103740821B - 贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法 - Google Patents

贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法，属于酵母育种新菌株的鉴定方法。本发明包括：贝酵母杂交；贝酵母菌株耐硫性测定；提取和纯化贝酵母DNA：以<i>FZF1</i>为引物的PCR反应体系及程序；PCR产物测序及鉴定等；此后进一步对耐硫杂交后代ISSR分析。实施例从3个杂交组合获得18个疑似杂交后代。PCR分析是18个疑似杂交后代中有5个菌株只含非耐硫亲本的特征条带，2个含耐硫亲本的特征条带，其余11个则含有双亲的特征带。对8个耐硫杂交后代ISSR分析表明：有两个单菌落的指纹图谱完全一致为同一菌株。本发明以DNA序列及ISSR图谱为依据加上耐硫表型筛选获得6种耐硫贝酵母杂交后代菌株，显著提高了杂交后代菌株鉴定的准确率。

Description

贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法
技术领域
本发明属于酵母菌育种及鉴定方法。
背景技术
酵母选育是高品质果酒酿造的核心技术之一，对果酒的香味、品质等具有决定性的影响。目前我国果酒酿造用的酵母基本都是进口的，果酒质量同质化日趋严重，制约了我国新品质果酒发展和竟争力，也威胁我国野生酵母菌资源。酿酒酵母（Saccharomycesscerevisiae）是各种类型的酒生产中所通常采用的酵母，但以酿酒酵母作为发酵菌种酿造的酒风味平淡，而广义酿酒酵母组(Saccharomycessensulato)已扩展到其它酵母的选育，如贝酵母（Saccharomycesbayanus）、奇异酵母（Saccharomycesparadoxus）等酵母。
另一方面，硫是酵母代谢过程中的一个常见产物，具有抗菌和抗氧化两重功能，作为果酒生产的原材料的果汁以硫作防腐剂，其原因是：硫通过钝化磷酸-3-甘油醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的作用，导致细菌和真菌的ATP损耗，抑制其生长发育最终使其死亡而达到抗菌防腐的作用。但硫对于酵母本身也是一种潜在的毒素，它会随着发酵的进程而不断的积累，当硫的浓度积累达到一定量时将影响酵母的生长、存活及发酵能力，进而限制乙醇浓度的提高，中断发酵过程。换言之，高硫环境对酿酒过程中的酵母而言是一种常见逆境。
贝酵母是众多有发掘前景的酵母之一，除了可产生特殊风味，还表现出了其它的优良性状，如对低温的耐受性比酿酒酵母更强等（Naumov等，2002；Nguyen等，2011），已在目前果酒生产中占有一定的地位，并有良好的市场开发前景，对它的深入研究将使其在未来的果酒生产中扮演重要角色。然而，目前有关酵母耐硫机理的研究基本都集中于酿酒酵母，贝酵母与酿酒酵母在物种水平上相比，基因组间存在很大差异，而贝酵母的耐硫能力很差，硫耐受机理的较大差异是后期影响发酵的主要因素之一（Bashtannaya，1970），如果能在果酒发酵后期在酒精浓度较高的胁迫下当其它酵母失去发酵功能后继续把果汁中的糖转化为酒精，就意味着贝酵母必须能耐受高浓度的硫，但对耐硫机理的研究，国内外均无报道。因此，开展贝酵母耐硫菌株选育和培育，提高其硫耐受性是果酒酿造所用酵母选育研究势在必行的重要目标。
酵母菌的繁殖方式分有性繁殖和无性繁殖两种，以无性繁殖为主。很多酵母菌的二倍体细胞可以进行多代的营养生长繁殖，因而，在酵母菌生活周期中，存在着单倍体细胞和二倍体细胞两种类型，都可以独立生活。二倍体酵母菌细胞个大，生活力强，故发酵工业常利用二倍体酵母菌进行生产。传统的鉴定方法是通过形态学、生理生化性状等对酿酒酵母进行鉴定，将实验结果与标准系统进行对比得出鉴定结论。而酵母属菌种显微形态主要以单细胞形式存在，显微观察结果表明各种内菌株间的细胞性状很接近，准确率较低，几乎观察不到差异，无法准确地将杂交后代与杂交亲本区分开来。（刘小珍、张汉尧，“昆明葡萄酒相关酵母菌的分离与鉴定”，西北农林科技大学学报(自然科学版，已接收)，2014）。
近年来，随着分子生物学的发展，由于分子标记技术能在DNA水平上迅速、有效的鉴定体细胞杂种，并且能在苗期进行，节省大量的时间和精力。因此，分子标记技术被广泛应用于杂种的鉴定。目前，分子标记的方法主要有RFLP、RAPD、ISSR和AFLP等（Zietkiewicz等，1994；Liu等，2009；Zhang等，2009）。由于ISSR标记使用比RAPD引物更长的引物，克服了RAPD标记稳定性和重复性差等缺点，操作简单，重复性好，多态性高，而且不需知道被检测物种任何基因组的信息（Zietkiewicz等，1994），已用于黑木耳（汪思迪等，2009）等遗传多样性的检测分析。
发明内容
