CN101548021A

CN101548021A - 用于检测酵母属酵母菌的引物组

Info

Publication number: CN101548021A
Application number: CNA2007800450622A
Authority: CN
Inventors: 林伸之; 吉田聪; 金井圭子; 生岛茂人; 港纪子
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 2006-10-05
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2009-09-30

Abstract

本发明的一个目的是提供一种引物组，其可以精确、快速和简单地鉴定酵母属的酵母菌种。根据本发明，提供一种用于检测酵母属的酵母菌种的引物组，其包括选自下述的引物：具有SEQ ID NOS：1至17或23至30的碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸。

Description

用于检测酵母属酵母菌的引物组

技术领域

本发明涉及一种用于检测酵母属的酵母菌的引物组(primer set)，更特别地位用于检测酵母属的酵母菌的LAMP引物组和PCR引物组。而且，本发明还涉及一种使用这样的引物组用于检测和定量酵母属的酵母菌的方法。

背景技术

酵母属的酵母菌广泛地用于生产面包、以及生产酒精饮料比如啤酒、葡萄酒、日本米酒、精馏酒精和威士忌。酿酒酵母被用于生产通过发酵制造的酒精饮料，包括上面发酵的啤酒比如淡色啤酒、葡萄酒、日本米酒和果酒比如苹果酒，以及生产蒸馏酒比如精馏酒精和威士忌。贝酵母被用于生产葡萄酒、雪利酒、汽酒等。目前，在生产比尔森啤酒中所用的底层发酵的酵母菌分类为巴斯德酵母(Kurtzman，C.P.&Fell，J.W.The Yeasts，A Taxonomic Study，第4版，1998，ElsevierScience，B.V.，The Netherlands，Back，W.：Farbatlas und Handbuch derGeraenkebiologie，Teil I，1994，Verlag Hans Carl.Nuernberg，Barnett，J.A.等人：Yeasts，characteristics and identification，3^rd edition，2000，Cambridge University Press，UK，Seishu Kobo/Koji Kenkyukai(StudyGroup for Sake Yeasts and Rice Malts)：“Studies of Sake Yeasts，”2003，Shinnihon Printing Inc.，Tokyo)。因此，为了掌握在生产食品和饮料中所用的酵母菌是否是合适的酵母菌，鉴定酵母属的酵母菌的菌株类型的技术很重要。

然而，当将这样的酵母菌保留在过滤的酒精饮料产品中，或者将它们与外来物混合时，会出现过度发酵和引起混浊，并且其也会引起独特的气味。因此，这样的过度发酵进一步引起刺激性苦味，因而其影响产品性质(Back，W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie，Teil I，1994，Verlag Hans Carl，Nuernberg，European BreweryConvention：ANALYTICA-MICROBIOLOGICA-EBC，第2版，2005Fachverlag Hans Carl，Nuernberg).

而且，酵母属的这种酵母菌也可以从软饮料，特别是从果汁饮料中分离出。如果在产品中混合这样的酵母菌，那么糖比如葡萄糖或蔗糖会产生碳酸气、乙醇和不良气味，从而产品的性质受到显著损害(Back，W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie，Teil II，1999，Verlag Hans Carl，Nuernberg)。

因此，如果酵母属的酵母菌在产品中扩增，其会显著地影响工业。因此，快速检测和/或鉴定这样的酵母菌的技术对于控制性质很重要。而且，当从产品中分离的酵母属的酵母菌为已经在生产方法中所用的酵母菌时，据认为其是由于从生产方法的上游渗透，一种不利的过滤步骤等引起。如果从产品中分离的酵母菌是从外来物混合物的，据认为其时由于填料的洗涤不充分，粉尘在管中累积等引起。因此，当发现污染时，鉴定从产品中分离的酵母菌的技术对于澄清要解决的问题很重要。

然而，从分类学而言，巴斯德酵母(Saccharomces pastorianus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和贝酵母(Saccharomyces bayanus)是极其密切相关的。严格地讲，它们与一些其他种类的酵母菌比如奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)和麦卡特酵母(Saccharomyces mikatae)一起形成名为酵母属的分类群(Naumov.，G.I.等人，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，2000，vol.50，1931-1942)。此外，巴斯德酵母被认为是由于酿酒酵母与贝酵母杂交形成的种类，因此，已经证实巴斯德酵母是上述两种酵母菌种在基因水平和染色体水平的杂种(Kielland-Brandt，M.C.等人：Genetics of brewing yeast.The Yeast，第二版，第6卷，第223-254页，由Wheals，等人编辑，Academic Press，New York，Ryu，S.-L.等人：Yeast，1996，vol.12，757，Tamai，Y.等人：Yeast，1998，第14卷，923-933，Tamai，Y.等人：Yeast，2000，第16卷，1335-1343)。作为常规酵母菌鉴定方法，使用形态学、生理学和生化方法。特别地，在许多情况下，检验各种糖的吸收能力(assimilating ability)和发酵能力。然而，因为严格地讲，属于酵母属的菌株的表型互相类似，常规方法很难对所述菌株进行互相区别(Naumova，E.S.等人：AntonievanLeeuwenhoek，2003，vol.83，155-166)。作为用于区别这样的菌株的分子生物学方法，已知有PCR指纹法、DNA/DNA重组动力学、核型分析、线粒体DNA的限制性内切酶裂解分析、rRNA基因碱基序列的分析、rDNA限制性内切酶裂解分析、UP-PCR同工酶分析、PCR-温度梯度凝胶电泳、实时PCR等。

迄今为止，已经研究了一种方法，其包括通过PCR方法扩增酵母属酵母菌的FLO1基因的一部分，或者通过PCR方法扩增rRNA基因的一部分，接着用RFLP鉴定其是否是酵母属的酵母菌、另一种属的酵母菌、用于发酵的酵母菌或用于非发酵目的的酵母菌(日本专利特许公开No.11-56366)。而且，基于发现了在底层发酵酵母菌中的26SrRNA基因和5S rRNA基因之间存在两种间隔区序列，研究了对于这两种序列特异性的PCR引物组(日本专利特许公开No.2001-8684)。而且，研究了对于其中Lg-FLO1的N末端部分连接酵母菌染色体IX的基因的Lg-FLO1同类系基因(congenic gene)特异性的引物(日本专利特许公开No.2002-233382).

然而，因为PCR或实时PCR需要高水平的温度调节和荧光观察，这些方法需要昂贵的装置。另外，在反应完成之后，PCR方法需要电泳、染色、照相等，因此，该方法需要长时间，直到在基因扩增过程之后获得结果。此外，RAPD PCR、扩增产物的限制性内切酶处理、碱基序列的分析、同工酶分析、温度梯度凝胶电泳等比常见PCR的那些需要更长的时间，并且操作更加复杂，因此当在每日微生物试验中进行这些方法时，它们是有问题的。

另一方面，巴斯德酵母同时具有来自酿酒酵母的亚基因组(Sc类型)和来自贝酵母的亚基因组(Lg型)。根据最新研究，据报道，在底层发酵酵母菌的情况下，Sc型染色体XVI右臂的一部分不存在，Lg型染色体III右臂的一部分不存在，并且Lg型染色体VII左臂的一部分不存在(Naoyuki Umemoto等人，“Production of physical map ofbeer yeasts and comparative genomic science，”24^th Annual Meeting ofthe Molecular Biology Society of Japan(2001)；Nakao等人，Proceedings of the 29^th EBC Congress(2003)；Yoshihiro Nakao：Chemistry and Organisms，2005，第43卷，No.9,559-561；和日本专利特许公开No.2004-283169)。然而，在目前的环境下，还没有获得关于巴斯德酵母的染色体易位的详细信息。

更进一步地，研究了用于检测巴斯德酵母的LAMP(环介导的等温扩增)方法引物组(WO2005/093059)。然而，在检测精确性方面仍存在改善的余地。

发明概述

本发明人鉴定了巴斯德酵母的染色体XVI右臂、染色体III右臂和染色体VII左臂的染色体易位的位置，并且也分析了有关这样的易位位置的基因组。而且，基于这样的信息，本发明人成功地开发了能精确地检测酵母属的酵母菌的引物组。

在下文中，关于染色体XVI右臂的染色体易位的发明称为第一个和第二种实施方案，关于染色体III右臂的染色体易位的发明称为第三种实施方案，并且关于染色体VII左臂的染色体易位的发明称为第四种实施方案。

第一种实施方案

本发明人进行了属于巴斯德酵母的底层发酵酵母菌的基因组分析，结果，他们发现底层发酵酵母菌的Sc型染色体XVI与Lg型染色体在右臂GPH1的ORF易位，进一步地发现其在右臂末端方向的QCR2的ORF再次易位，以便其恢复Sc类型。即，本发明人发现仅仅底层发酵酵母菌中的Lg型碱基序列存在于侧面与染色体XVI右臂的GPH1和QCR2相接(flanked with)的区域中。

基于存在于侧面与GPH1和QCR2相接的区域中的Lg型MET16gene的序列(SEQ ID NO：6)，本发明人设计了用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组，并且他们发现使用如此设计的引物组，可以精确地检测巴斯德酵母。所述Lg型MET16基因的序列是一个在迄今为止的任何公共数据库中没有公开的新序列。

特别地，根据本发明的第一种实施方案，提供一种用于检测巴斯德酵母的探针或引物，其由至少10个碱基组成的多核苷酸组成，所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸组成，所述多核苷酸与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第一种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组，其由两种或多种前述的引物组成。

根据本发明的第一种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其由两种或多种前述的引物组成。

根据本发明的第一种实施方案，优选地提供一种用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：1碱基序列的多核苷酸(FIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：2碱基序列的多核苷酸(F3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：3碱基序列的多核苷酸(BIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：4碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

基于底层发酵酵母菌的染色体XVI右臂的染色体易位位置，本发明人设计了用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，然后，发现使用该引物组可以精确地检测巴斯德酵母。

特别地，根据本发明的第一种实施方案，提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括：具有SEQ ID NO：27碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和具有SEQ ID NO：28碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第一种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括：具有SEQ ID NO：29碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和具有SEQ ID NO：30碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第一种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其中一种引物为用由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交，和另一个引物为由至少10个碱基组成的多核苷酸，其与Sc型碱基序列或其互补序列杂交，所述碱基序列来自侧面与底层发酵酵母菌的染色体XVI右臂的GPH1和QCR2相接的区域中。

根据本发明的第一种实施方案，提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过LAMP方法，使用第一种实施方案的LAMP引物组进行核酸扩增反应。

根据本发明的第一种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过PCR方法，使用第一种实施方案的PCR引物组进行核酸扩增反应。

根据本发明的第一种实施方案，进一步提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括使用第一种实施方案的探针检测杂交复合物。

第二种实施方案

本发明人发现仅仅底层发酵酵母菌中的Lg型碱基序列存在于侧面与染色体XVI右臂的GPH1和QCR2相接的区域中。即，其显示出在巴斯德酵母或贝酵母中，侧面与染色体XVI右臂的GPH1和QCR2相接的区域中不存在Sc型碱基序列，因此，前述Sc型碱基序列对酿酒酵母是特异性的。

基于存在于侧面与GPH1和QCR2相接的区域中的Sc型MET16基因，本发明人设计了用于检测酿酒酵母的LAMP引物组。接着，发明人发现使用该引物组可以精确地检测酿酒酵母。

特别地，根据本发明的第二种实施方案，提供一种用于检测酿酒酵母的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：7碱基序列的多核苷酸(FIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：8碱基序列的多核苷酸(F3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：9碱基序列的多核苷酸(BIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：10碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第二种实施方案，提供一种用于检测酿酒酵母的方法，其包括通过LAMP方法，使用第二种实施方案的LAMP引物组进行核酸扩增反应。

第三种实施方案

本发明人发现底层发酵酵母菌的Lg型染色体III与Sc型染色体在右臂的MAT基因座易位，并且仅仅Sc型碱基序列存在于底层发酵酵母菌的染色体III右臂的MAT基因座至其末端。即，其显示出因为Lg型碱基序列在酿酒酵母或巴斯德酵母中的染色体III右臂的MAT基因座至其末端不存在，对应于该区域的贝酵母的碱基序列对贝酵母是特异性的。

基于存在于夹在MAT基因座和末端之间的区域中的RAD18同源基因的序列，本发明人设计了用于检测贝酵母的LAMP引物组。接着，发明人发现使用该引物组可以精确地检测贝酵母。

特别地，根据本发明的第三种实施方案，提供一种用于检测贝酵母的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：13碱基序列的多核苷酸(FIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：14碱基序列的多核苷酸(F3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：15碱基序列的多核苷酸(BIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：16碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

本发明人还基于底部发酵酵母菌的染色体III右臂的染色体易位的位点，设计了用于检测巴斯德酵母的PCR引物组。然后，本发明人发现使用该引物组可以精确地检测巴斯德酵母。

特别地，根据本发明的第三种实施方案，提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括：具有SEQ ID NO：23碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和具有SEQ ID NO：24碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第三种实施方案，提供一种用于检测贝酵母的方法，其包括通过LAMP方法，使用第三种实施方案的LAMP引物组进行核酸扩增反应。

根据本发明的第三种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过PCR方法，使用第三种实施方案的PCR引物组进行核酸扩增反应。

第四种实施方案

本发明人发现用在左臂KEM1基因的ORF中的Sc型染色体可易位底部发酵酵母菌的Lg型染色体VII。即，本发明人发现仅仅Sc型碱基序列存在于底部发酵酵母菌中染色体VII左臂的KEM1基因座至左臂末端。

本发明人还基于底部发酵酵母菌的染色体VII右臂的染色体易位的位点，设计了用于检测巴斯德酵母的PCR引物组。然后，本发明人发现使用该引物组可以精确地检测巴斯德酵母。

特别地，根据本发明的第四种实施方案，提供一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括：具有SEQ ID NO：25碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和具有SEQ ID NO：26碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

根据本发明的第四种实施方案，还提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过PCR方法，使用第四种实施方案的PCR引物组的进行核酸扩增反应。

根据本发明的引物组，可以以种水平精确地检测酵母属的酵母菌。特别地，根据本发明的LAMP引物组可以用于LAMP方法的核酸扩增反应，和基于存在或不存在扩增产物来检测目标种。因此，根据本发明的引物组，可以以种水平精确、快速和简单地鉴定酵母属的酵母菌。

根据本发明的LAMP引物组，也可以测定包含在样品中的细胞数量。因此，根据本发明的LAMP引物组，可以准确地定量巴斯德酵母、酿酒酵母和贝酵母。

酵母属的酵母菌是使多种类型的饮料比如酒精饮料和软饮料混浊酵母菌种。因此，存在或不存在这些酵母菌种可用作多种类型的饮料质量控制的指示剂。因此，根据本发明的引物组用于多种类型的饮料(例如，酒精饮料和软饮料，特别是啤酒、低麦芽啤酒(happoshu)和葡萄酒)的质量控制和环境样品的检查。

附图说明

图1显示了用于检测巴斯德酵母的引物组(LGM1LB1)用于检测目标种的反应特异性。使用下述菌株：酿酒酵母NBRC10217、贝酵母NBRC11022、巴斯德酵母NBRC11024、NBRC11023和NBRC10610、酿酒酵母糖化变种(var.diastaticus)DSM70487、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)NBRC10609、卡里奥酵母(Saccharomycescariocanus)NBRC10947、麦卡特酵母NBRC1815、库维酵母(Saccharomyces kudriavzevii)NBRC 1802、少孢酵母(Saccharomycesexiguous)NBRC1128、斯维兹酵母(Saccharomyces servazzii)NBRC1838、单孢酵母(Saccharomyces unisporus)NBRC0316、大连酵母(Saccharomyces dairenensis)NBRC0211、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)NBRC1685、Nega：没有加入基因组DNA。

图2显示了由巴斯德酵母的菌落形成数形成的近似曲线和通过LAMP方法使用LGM1LB1的检测时间。横轴上的阈时间显示了当浊度超过0.1时的反应时间。

图3显示了用于检测酵母属的引物组(SSC1LB1)用于检测目标种的反应特异性。使用下述菌株：酿酒酵母NBRC10217、贝酵母NBRC11022、巴斯德酵母NBRC11024、NBRC11023和NBRC10610、酿酒酵母糖化变种DSM70487、奇异酵母NBRC10609、卡里奥酵母NBRC10947、麦卡特酵母NBRC1815、库维酵母NBRC 1802、少孢酵母NBRC1128、斯维兹酵母NBRC1838、单孢酵母NBRC0316、大连酵母NBRC0211、克鲁弗酵母NBRC1685、Nega：没有加入基因组DNA。