本发明旨在以耐硫贝酵母菌株为耐硫亲本与其它贝酵母菌株进行杂交培育贝酵母耐硫新菌株，并提供一种贝酵母耐硫杂交后代的鉴定方法，为此而提出一种快速有效地培育贝酵母耐硫新菌株及有效筛选杂交后代的鉴定方法。
本发明贝酵母耐硫杂交育种的后代鉴定方法，包括以下步骤：
（1）贝酵母杂交：参照Codon等（1995）的方法进行；
（2）贝酵母菌株耐硫性测定：
将不同菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD(pH3.5，含琥珀酸盐)上，能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株；
（3）提取和纯化贝酵母DNA：
将菌种采用划线法接种到新的培养基上，获得单菌落。接种单菌落酵母到10mL酵母试管培养基中(YPD培养基)，28℃，培养18h；取1.5mL酵母培养液,12000r/min离心1min收集菌体,加入600μL山梨醇buffer,5μL10U/μL溶菌酶(Lyticase),30℃处理30min。4000r/min离心10min,沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬,加入20μL蛋白酶K混匀,加入4μLRNaseA(100mg/mL),室温放置5min。加入220μL缓冲液GB,颠倒混匀,70℃放置10min,加220μL无水乙醇充分颠倒混匀,所得溶液和沉淀都加入吸附柱中,12000r/min离心30s,向吸附管中加入500μL缓冲液GD,12000r/min离心30s,向吸附柱中加入500μL漂洗液PW洗两次,最后加入30μLddH2O洗脱柱子上的酵母基因组DNA。
（4）组成PCR反应体系配方：
2.5微升10×PCRbuffer(包含Mg2+)，
1微升的10mM前导链引物，
1微升的10mM后导链引物，
0.5微升的10mMofeachdNTP，
0.2微升的5U/μLTaqDNA聚合酶，
2微升模板DNA，
17.8微升dH2O。
上述PCR反应体系以FZF1为基因扩增引物：L1:TACGGGTTGACCACTCCAAT；R1:CACCGCGTTCATATCATCAG。
（5）PCR反应程序：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③60℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟。
（6）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5μg·mL-1的溴化乙锭，电压为3～5V/cm，照像记录。
（7）PCR产物测序：获得的序列用VectorNTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对，鉴定结果：耐硫亲本只产生一条大小为1020bp的条带；而非耐硫亲本为一条700bp的条带。
所述的鉴定方法进一步以FZF1为基因扩增引物PCR分析筛选杂交后代，结果所筛选杂交后代特征突出，均表现为两条带。
所述的鉴定方法进一步是用ISSR区分属于不同菌株的耐硫杂交后代：
（1）组成PCR反应体系配方：
2.5μL10×PCRbuffer(包含Mg2+),
2μL的10mM引物，
0.5μL的10mMdN
0.2μL的5U/μLTaqDNA聚合酶，
2μL模板DNA，
12.8μLddH2O。
ISSR引物如下：
（2）
（3）PCR反应程序为：①95℃5分钟；②95℃解链30秒；③56℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④40个循环；⑥72℃延伸7分钟；
（4）PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5μg·mL-1的溴化乙锭，电压为3～5V/cm，用凝胶成像系统观察结果，并照像记录；
在鉴定结果中，不同单菌落如同属一菌株则ISSR图谱一致，如分属不同菌株则ISSR图谱不一致。
上述步骤中，作为模式生物，酵母的DNA提取和纯化一般而言是成熟的。但在引物筛选方面，我们利用了PAD1、IRC7、MNT2等几对引物，均无法有效地区分杂交后代，耐硫亲本与非耐硫亲本无明显的差异。而FZF1基因的引物可有效区分两者之杂交后代，其PCR结果是：耐硫杂交亲本只能产生一条大小为1020bp的条带，非耐硫杂交亲本仅产生一条700bp的条带。因而，FZF1基因在耐硫亲本与非耐硫亲本之间出现了差异，筛选出耐硫亲本。然而，有意思的是，在NBCI中尚无法比对到与其高度同源的序列。
进一步用该引物筛选杂交后代，杂交后代特征突出，均表现为两条带。
在上述鉴定后，我们进一步用ISSR区分属于不同菌株的耐硫杂交后代，即不同单菌落属于同一菌株则ISSR图谱一致，而分属不同菌株则ISSR图谱不一致。