图4显示了用于检测底部发酵酵母菌的引物组(SBFY1LF1LB1)用于检测目标种的反应特异性。使用下述菌株：酿酒酵母NBRC10217、贝酵母NBRC11022、巴斯德酵母NBRC11024、NBRC11023和NBRC10610、酿酒酵母糖化变种DSM70487、奇异酵母NBRC10609、卡里奥酵母NBRC10947、麦卡特酵母NBRC1815、库维酵母NBRC1802、少孢酵母NBRC1128、斯维兹酵母NBRC1838、单孢酵母NBRC0316、大连酵母NBRC0211、克鲁弗酵母NBRC1685、Nega：没有加入基因组DNA。

发明详述

引物和引物组

根据本发明的LAMP引物组由4种引物组成，即FIP、F3、BIP和B3。这些引物对应于目标核苷酸序列上的6个区域。特别地，区域F3c、F2c、F1c、B1、B2和B3依次是从目标碱基序列上的3’末端侧至5’末端侧确定的。此后，根据所述6个区域制备4种类型的引物，即FIP、F3、BIP和B3。本文中，与区域F3c、F2c和F1c互补的区域分别为F3、F2和F1。另外，与区域B1、B2和B3互补的区域分别为B1c、B2c和B3c。

FIP是一种按如下方式制备的引物，其具有与3’末端侧的目标序列的F2c区域互补的F2区域，并且具有与在5’末端侧的目标基因的F1c区域相同的序列。如有必要，可以将限制性内切酶位点引入该FIP引物的F1c和F2之间的部分中。

F3为一种通过如下方式制备的引物，其具有与目标基因的F3c区域互补的F3区域。

BIP是一种按如下方式制备的引物，其具有与3’末端侧的目标序列的B2c区域互补的B2区域，并且具有与在5’末端侧的目标基因的B1c区域相同的序列。如有必要，可以将限制性内切酶位点引入该BIP引物的B1c和B2之间的部分中。

B3为一种通过如下方式制备的引物，其具有与目标基因的B3c区域互补的B3区域。

当限制性内切酶位点包含在FIP和BIP引物中时，在完成通过LAMP方法的核酸扩增反应之后，用限制性内切酶处理扩增的产物，以便在进行电泳之后可观察到单一条带。在这种情况下，如果所述目标序列包含限制性内切酶位点，可以不必将这样的限制性内切酶位点人工引入所述引物中。

当使用根据本发明的LAMP引物组时，可以加入一种或多种类型的Loop引物(LF引物或LB引物)以促进核酸扩增反应。设计这样的Loop引物，使得其退火至F1和F2之间的区域或B1和B2之间的区域，然后将其加入所述LAMP反应体系中。因此，这些引物结合在所述核酸扩增过程中未使用的Loop部分，因而可以使用所有的Loop部分作为来源促进核酸反应，并且因而可以促进核酸扩增反应(例如，日本专利特许公开No.2002-345499)。

特别地，在第一种实施方案的LAMP引物组之中，由具有SEQ IDNO：1至4的碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸组成的LAMP引物组可以进一步包括作为Loop的具有SEQ ID NO：5碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

第二种实施方案的LAMP引物组可以进一步包括作为Loop引物的下述任一种或两种：具有SEQ ID NO：11碱基序列的多核苷酸(LF)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和具有SEQ ID NO：12碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

第三种实施方案的LAMP引物组可以进一步包括作为Loop引物的具有SEQ ID NO：7碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

在本发明中，不仅具有SEQ ID NO：1至5和7至30的碱基序列的多核苷酸可以用作引物或者探针，而且与具有与SEQ ID NO：1至5和7至30的碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸(在本说明书中，其也可称为“同源多核苷酸”)也可用作引物或探针。

而且，在本发明中，由至少10个碱基组成的与具有SEQ ID NO：6的碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，和由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：6的碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸都可用作LAMP引物、PCR引物和探针。

在本说明书中使用的术语“杂交”指一些多核苷酸与目标多核苷酸杂交，但是其基本上不会与除了目标多核苷酸之外的多核苷酸杂交。这样的杂交可以在严格条件下进行。本文中，“严格条件”可以根据引物序列双链和其互补链的Tm(℃)、必需的盐浓度等确定。选择用作探针的序列和接着确定其合适的严格条件的技术是本领域技术人员所熟知的。(参见，例如，J.Sambrook，E.F.Frisch，T.Maniatis；Molecular Cloning 2^nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等)。对于这样的严格条件，杂交反应是在常用于杂交的合适缓冲溶液中，在稍微低于根据核苷酸序列确定的Tm的温度(例如，比Tm低约0℃至5℃的温度)进行。另外，对于其它严格条件，在杂交反应之后，在高浓度低盐浓度溶液中进行洗涤。这样的严格条件的实例包括洗涤条件，其中37℃(对于由约14个碱基组成的寡核苷酸)、48℃(对于由约17个碱基组成的寡核苷酸)、55℃(对于由约20个碱基组成的寡核苷酸)和60℃(对于由约23个碱基组成的寡核苷酸)下，在6×SSC/0.05％焦磷酸钠溶液中进行洗涤。

同源多核苷酸的核苷酸长度为至少10个碱基。

在LAMP引物的情况下，FIP和BIP的每种同源多核苷酸的核苷酸长度可以优选地为至少30个碱基(例如30至60个碱基)，更优选至少42个碱基(例如，42至57个碱基)。

而且，F3、B3、LF和LB的每种同源多核苷酸的核苷酸长度可以优选地位至少12个碱基(例如12至30个碱基)，更优选至少18个碱基(例如，18至25个碱基和18至30个碱基)。

在PCR引物的情况下，具有SEQ ID NO：23至30的碱基序列的多核苷酸的每种同源多核苷酸的核苷酸长度可以优选地为至少15个碱基(例如，15至30个碱基)，更优选至少18个碱基(例如18至24个碱基和18至30个碱基)，特别地优选至少20个碱基(例如，20至25个碱基和20至30个碱基)。

这样的同源多核苷酸可以是包括相应碱基序列的至少10个，优选至少15个，更优选至少18个，特别优选至少20个邻接核苷酸的多核苷酸。

与具有SEQ ID NO：1至5和7至30的碱基序列的多核苷酸同源的多核苷酸的实例如下。

·一种具有SEQ ID NO：1碱基序列的FIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：1的至少42个(42至52个)、更优选至少47个(47至52个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多57个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：2碱基序列的F3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：2的至少15个(15至19个)、更优选至少18个(18或19个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多21个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：3碱基序列的BIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：3的至少36个(36至42个)、更优选至少38个(38至42个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多53个碱基，更优选地至多47个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：4碱基序列的B3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：4的至少19个(19至23个)、更优选至少21个(21至23个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：5碱基序列的LB的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：5的至少18个(18至22个)、更优选地至少20个(20至22个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：7碱基序列的FIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：7的至少38个(38至47个)、更优选地至少42个(42至47个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多53个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：8碱基序列的LB的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：8的至少18个(18至22个)、更优选地至少19个(19至22个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：9碱基序列的BIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：9的至少42个(42至57个)、更优选地至少47个(47至57个)、特别优选地至少51个(51至57个)和最优选至少53个(53至57个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：10碱基序列的B3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：10的至少19个(19至25个)、更优选地至少22个(20至25个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基)[0071]

·一种具有SEQ ID NO：11碱基序列的LF的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：11的至少19个(19至25个)、更优选地至少22个(20至25个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：12碱基序列的LB的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：12的至少19个(19至25个)、更优选地至少22个(20至25个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：13碱基序列的FIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：12的至少42个(42至53个)、更优选地至少48个(48至53个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多57个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：14碱基序列的F3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：13的至少18个(18至21个)、更优选地至少19个(19至21个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：15碱基序列的BIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：14的至少37个(37至44个)、更优选地至少42个(42至44个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多53个碱基，更有选地至多47个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：16碱基序列的B3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：15的至少19个(19至25个)、更优选地至少22个(20至25个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱)

·一种具有SEQ ID NO：17碱基序列的LB的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：16的至少14个(14至18个)、更优选地至少16个(16至18个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多22个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：18碱基序列的FIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：18的至少38个(38至47个)、更优选地至少42个(42至47个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多53个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：19碱基序列的F3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：19的至少18个(18至20个)、更优选地至少19个(19或20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多22个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：20碱基序列的BIP的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：20的至少36个(36至42个)、更优选地至少38个(38至42个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多53个碱基，更有选地至多47个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：21碱基序列的B3的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：21的至少18个(18至20个)、更优选地至少19个(19或20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多22个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：22碱基序列的LB的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：22的至少18个(18至20个)、更优选地至少19个(19或20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多22个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：23碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：17的至少19个(19至21个)、更优选地至少21个(21至23个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：24碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：18的至少20个(20至24个)、更优选地至少22个(22至24个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：25碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：19的至少18个(18至21个)、更优选地至少19个(19至21个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：26碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：20的至少14个(14至18个)、更优选地至少16个(16至18个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多25个碱基，优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：27碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：21的至少16个(16至20个)、更优选地至少18个(18至20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：28碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：22的至少16个(16至20个)、更优选地至少18个(18至20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：29碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：23的至少16个(16至20个)、更优选地至少18个(18至20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

·一种具有SEQ ID NO：30碱基序列的多核苷酸的同源多核苷酸：一种多核苷酸，其包括SEQ ID NO：24的至少16个(16至20个)、更优选地至少18个(18至20个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多23个碱基)

在本发明中，由至少10个碱基组成的与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，和由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，分别可以是包括与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的至少10个邻接核苷酸的多核苷酸，和包括SEQ ID NO：6的碱基序列的至少10个邻接核苷酸。

当将基于SEQ ID NO：6碱基序列制备的多核苷酸用作LAMP引物(FIP和BIP)时，包括SEQ ID NO：6碱基序列或其互补序列的至少42个(例如42至57个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)的多核苷酸(其中所述核苷酸长度可以是至多60个碱基，优选地至多57个碱基)可用作引物。

当将基于SEQ ID NO：6碱基序列制备的多核苷酸用作LAMP引物(F3、B3、LB和LF)时，包括SEQ ID NO：6碱基序列或其互补序列的至少18个(例如18至25个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)的多核苷酸(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基)可用作引物。

当将基于SEQ ID NO：6碱基序列制备的多核苷酸用作PCR引物时，包括SEQ ID NO：6碱基序列或其互补序列的至少15个(例如15至30个)、更优选地至少18个(例如，18至24个和18至30个)、特别是优选地至少20个(例如，20至25个和20至30个)邻接核苷酸(其中可以引入一个或几个突变)的多核苷酸(其中所述核苷酸长度可以是至多30个碱基，优选地至多25个碱基，更优选地至多24个碱基)可用作引物。

在本发明中，用于检测巴斯德酵母的PCR引物对可以基于具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸来选择。特别地，在可以选择的PCR引物中，使得两个引物之一与SEQ ID NO：6的碱基序列成对，另一个引物与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列成对，并且一个引物与其它引物延伸的延伸链成对。

而且，在本发明中，用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组可以基于具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸来选择。特别地，如上所述设计4个类型用于实施所述LAMP方法所需的引物，即，FIP、F3、BIP和B3，根据需要，还可以使用Loop引物比如LF和LB。

而且，基于SEQ ID NO：6碱基序列制备的每个同源多核苷酸和多核苷酸可以是与各自相应的碱基序列具有至少90％、优选地至少95％同一性的多核苷酸。可以根据本领域众所周知的算法计算同一性的数值。例如，可以使用BLAST(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/ blast-j.html)计算同一性的数值。

而且，基于SEQ ID NO：6碱基序列制备的这样的同源多核苷酸和多核苷酸可以是由修饰的碱基序列组成的多核苷酸，其中相对于相应碱基序列引入了一种或多个突变，并且用具有与相应碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

本文中，术语“突变”可以相同或不同，可以选自取代、缺失、插入和添加。这样的突变可以优选地选自其中用另一个碱基取代某个碱基的“一个碱基取代”、其中删除某一碱基的“一个碱基删除”、其中插入某个碱基的“一个碱基插入”和其中添加某个碱基的“一个碱基添加”。突变的数量可以是1至6个碱基，1、2、3或4个碱基，1或2个碱基，或者1个碱基。

在本发明中，术语“多核苷酸”意味着包括DNA、RNA和PNA(肽核酸)。

构成根据本发明的引物组的多核苷酸可以根据常规方法比如磷酸盐三酯法(Hunkapiller，M.等人，Nature，310，105，1984)通过化学合成核酸来制备。另外，视情况而定，基于在本说明书中公开的核苷酸序列，通过PCR方法等可以获得作为检测目标的菌株的总DNA，然后获得包含感兴趣的核苷酸序列的DNA片段。

根据本发明的检测方法的具体实施方案可以包括如下检测方法：其包括通过LAMP方法对核酸样品进行核酸扩增反应，然后检测存在或不存在核酸扩增产物。特别地，提供下述方法。

在根据本发明的第一种实施方案中，提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括：

(a)通过LAMP方法，使用根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组对包含在样品中的核酸进行核酸扩增反应；和

(b)检测存在或不存在扩增产物，

其中扩增产物的产生表明存在巴斯德酵母，

在根据本发明的第二种实施方案中，提供一种用于检测酿酒酵母的方法，其包括：

(c)通过LAMP方法，使用根据本发明的第二种实施方案的LAMP引物组对包含在样品中的核酸进行核酸扩增反应；和

(d)检测存在或不存在扩增产物，

其中扩增产物的产生表明存在酿酒酵母，

在根据本发明的第三种实施方案中，提供一种用于检测贝酵母的方法，其包括：

(e)通过LAMP方法，使用根据本发明的第三种实施方案的LAMP引物组对包含在样品中的核酸进行核酸扩增反应；和

(f)检测存在或不存在扩增产物，

其中扩增产物的产生表明存在贝酵母，

要进行用LAMP方法的核酸扩增过程的样品可以按如下方法制备，培养包含在样品中的细胞，并从该培养细胞中提取核酸，或者提取这样的核酸而不需培养过程。核酸样品，比如细胞培养物、核酸提取物的制备将如下描述。

在通过LAMP方法的核酸扩增过程中，对包含在样品中的核酸进行扩增反应。将如下描述通过LAMP方法的这样的核酸扩增反应。

在其中检测目标种存在于样品中的情况下，扩增作为目标的特异性区域，产生扩增产物。当产生这样的扩增产物时，进行核酸扩增反应得样品溶液变混浊。因此，可以通过测定所述样品溶液的浊度来确定存在或不存在扩增产物。通过LAMP方法测定浊度是熟知的。可以使用市售可获得的终点浊度测定装置(例如，Teramecs Co.，Ltd.制造的LA-100)实时浊度测定装置(例如，Teramecs Co.，Ltd.制造的LA-200)来测定浊度。

如下给出的实施例所描述的，测定直到样品溶液达到某一浊度所需的时间，以便确定包含在试验样品中的细胞数。特别地，在根据本发明的检测方法的另一个方面，提供一种用于定量巴斯德酵母、酿酒酵母和贝酵母的方法，其包括通过LAMP方法对核酸样品进行核酸扩增反应，同时，测定引发该核酸扩增反应至样品溶液达到某一浊度所需的时间，并根据测定时间获得包含在所述样品中的细胞数。本发明的定量方法特别地为如下所述的。

在根据本发明的第一种实施方案中，提供一种用于定量巴斯德酵母的方法，其包括：

(a)通过LAMP方法，使用根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组对包含在样品中的核酸进行核酸扩增反应；

(b′)测定引发该核酸扩增反应至样品溶液达到某一浊度所需的时间；和

(b＂)根据测定时间获得样品中包含的细胞数。

在根据本发明的第二种实施方案中，优选地，提供一种用于定量酿酒酵母的方法，其包括：

(d′)测定引发该核酸扩增反应至样品溶液达到某一浊度所需的时间；和

(d＂)根据测定时间获得样品中包含的细胞数。

在根据本发明的第三种实施方案中，提供一种用于定量贝酵母的方法，其包括：

(f′)测定引发该核酸扩增反应至样品溶液达到某一浊度所需的时间；和

(f＂)根据测定时间获得样品中包含的细胞数。

在根据本发明的定量方法中，预先使用细胞数和样品溶液达到某一浊度所需时间生成校正曲线。此后，可以基于该校正曲线根据测定时间获得包含在样品中的细胞数。所述校正曲线可以例如通过如下方法生成：以逐步方式稀释细胞来制备样品，接着根据所述LAMP方法对各种样品进行核酸扩增方法，然后绘制引发该核酸扩增反应直到浊度变成0.1所需时间相对于细胞的菌落形成数对数的曲线图。