本发明具有的显著进步和实质性特征是：
在本发明中，我们利用了耐硫亲本与FZF1基因含有一个插入片段而与其它不耐硫的亲本在该片段存在长度差异，作为标记用于选择杂交后代，结合含硫培养基进行筛选，而获得了6个不同的耐硫贝酵母杂交后代菌株，这也是在文献报道中首次用杂交的方式培育贝酵母耐硫菌株的报道。
本发明在分子水平上以DNA序列及ISSR图谱为鉴定的依据加上耐硫表型筛选，大大提高了杂交后代菌株鉴定的准确率。
因此，本发明以耐硫贝酵母菌株为杂交亲本，成功地培育了新的贝酵母耐硫菌株，并在分子水平上以DNA序列为鉴定的依据，显著地提高了菌株鉴定的准确率，能准确地区分杂交父本（单倍体）和杂交母本（单倍体）及其杂交后代，同时能将不同的杂交后代菌株区分开来，为选育在酿酒过程中耐硫逆境的酵母以及利用打下了良好的基础。
本发明属于国家自然科学基金项目（项目编号：31360404）及教育部归国人员启动基金项目（项目编号：212209）的资助项目。
附图说明
图1是用FZF1片段大小鉴定贝酵母耐硫杂种后代。图中，1为1Kbplusladder，Invitrogen；2为耐硫亲本；3为非耐硫亲本；4-9为候选杂交后代。
图2是引物UBC808的ISSR扩增结果，图中，1为1Kbplusladder，Invitrogen；2-9为候选杂交后代。图中5和7指纹图谱相同，为同一菌株；8和9的指纹图谱也相同，属另一相同的菌株。
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。显然，具体实施方式包括但并不限于所指出的内容。
具体实施方式
材料：非耐硫贝酵母菌株为7A2、7A6、7D4，耐硫贝酵母菌株为A9菌株（均引自新西兰奥克兰大学,引入人:张汉尧,2010年），均保存于本实验室，或可向奥克兰大学RichardGardner教授索要。联系方式：WineScienceProgramme,SchoolofBiologicalSciences,UniversityofAuckland,PrivateBag92019,Auckland,NewZealand。
试剂：引物由上海生物工程公司合成；TaqDNA聚合酶、dNTPs、RNase购自上海生物工程公司；DNAMarker为1Kbplusladder，购自Invitrogen；酵母基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司其他常规试剂为国产分析纯产品。
（一）以耐硫贝酵母菌株为杂交亲本培育贝酵母耐硫菌株以及DNA序列鉴定
贝酵母杂交：
参照Codon等（1995）的方法进行。将7A2、7A6、7D4的单倍体菌株分别与A9的单倍体菌株混合接种于YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养，培养20h后收集菌体，涂布于YEPD平板，挑取较大的单菌落，编号保存。
贝酵母耐硫性测定：
菌株耐硫测定，将不同菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD(pH3.5，含琥珀酸盐)上，能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株。
DNA的提取和纯化：
按照试剂盒说明书进行提取。将菌种采用划线法接种到新的培养基上，获得单菌落。接种单菌落酵母到10mL酵母试管培养基中(YPD培养基)，28℃，培养18h；取1.5mL酵母培养液,12000r/min离心1min收集菌体,加入600μL山梨醇buffer,5μL10U/μL溶菌酶(Lyticase),30℃处理30min。4000r/min离心10min,沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬,加入20μL蛋白酶K混匀,加入4μLRNaseA(100mg/mL),室温放置5min。加入220μL缓冲液GB,颠倒混匀,70℃放置10min,加220μL无水乙醇充分颠倒混匀,所得溶液和沉淀都加入吸附柱中,12000r/min离心30s,向吸附管中加入500μL缓冲液GD,12000r/min离心30s,向吸附柱中加入500μL漂洗液PW洗两次,最后加入30μLddH2O洗脱柱子上的酵母基因组DNA。
PCR扩增：PCR反应体系（25μL）由以下组成：2.5μL10×PCRbuffer(包含Mg2+),1μL的10mM前导链引物L1:TACGGGTTGACCACTCCAAT，1μL的10mM后导链引物R1:CACCGCGTTCATATCATCAG，0.5μL的10mMdNTP，0.2μL的5U/μLTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，17.8μLddH2O。PCR反应程序为：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③51-60℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟。
PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳（含0.5μg/mL的溴化乙锭），电压为3～5V/cm，用凝胶成像系统观察结果，并照像记录。PCR产物送上海生工测序，获得的序列用VectorNTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对。
以上步骤的结果是：从3个不同的杂交组合中，每个组合各挑了6个较大的单菌落，共获得了18个疑似杂交后代。在进一步的耐硫性鉴定时，有7个菌株无法在含硫培养基中生长起来。为印证这些杂交后代菌株的真实性，本发明利用分子生物学的方法从DNA水平进行印证。FZF1基因的引物在耐硫亲本与非耐硫亲本间出现了条带差异。PCR只能产生一条大小为1020bp的，为耐硫亲本；而产生一条700bp的则为非耐硫亲本。但耐硫亲本的FZF1基因序列在NBCI中用BLAST工具进行比对时，无法比对到与其高度同源的序列。
进一步用该引物对筛选杂交后代时，杂交后代特征突出，均表现为两条带（见图1）。用FZF1引物进行PCR分析的结果表明：在18个疑似杂交后代中有5个菌株只含非耐硫亲本的特征条带，2个菌株中含耐硫亲本的特征条带，而其余的11个菌株则含有双亲的特征带。
用FZF1基因引物进行PCR分析的结果仅能准确地鉴定候选单菌落是否为真实杂种，但无法区分不同单菌落是否为相同的菌株。因酵母有无性繁殖的能力，不同的单落为同一菌株的可能性是存在的。张汉尧等（2010）就曾在新西兰的不同橡树子上分离相同出的奇异酵母菌株。为此，我们进一步采用ISSR进行分析。
（二）用ISSR分析不同菌株的耐硫杂交后代
所用的6条ISSR引物见表2，引物由上海生工合成。
表2所用ISSR引物
PCR反应体系（20μL）由以下组成：2.5μL10×PCRbuffer(包含Mg2+),2μL的10mM引物，0.5μL的10mMdNTP，0.2μL的5U/μLTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA，12.8μLddH2O。PCR反应程序为：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③56℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④40个循环；⑥72℃延伸7分钟。PCR产物的电泳、照相处理等同上。
ISSR分析结果表明：6条引物共扩增出清晰、可重复的条带57条，其中多态性条带31条。每条引物扩增的条带数平均为9.50条，包括5.17条多态性条带，条带大小在100～2500bp范围内，部分扩增结果见图2。这6条引物中，有一条引物UBC808可将所有不同的菌株区分开来，泳道5和7为C2#与C5#（来自7A2×A9杂交组合），泳道8和9为C7#与C15#（来自7D4×A9杂交组合）（图2）。8个候选耐硫杂交后代单菌落中，有C2#与C5#（来自7A2×A9杂交组合）单菌落的6条引物所扩增指纹图谱完全一致，为同一菌株；C7#与C15#（来自7D4×A9杂交组合）单菌落的6条引物所扩增指纹图谱也完全一致，也为同一菌株。至此，共有6个不同耐硫杂交后代菌株被鉴定出来。
〈110〉西南林业大学
〈120〉贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法
〈160〉4
〈170〉PatentVersion1
〈210〉1
〈211〉318
〈212〉PRT
〈213〉贝酵母，也称葡萄汁酵母(Saccharomycesbayanus，S.uvarum)
〈220〉
〈221〉CDS
〈222〉（1）…（318）
〈223〉
〈400〉1
151015
ThrLysTyrValSerSerSerTyrThrAlaSerValIleSerGly
202530
ValLeuAspAlaIleSerAlaGlyIleLeuIleTyrThrGlyLeu
354045
ValGluLeuLeuAlaArgAspPheLeuPheAsnProGlnArgThr
505560
LysAsnIleLysGluLeuSerPheAsnValLeuCysThrLeuPhe
657075
GlyAlaGlyIleMetAlaLeuIleGlyLysTrpAla*SerGlu
808590
ProAsnGluGlyAsnTyrIleProheLeuAspIleLeuSerIleIle
95100105
SerLeuValSerLeuIleIleLysAsnLysGlnPhePheLeuLys