在根据本发明的检测方法和定量方法中，可以将Loop引物(LF和/或LB)加入到由FIP、F3、BIP和B3组成的引物组中，然后可以通过LAMP方法进行核酸扩增反应。特别地，在根据本发明的第一种实施方案的检测方法和定量方法中，在由具有SEQ ID NOS：1至4碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸组成的引物组的情况下，可以加入具有SEQ ID NO：5碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸，将其作为Loop引物。在根据本发明的第二种实施方案的检测方法和定量方法中，可以加入具有SEQ ID NO：11碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸和具有SEQ ID NO：12碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸中的任一种或两种，将其作为Loop引物。在根据本发明的第三种实施方案的检测方法和定量方法中，可以加入具有SEQ ID NO：17碱基序列的多核苷酸或其同源多核苷酸，并将其作为Loop引物。

根据本发明的LAMP引物组可以单独使用或组合使用，视情况而定。组合使用根据本发明的引物组时，准确地互相区别巴斯德酵母、酿酒酵母和贝酵母成为可能。

而且，根据本发明的LAMP引物组可以单独或组合以试剂盒的形式提供。因此，根据本发明，提供一种用于检测酵母属的酵母菌的试剂盒，其包括选自下述的引物组：第一种实施方案的LAMP引物组；第二种实施方案的LAMP引物组；第三种实施方案的LAMP引物组；和这些引物组的部分或全部的组合。

根据本发明的包括LAMP引物组的试剂盒可以包括通过LAMP方法实施核酸扩增反应所需的试剂(例如，Bst DNA聚合酶，一种用于反应的试剂混合溶液)和装置(例如，用于反应的管)。

根据本发明的包括PCR引物组的试剂盒可以包括通过PCR方法实施核酸扩增反应所需的试剂(例如，DNA聚合酶，纯净水)和装置(例如，用于反应的管)。

根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组靶向Lg型MET16基因，并且存在其与贝酵母反应的可能性，贝酵母在基因组结构方面不均匀。另一方面，根据本发明的第三种实施方案的LAMP引物组靶向贝酵母的RAD18同源基因，并且其能高精度地检测贝酵母，所述RAD18同源基因在酿酒酵母或巴斯德酵母中不存在。因此，当需要更精确地检测巴斯德酵母时，优选地使用根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组与用于检测贝酵母的LAMP引物组(优选地，第三种实施方案的LAMP引物组)。在这种情况下，当在根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组和用于检测贝酵母的LAMP引物组中观察到扩增反应时，或者当在第一种实施方案的LAMP引物组中没有观察到这样的扩增反应，但在用于检测贝酵母的LAMP引物组中观察到这样的扩增反应时，可以确定贝酵母存在于所述样品中。当在根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组中观察到扩增反应而在用于检测贝酵母的LAMP引物组中没有观察到这样的扩增反应时，可以确定所述样品中存在巴斯德酵母中。

因此，根据本发明，提供一种用于检测巴斯德酵母的试剂盒，其包括根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组与用于检测贝酵母的LAMP引物组的组合。

而且，根据本发明，根据本发明的第一种实施方案用于检测巴斯德酵母的方法可以进一步包括通过LAMP方法，使用在检测贝酵母中使用的LAMP引物组进行核酸扩增反应的步骤。该步骤可以包括通过LAMP方法对核酸样品进行核酸扩增反应的步骤和检测存在或不存在核酸扩增产物的步骤。

在上述说明中，用于检测贝酵母的LAMP引物组优选地为根据本发明的第三种实施方案的LAMP引物组。

而且，当需要使用根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组精确地检测巴斯德酵母时，优选地使用根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组与能够检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组的组合。根据本发明的第一种实施方案用于巴斯德酵母的LAMP引物组可以与贝酵母交叉反应，所述贝酵母在基因组结构方面是不均匀的。用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组与包含在巴斯德酵母中的酿酒酵母的基因组序列反应，但是贝酵母不具备酿酒酵母的这样的基因组序列。因此，用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组不与贝酵母反应。在这种情况下，当在根据本发明用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组中和在用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组中都观察到扩增反应时，可以确定在所述样品中存在巴斯德酵母。当通过根据本发明用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组进行扩增反应，并且在用于检测酿酒酵母和贝酵母的LAMP引物组中没有观察到扩增反应时，可以确定在所述样品中存在贝酵母。

因此，根据本发明，提供一种用于检测巴斯德酵母的试剂盒，其包括根据本发明的第一种实施方案的LAMP引物组与用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组的组合。

而且，根据本发明，根据本发明的第一种实施方案用于检测巴斯德酵母的方法可以进一步包括通过LAMP方法，使用在检测酿酒酵母和巴斯德酵母中使用的LAMP引物组进行核酸扩增反应的步骤。该步骤可以包括通过LAMP方法对核酸样品进行核酸扩增反应的步骤和检测存在或不存在核酸扩增产物的步骤。

在上述实施方案中，用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组优选地包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：18碱基序列的多核苷酸(FIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：19碱基序列的多核苷酸(F3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

具有SEQ ID NO：20碱基序列的多核苷酸(BIP)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：21碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；

用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的前述LAMP引物组可以进一步包括作为Loop引物的具有SEQ ID NO：22碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

在根据本发明的检测方法中，通过PCR方法的检测方法的一个具体实例可以包括如下检测方法：其包括通过PCR方法对核酸样品进行核酸扩增反应，然后检测存在或不存在核酸扩增产物。

特别地，提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括：

(g)通过PCR方法，使用根据本发明的第一种实施方案、第三种实施方案或第四种实施方案的PCR引物组对包含在样品中的核酸进行核酸扩增反应；和

(h)检测存在或不存在扩增产物，

其中扩增产物的产生表明存在巴斯德酵母。

对于通过PCR方法进行核酸扩增过程的样品，可以培养包含在样品中的细胞，然后可以提取核酸，或者提取这样的核酸而不需培养。核酸样品比如细胞培养物或核酸提取物的制备将如下描述。

在通过PCR方法的核酸扩增过程中，对包含在样品中的核酸进行扩增反应。通过PCR方法进行这样的核酸扩增反应是公开已知的。本领域技术人员可以合适地确定用于PCR方法或其修饰方法的条件，并且可以实施该PCR方法。

在根据本发明的检测方法中，使用探针的检测方法的一个具体实施方案可以包括如下检测方法：其包括进行根据本发明的探针与核酸样品的杂交，然后检测存在或不存在核酸复合物。

特别地，提供一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括：

(i)使根据本发明的第一种实施方案的探针接触包含在样品中的核酸；和

(j)检测存在或不存在杂交复合物，

其中所述杂交复合物的产生表明存在巴斯德酵母，

在使用探针的这样的检测方法中，可以在使用之前标记该探针。标记物质的实例包括放射性元素(例如³²P和¹⁴C)、荧光化合物(例如，FITC)和与酶反应相关的分子(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶)。

可以通过已知的方法比如Northern杂交、Southern杂交和菌落杂交检测杂交复合物。

如果使用根据本发明的引物组进行核酸扩增反应，可以以种水平准确地鉴定酵母属的酵母菌，其引起酒精饮料或软饮料的质量降低。因此，根据本发明的引物组和试剂盒可以用于酒精饮料(例如，啤酒、低麦芽啤酒、葡萄酒、果酒、日本米酒)和/或软饮料(例如果汁饮料)的质量控制和检查环境样品(例如，未经纯化的物料水)。

在啤酒和低麦芽啤酒的生产过程或其最终产品中可以发现作为引起品质劣变的酵母菌种的巴斯德酵母、酿酒酵母和贝酵母。因此，第一种实施方案的LAMP引物组和PCR引物组；第二种实施方案的LAMP引物组；第三种实施方案的LAMP引物组和PCR引物组；第四种实施方案的PCR引物组；和这些引物组的部分或全部的组合都可以优选地用于啤酒和低麦芽啤酒的质量控制。

在葡萄酒的生产过程或其最终产品中可以发现作为引起品质劣变的酵母菌种的酿酒酵母和贝酵母。因此，第二种实施方案的LAMP引物组；第三种实施方案的LAMP引物组；及其组合都可以优选地用于葡萄酒的质量控制。