110115120
LeuTyrMetArgGlyThr*IleThrHis*LeuValIleLys125130135
AspGluValHisAsnProGluLeuHisCysAspValSerAspMet
140145150
ThrArgLeuLeuGly*GlnIleIleAspLeu*LeuTyrLeu
155160165
GlnGlnLeuLysLeuPheIleCysSerArgPheLeuLeuIleSer
170175180
TyrThrAsnLysLysAsnLysAsnLeuArgValHisSerIleArg185190195
PheLeuTyrGluCysValTyrIleHisSerHisLeuPheGlnHis
200205210
PhePheAsnThrVal*LeuIlePheIleGlu*ValLeuAla
215220225
LysLysLeuIleAlaValSerPhePheLeuThrValSerGly*
230235240
ProLeuThrLysCysAsnGlnLysAsnMetSerIleAlaAsnAla
245250255
IleGlnGluAlaArgThrValArgGluLeuProSerAlaGlyThr
260265270
IlePheCysSerGlyAspGlyGlnTyrLysGluThr*Leu*
275280285
LysIleGlnMetLeuPhe*ArgLeu**ArgLeuGlnGln
290295300
ThrLysSerAla*ThrThrSerLysLeuSerTyrGluSerLys
305310315
AlaValSerLeuArg*Ala*MetTrpGlnGluIleHisLys
318
ThrMetSer
〈210〉2
〈212〉DNA
〈213〉贝酵母，也称葡萄汁酵母(Saccharomycesbayanus，S.uvarum)
〈220〉
〈221〉CDS
〈222〉（1）…（955）
〈223〉
〈400〉2
accaagtatgttagtagctcttacacagccagtgtaatttctggtgttttggacgctatt60tcagccggtatcttgatttacactggtttggttgaactattagcaagggactttttattc120aatccacaaagaacaaaaaatatcaaagaattatccttcaatgtgctatgtactcttttc180ggtgctggtataatggctttaataggtaaatgggcttgaagtgaaccaaacgaagggaac240tatatcttcttagatattttgtcgataatcagtttagtaagtttaataattaaaaataag300cagttctttcttaaattatatatgagaggtacataaatcacacactgattggttatcaaa360gatgaagtacataatccagagttgcattgtgatgtatctgatatgactcgtctccttgga420
taacaaataatagacctttaactttatcttcaacaattaaagttgtttatttgttcacgt480ttccttctaatatcatatacgaataagaaaaataaaaaccttcgagtccactcaatccga540tttttatacgagtgtgtgtatatccatagtcacttatttcaacacttttttaatactgta600tagttaattttcattgaataagtattagcaaaaaaattaatagcagttagctttttcttg660acagtttcgggctagccattaacaaaatgtaatcaaaaaaatatgtctattgcaaatgct720atacaagaagcacgaactgtaagagagctaccgagtgctggaaccattttttgctcagga780gatggccaatacaaagaaacctaactctagaagatacaaatgctcttttgaaggctgtga840taaagacttcaacagaccaagtctgcttgaacaacatcaaaactctcatatgaatcaaaa900gccgtatctttgcgatgagcctgaatgtggcaagaaattcataagaccatgtcat955
〈210〉3
〈211〉20
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉misc-feature
〈222〉（1）…（20）
〈223〉根据不同来源的非耐硫贝酵母菌的FZF15'端保守序列而设计的引物
〈400〉3
tacgggttgaccactccaat
〈210〉4
〈211〉20