在软饮料(特别是果汁饮料)的生产过程或其最终产品中可以发现作为引起品质劣变的酵母菌种的酿酒酵母和贝酵母。因此，第二种实施方案的LAMP引物组；第三种实施方案的LAMP引物组；及其组合都可以优选地用于软饮料(特别是果汁饮料)的质量控制。

通过LAMP方法的核酸扩增反应

根据本发明的LAMP引物组可以用作通过LAMP方法的核酸扩增反应的引物。根据本发明的引物组不仅也可以用作通过LAMP方法的核酸扩增反应的引物，还可以用作通过修饰的LAMP方法的核酸扩增反应的引物。所述LAMP方法和利用其的核酸扩增方法的原理是熟知的。为了通过LAMP方法进行核酸扩增反应，可以使用在WO00/28082和Notomi T.等人的Nucleic Acids Research，28(12)，e63(2000)中公开的说明作为参考。

可以使用市售可获得的LAMP方法基因扩增试剂盒进行通过LAMP方法的核酸扩增反应。例如，可以根据市售可获得的LAMP方法基因扩增试剂盒(例如，Eiken Chemical Co.Ltd.制造的LoopampDNA扩增试剂盒)所包括的使用说明，通过混合样品DNA、引物溶液及该试剂盒中的试剂进行核酸扩增反应，然后，将得到的混合物保持在某一温度下(60℃至65℃)下以便其反应一段时间(一般而言，1小时)。

通过LAMP方法进行的核酸扩增反应可以经由下述方法实现：

(i)与模板DNA互补的DNA链是在链取代类型DNA聚合酶的作用下，使用FIP的F2区域的3’末端作为起源合成的。

(ii)在链取代类型DNA聚合酶的作用下，使用其3’末端作为起源，使F3引物退火至FIP外部的位点，并且延伸了DNA合成，同时从该FIP分离之前合成的DNA链。

(iii)双链是由用F3引物和模板DNA合成的DNA链形成的。

(iv)将之前用FIP合成的DNA链与F3引物的DNA链分离，以便其变成单链DNA。然而，该DNA链具有在5’末端侧的互补区域F1c和F1，其引起自退火从而形成Loop。

(v)使BIP退火至在上述(iv)的过程中形成的DNA链，并且使用BIP的3’末端作为起源合成互补DNA。在该过程中，分离所述Loop并延伸。进一步，在链取代类型DNA聚合酶的作用下，使用其3’末端作为起源，使B3引物退火至BIP外部的位点，并且延伸了DNA合成，同时从该BIP分离之前合成的DNA链。

(vi)双链DNA是在上述(v)的过程中形成的。

(vii)因为在上述(v)的过程中用BIP合成的DNA链在两个末端都具有互补序列。其引起自退火形成Loop，从而其具有哑铃样结构。

(viii)使用具有哑铃样结构的前述DNA链作为起源，经由使FIP退火，然后使BIP退火来进行期望DNA的扩增周期。

通过合适的修饰前述过程的LAMP方法进行核酸扩增反应对本领域技术人员是显而易见的。根据本发明的引物组也可以用于这样的修饰方法。

根据本发明的LAMP引物组引起了在约60℃至约65℃(例如，65℃)的温度下合成DNA链，以及退火。经由退火反应和DNA链合成的反应进行约1小时，以便可以扩增核酸10⁹至10¹⁰倍。

如果在用于通过LAMP方法的核酸扩增反应的情况下，根据本发明的LAMP引物组能够与样品核酸反应，则作为检测目标的菌株的目标区域被扩增。当这样的扩增反应进行时，由于形成作为副产物的焦磷酸镁的影响，反应溶液变混浊。因此，基于浊度，可以目测确定存在或不存在扩增。还可以使用浊度测定装置通过光学测量浊度来确定存在或不存在扩增。可选地，可以采用琼脂糖凝胶电泳等证实和检测存在或不存在DNA片段。

如果观察到核酸扩增，其意味着存在目标碱基序列，表明作为引物组的检测目标的菌株为阳性(+)。相反，如果没有观察到核酸扩增，其意味着不存在目标碱基序列，表明作为引物组的检测目标的菌株为阴性的(-)。

通过LAMP方法的核酸扩增反应

根据本发明的PCR引物组用于鉴定酵母属的酵母菌，其使用了核酸扩增方法比如PCR方法、RT-PCR方法、实时PCR方法或原位PCR方法。

在PCR方法中，可以根据已知的方法比如琼脂糖凝胶电泳检测核酸扩增产物。另外，在实时PCR方法中，可以使用插入剂或荧光标记探针，在整合热循环仪与荧光分光光度计形成的装置中随时间检测这样的核酸扩增产物。

检测目标样品及其制备

用作根据本发明的引物组和试剂盒的检测目标的样品的实例包括：酒精饮料，比如啤酒、低麦芽啤酒和葡萄酒；软饮料，比如苹果汁、柠檬碳酸钠和碳酸水；环境样品，比如用作原料收集的水；和从酒精饮料、软饮料的生产方法收集的半成品等。

当这些产物用作用于LAMP方法或PCR方法的样品时，作为预处理，可以进行操作比如存在于样品中的细胞的浓缩、分离和培养、来自细胞的核酸的分离和该核酸的浓缩。用于浓缩和分离存在于样品中的细胞的方法包括过滤和离心，可以视情况而定选择这样的方法。另外，可以进一步培养从样品中浓缩和分离的细胞，以便增加细胞的数量。对于培养而言，可以使用适于增殖所述目标酵母菌株的琼脂固体培养基或液体培养基。而且，为了选择目标酵母菌株，可以加入试剂比如硫酸铜。为了从存在于饮料样品或环境样品中的细胞或培养细胞释放核酸，例如，可以选择使用市售可获得的试剂盒的方法或者用碱溶液处理细胞然后在100℃加热该细胞以从其中释放核酸的方法。而且，如果需要进一步纯化核酸，可以通过苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀、离心等纯化该核酸，最后将该纯化的核酸再溶于TE缓冲液等中，从而其可在试验中用作模板DNA(European Brewery Convention：ANALYTICA-MICROBIOLOGICA-EBC，第2版，2005，FachverlagHans Carl，Nuernberg；Rolf等人：PCR-Clinical diagnostics and research，Springer-Verlag，Berlin，1992；Yasuji Oshima等人，Tanpaku kakusankoso(Proteins，Nucleic acids，Enzymes)，Vol.35，2523-2541，1990).

使用根据本发明的引物组和试剂盒的检测酵母属的酵母菌可以例如按如下进行。

首先，在合适的培养基中培养据认为存在于样品中的酵母属的酵母菌。接着，从在琼脂培养基中形成的菌落分离DNA，然后，将使用根据本发明的引物组的LAMP方法或PCR方法应用于该DNA，从而扩增酵母属的酵母菌的特异性基因区域。基因扩增产物的存在表明存在作为所述引物组的目标的菌株。

实施例

在下文中，本发明将在下述实施例中具体描述。然而，这些实施例并不意味着限制本发明的范围。

实施例1：酵母属的酵母菌的检测

(a)基因组DNA提取方法

从培养基刮取在琼脂平板培养基上培养的细胞，然后将它们悬浮在灭菌蒸馏水中。离心(15,000rpm，5分钟)该悬浮物，然后弃去上清液。将灭菌蒸馏水加入到再次沉淀的细胞中，接着悬浮该混合溶液并离心。弃去上清液，然后将100μl的PrepMan Ultra(AppliedBiosystems制造)的溶液加入到得到的细胞中。在95℃下，加热该混合物10分钟。此后，以15,000rpm离心生成物1分钟，并且使用上清液作为基因组DNA溶液。另外，将100μl的0.1N NaOH溶液加入到洗涤的细胞中，然后在95℃下加热该混合物10分钟。此后，用1MTris缓冲液(pH7.0)中和生成物，并且使用上清液作为基因组DNA溶液。

(b)用于LAMP的引物

使用由Fujitsu System Solutions Ltd.制造的eGenome Order(http://genome.e-mp.jp/index.html)或与其相当的方法化学合成如下所述用于各种类型的酵母属的酵母菌株的引物，然后将它们溶于TE缓冲液(pH8.0)中，得到100μM的浓度。混合这些溶液，使得它们具有各自预定的浓度(FIP和BIP引物：16μM；F3和B3引物：2μM；LF和LB引物：8μM)，然后将它们稀释。

[用于检测底部发酵酵母菌(LGM1LB1)的引物组]