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉misc-feature
〈222〉（1）…（20）
〈223〉根据不同来源的非耐硫贝酵母菌的FZF13'端保守序列而设计的引物
〈400〉4
caccgcgttcatatcatcga

Claims (3)

1.贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法，包括以下步骤：
（1）贝酵母杂交；
（2）贝酵母菌株耐硫性测定：
将不同菌株接种于新鲜的含15mg/L亚硫酸钠的YPD培养基上，该YPD培养基的pH3.5，且含琥珀酸盐，在该YPD培养基上能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株；
其中，YPD培养基是含10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L琼脂、20g/L葡萄糖的固体培养基；
（3）提取和纯化贝酵母DNA：
将菌种采用划线法接种到新的培养基上，获得单菌落；接种单菌落酵母到10mL酵母试管YPD培养基中，28℃，培养18h；取1.5mL酵母培养液，12000r/min离心1min收集菌体，加入600μL山梨醇缓冲液，5μL10U/μL溶菌酶，30℃处理30min；4000r/min离心10min，沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬，加入20μL蛋白酶K混匀，加入4μL浓度为100mg/mL的RNaseA，室温放置5min；加入220μL缓冲液GB，颠倒混匀，70℃放置10min，加220μL无水乙醇充分颠倒混匀，所得溶液和沉淀都加入吸附柱中，12000r/min离心30s，向吸附管中加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心30s，向吸附柱中加入500μL漂洗液PW洗两次，最后加入30μLddH2O洗脱柱子上的酵母基因组DNA；
上述YPD培养基是与步骤（2）YPD组份相同的固体培养基；
（4）组成PCR反应体系配方：
2.5微升10×PCR缓冲液
1微升的10mM前导链引物
1微升的10mM后导链引物
0.5微升的10mMdGTP、dATP、dCTP和dCTP
0.2微升的5U/μLTaqDNA聚合酶
2微升模板DNA
17.8微升dH2O
上述PCR反应体系中的引物为FZF1基因的扩增引物：L1:TACGGGTTGACCACTCCAAT；R1:CACCGCGTTCATATCATCAG；
（5）PCR反应程序：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③60℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟；
（6）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5μg·mL-1的溴化乙锭，电压为3～5V/cm，照像记录；
（7）PCR产物测序：获得的序列用VectorNTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对，鉴定结果：耐硫亲本只产生一条大小为1020bp的条带；而非耐硫亲本为一条700bp的条带。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征是进一步以FZF1基因的特异扩增引物进行PCR分析筛选杂交后代，结果所筛选杂交后代特征突出，均表现为两条带。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征是进一步用ISSR区分属于不同菌株的耐硫杂交后代：
（1）组成PCR反应体系配方：
2.5μL10×PCR缓冲液，该缓冲液包含Mg2+，
2μL的10mM引物，
0.5μL的10mMdNTP，
0.2μL的5U/μLTaqDNA聚合酶，
2μL模板DNA，
12.8μLddH2O
ISSR引物如下：
注：Y为C和T碱基之一种;R为A和G碱基之一种
PCR反应程序为：①95℃5分钟；②95℃解链30秒；③56℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④40个循环；⑥72℃延伸7分钟；
PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5μg·mL-1的溴化乙锭，电压为3～5V/cm，用凝胶成像系统观察结果，并照像记录；
在鉴定结果中，不同单菌落如同属一菌株则ISSR图谱一致，如分属不同菌株则ISSR图谱不一致。
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