FIP：

CCTTCAGTGTTAAAGTCTGTGGGAAATGACTATCCGGGAAATACTATATGCC(SEQ ID NO：1)

F3：TCACCATCGACATGCTGTC(SEQ ID NO：2)

BIP：

TCAGCCCCAGAAGCAAACTATCCAAATTCCGCCTCTGAGACG(SEQ ID NO：3)

B3：CCATAGGAAATCACCGTACTTCG(SEQ ID NO：4)

LB：ATGTTTATAAGCCAGATGGATG(SEQ ID NO：5)

[用于检测酿酒酵母(SCM1LF2LB1)的引物组]

FIP：

GGCAGAACCTTGTGATTTTCTTCTACCAAAGTGGAACCTGCACATCG(SEQ ID NO：7)

F3：TGACAAGTACGATTATCTGGCC(SEQ ID NO：8)

BIP：

ACTGTCGATTATTGAAATAGACGAACTTAATGGAATACTGT

TTAACCTGCTCGAACG(SEQ ID NO：9)

B3：GTTGTATGGTACATTGTTTGCATCT(SEQ ID NO：10)

LF：CACTTATATGTAGCTCTTTGTAGGC(SEQ IDNO：11)

LB：AAAAATAAATCCATTGATCAATTGG(SEQ ID NO：12)

[用于检测贝酵母(SBR2LB1)的引物组]

FIP：

TCCCTCATTACCATCTTCATGAATATGCAACTGAAAATAAAAACCAGTTCGCC(SEQ ID NO：13)

F3：CCAGGCTCATAAAGGAAGCAA(SEQ ID NO：14)

BIP：

CCGCAAGGTGTTCAAGAAACCTTCACCTCTTGTTCTTCTGTGAG(SEQ ID NO：15)

B3：CTGCATCTGTTAAATCTTCATTTGG(SEQ ID NO：16)

LB：CAAATGGAGGAGGGGCAA(SEQ ID NO：17)

[用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母(SCC1LB1)的引物组]

FIP：

CCTCTTCCAGTTCTTGACTCTTTTCCTAAGATGAAAGTGCCGGGAGA(SEQ ID NO：18)

F3：ACGAAGATGAGAAAGAGGCG(SEQ ID NO：19)

BIP：

TGACAGCAAGGAGAAGAGCACCCCTCGTTGTTTTCCTCCTCA(SEQ ID NO：20)

B3：GTGCTGTATGCTCGTTTTCG(SEQ ID NO：21)

LB：GAGCAAGGGGACGAAGGTGA(SEQ ID NO：22)

(c)LAMP扩增反应溶液的制备

使用Eiken Chemical Co.，Ltd.制造的Loopamp DNA扩增试剂盒作为用于LAMP方法的基因扩增试剂盒。将2.5μl的基因组DNA溶液、2.5μl的引物溶液、12.5μl的2倍浓度反应缓冲液、1μl的Bst DNA聚合酶和6.5μl的灭菌水加入到反应管中，从而制备了总量为25μl的反应溶液。

(d)LAMP反应

使用Teramecs Co.，Ltd.制造的实时浊度计LA-200或者EikenChemical Co.，Ltd.制造的LA-320C用于LAMP反应。固定反应管，在65℃的恒温(阀帽(bonnet)：75℃)下使该反应溶液反应，每6秒测量反应期间浊度的变化。将其浊度增加的反应溶液定义为阳性，其浊度没有增加的反应溶液定义为阴性。

(e)评价用于各种类型的酵母菌株的引物的特异性

关于对于底部发酵酵母菌、酿酒酵母和贝酵母特异性的引物，其为用于前述酵母菌株已知制备的，通过LAMP方法，使用包括狭义酵母(Saccharomyces sensu stricto)的各个菌株的酵母属的标准酵母菌株来评价其特异性。因此，在引发下述反应之后60分钟内，观察随着DNA扩增的进展浊度的增加，所述反应为在巴斯德酵母(底部发酵酵母菌)中在使用LGM1LB1的情况下的反应，在酿酒酵母和酿酒酵母糖化变种中在使用SCM1LF2LB1的情况下的反应，在贝酵母中在使用SBR2LB1的情况下的反应，和在酿酒酵母和巴斯德酵母(底部发酵酵母菌)中在使用SCC1LB1的情况下的反应(表1)。而且，当引物与用作检测其目标的菌株反应时，在引发反应之后60分钟内出现扩增，并且反应管中的浊度增加(图1)。

表1：使用各种类型的酵母属的标准酵母菌株评价引物(该表的每种细胞数：直到进行扩增所需的反应时间；-：在反应之后80分钟内没有出现扩增；nt：没有试验)

[表1]

各种类型的酵母属标准酵母菌株	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1
各种类型的酵母属标准酵母菌株	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1	酿酒酵母NBRC10217	-	40分钟	-	20分钟
贝酵母NBRC11022	-	-	30分钟	-	酿酒酵母NBRC10217	-	40分钟	-	20分钟
贝酵母NBRC11022	-	-	30分钟	-	贝酵母NBRC1948	-	-	40分钟	-
贝酵母NBRC0615	-	-	40分钟	-	贝酵母NBRC1948	-	-	40分钟	-
贝酵母NBRC0615	-	-	40分钟	-	贝酵母NBRC10563	-	-	40分钟	-
巴斯德酵母NBRC11024	40分钟	-	-	20分钟	贝酵母NBRC10563	-	-	40分钟	-
巴斯德酵母NBRC11024	40分钟	-	-	20分钟	巴斯德酵母NBRC11023	40分钟	-	-	30分钟
巴斯德酵母NBRC10610	40分钟	-	-	30分钟	巴斯德酵母NBRC11023	40分钟	-	-	30分钟
巴斯德酵母NBRC10610	40分钟	-	-	30分钟	糖化酵母DSM70487	-	40分钟	-	20分钟
奇异酵母NBRC10609	-	-	-	-	糖化酵母DSM70487	-	40分钟	-	20分钟
奇异酵母NBRC10609	-	-	-	-	奇异酵母NBRC0259	-	-	-	-

奇异酵母NBRC10695	-	-	-	-
奇异酵母NBRC10695	-	-	-	-	卡里奥酵母NBRC10947	-	-	-	-
麦卡特酵母NBRC1815	-	-	-	-	卡里奥酵母NBRC10947	-	-	-	-
麦卡特酵母NBRC1815	-	-	-	-	库维酵母NBRC1802	-	-	-	-
少孢酵母NBRC1128	-	-	-	-	库维酵母NBRC1802	-	-	-	-
少孢酵母NBRC1128	-	-	-	-	斯维兹酵母NBRC1838	-	-	-	-
单孢酵母NBRC0316	-	-	-	-	斯维兹酵母NBRC1838	-	-	-	-
单孢酵母NBRC0316	-	-	-	-	大连酵母NBRC0211	-	-	-	-
克鲁弗酵母NBRC1685	-	-	-	-	大连酵母NBRC0211	-	-	-	-

而且，使用各种类型的标准酵母菌株、用于酿造的酵母菌株、在酿酒厂分离的野生型酵母菌株和从葡萄酒中分离的野生型酵母菌株来评价多种引物比如LGM1LB1、SCM1LF2LB1和SBR2LB1的特异性。因此，在与用于检测前述引物的目标不同的酵母菌株中几乎没有观察到扩增(表2、3和4)。

表2：使用各种类型的标准酵母菌株评价引物(该表的每种细胞数：直到进行扩增所需的反应时间；-：在反应之后80分钟内没有出现扩增)

[表2]

各种类型的标准酵母菌株	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1
各种类型的标准酵母菌株	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1	不规则毕赤氏酵母(Pichiaanomala)NBRC0127	-	-	-	-
土星拟威尔酵母(Williopsissaturnus)NBRC0941	-	-	-	-	不规则毕赤氏酵母(Pichiaanomala)NBRC0127	-	-	-	-
土星拟威尔酵母(Williopsissaturnus)NBRC0941	-	-	-	-	乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)NBRC1090	-	-	-	-
产朊假丝酵母(Candidautilis)NBRC0988	-	-	-	-	乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)NBRC1090	-	-	-	-
产朊假丝酵母(Candidautilis)NBRC0988	-	-	-	-	博伊丁假丝酵母(C.boidinii)ATCC48180	-	-	-	-

拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)NBRC1137	-	-	-	-
拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii)NBRC1137	-	-	-	-	不规则德克氏酵母(Dekkeraanomala)DSM70727	-	-	-	-
布鲁塞尔德克氏酵母(D.bruxellensis)DSM70001	-	-	-	-	不规则德克氏酵母(Dekkeraanomala)DSM70727	-	-	-	-
布鲁塞尔德克氏酵母(D.bruxellensis)DSM70001	-	-	-	-	布鲁塞尔德克氏酵母ATCC64276	-	-	-	-
卡斯特德克氏酵母(D.custersiana)DSM70736	-	-	-	-	布鲁塞尔德克氏酵母ATCC64276	-	-	-	-
卡斯特德克氏酵母(D.custersiana)DSM70736	-	-	-	-	纳登尼斯酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)NBRC1588	-	-	-	-

表3：使用各种类型的用于酿造的标准酵母菌株和在酿酒厂分离的野生型酵母菌株评价引物(该表的每种细胞数：直到进行扩增所需的反应时间；-：在反应之后80分钟内没有出现扩增)

[表3]

酿酒酵母，野生型啤酒酵母	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1
酿酒酵母，野生型啤酒酵母	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1	底部发酵酵母菌BFY61	40分钟	-	-	20分钟
底部发酵酵母菌BFY70	40分钟	-	-	20分钟	底部发酵酵母菌BFY61	40分钟	-	-	20分钟
底部发酵酵母菌BFY70	40分钟	-	-	20分钟	底部发酵酵母菌BFY84	40分钟	-	-	20分钟
底部发酵酵母菌BFY448	50分钟	-	-	20分钟	底部发酵酵母菌BFY84	40分钟	-	-	20分钟
底部发酵酵母菌BFY448	50分钟	-	-	20分钟	上面发酵酵母菌TFY3	-	40分钟	-	20分钟
上面发酵酵母菌TFY23	-	40分钟	-	20分钟	上面发酵酵母菌TFY3	-	40分钟	-	20分钟
上面发酵酵母菌TFY23	-	40分钟	-	20分钟	皮肤毛孢子菌WY54	-	-	-	-
中间型假丝酵母(C.intermedia)WY55-1	-	-	-	-	皮肤毛孢子菌WY54	-	-	-	-
中间型假丝酵母(C.intermedia)WY55-1	-	-	-	-	汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii)WY69	-	-	-	-

膜醭毕赤氏酵母(P.membranifaciens)WY75	-	-	-	-
膜醭毕赤氏酵母(P.membranifaciens)WY75	-	-	-	-	禾木科红酵母(Rhodotorulagraminis)WY93	-	-	-	-
布鲁塞尔德克氏酵母(D.bruxellensis)WY97	-	-	-	-	禾木科红酵母(Rhodotorulagraminis)WY93	-	-	-	-
布鲁塞尔德克氏酵母(D.bruxellensis)WY97	-	-	-	-	酿酒酵母WY101	-	40分钟	-	20分钟
糖化酵母WY126	-	50分钟	-	20分钟	酿酒酵母WY101	-	40分钟	-	20分钟

表4：使用从各种类型的葡萄酒中分离的野生型酵母菌株评价引物(该表的每种细胞数：直到进行扩增所需的反应时间；-：在反应之后80分钟内没有出现扩增)

[表4]

野生型葡萄酒酵母	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1
野生型葡萄酒酵母	LGM1LB1	SCM1LF2LB1	SBR2LB1	SCC1LB1	拜列氏接合糖酵母(Z.bailii)WLY9	-	-	-	-
酿酒酵母WLY10	-	40分钟	-	20分钟	拜列氏接合糖酵母(Z.bailii)WLY9	-	-	-	-
酿酒酵母WLY10	-	40分钟	-	20分钟	膜醭毕赤氏酵母WLY13	-	-	-	-
长孢路德酵母(Lodderomyceselongisporus)WLY14	-	-	-	-	膜醭毕赤氏酵母WLY13	-	-	-	-
长孢路德酵母(Lodderomyceselongisporus)WLY14	-	-	-	-	出芽短梗霉菌WLY15	-	-	-	-
河道红冬孢酵母(Rhodosporidium fluviale)WLY16	-	-	-	-	出芽短梗霉菌WLY15	-	-	-	-
河道红冬孢酵母(Rhodosporidium fluviale)WLY16	-	-	-	-	不规则毕赤氏酵母(P.anomala)WLY17	-	-	-	-
季也蒙毕赤氏酵母(P.guilliermondii)WLY18	-	-	-	-	不规则毕赤氏酵母(P.anomala)WLY17	-	-	-	-

上述结果证实本发明产生的用于各种类型的酵母属的酵母菌株的引物组可以以物种(species)水平精确地检测作为检测目标的酵母属的酵母菌。根据上述报告，在许多情况下，使用相同的引物从酵母菌扩增基因片段，并且使用卵裂型限制性内切酶DGGE等分析碱基序列的不同。然而，使用根据本发明的引物可以仅仅通过证实存在或不存在基因扩增来鉴定和检测属于酵母属的3种酵母菌株。

实施例2：LAMP方法的检出限

为了分析所述LAMP方法的扩增功效，以逐步方式用灭菌水稀释已培养在琼脂平板培养基上的底部发酵酵母菌(BFY70，巴斯德酵母)、酿酒酵母NBRC10217和贝酵母NBRC1948的细胞，然后，通过前述方法提取DNA。对提取的DNA进行所述LAMP方法。结果，在所述LAMP方法的情况下，甚至观察到少量细胞比如10²至10³cfu水平的扩增。

另外，当使用在各个稀释步骤中从稀释的细胞溶液中提取的基因组DNA时，将在所述LAMP反应中浊度超过0.1的时间定义为检测时间，根据各个引物的检测时间的对数和菌落形成数形成图表。作为指数近似的结果，可以形成高相关系数的近似曲线(R²＝0.98-0.99)。LGM1LB1的近似曲线如图2中所示。而且，各个引物的检出限和校正曲线相关系数之间的关系如下所述。据证实，通过形成这样的校正曲线，可以在10²至10⁷cfu或者10³至10⁷cfu.的范围内定量地测定包含在样品中的酵母属的酵母菌的存在。

[各个引物的检出限和校正曲线的相关系数]

检出限校正曲线校正曲线

近似表达式相关系数(R²)

LGM1LB1 5.2×10²cfu y＝28179x^-2.4039 0.992

SCM1LF2LB1 4.4×10³cfu y＝6875x^-1.8959 0.981

SBR2LB1 1.9×10²cfu y＝1431.3x^-1.8361 0.982

实施例3：葡萄酒和啤酒中细胞的检测

一般而言，在葡萄酒的生产中，将大量酵母属的酵母菌用作葡萄酒酵母加入果汁中用于发酵。来自外部污染果汁的酵母细胞的数量显著地小于酵母属酵母菌的数量。因此，将大量酿酒酵母悬浮在葡萄酒中，此后，将如通过稀释葡萄酒制备的贝酵母NBRC1948的细胞稀溶液与其混合，接着收集细胞并洗涤。此后，收集细胞，然后从其中提取DNA。使用SBR2LB1作为引物组，进行LAMP方法，如此，分析检测贝酵母的可能性。结果，据发现不考虑葡萄酒对反应的抑制和存在的酿酒酵母，可以以几乎与在将其悬浮在灭菌水中的情况下相同的检出限检测贝酵母。而且，即使在其中将底部发酵酵母菌悬浮在啤酒中和其中将贝酵母的细胞稀溶液与其混合的情况下，获得相同的结果。

贝酵母的检出限

葡萄酒+酿酒酵母(5×10⁷个细胞) 3.9×10²cfu

啤酒+底部发酵酵母菌(1×10⁷个细胞) 3.2×10²cfu

实施例4：在专利出版物中描述的引物的评价

(a)在专利出版物中描述的引物

与在实施例1(b)中相同的方法，使用如下所述用于检测酵母属(SSC1LB1)的引物组和用于检测底部发酵酵母菌(SBFY1LF1LB1)的引物组，其已经描述在Tsuchiya等人的专利出版物(WO2005/093059)中，制备用于所述LAMP方法的引物溶液。用于检测酵母属(SSC1LB1)的引物组靶向rRNA基因的D2区域，而用于检测底部发酵酵母菌(SBFY1LF1LB1)的引物组靶向蜜二糖酶基因。

[用于检测酵母属(SCC1LB1)的引物组]

FIP：TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC(SEQ ID NO：31)

F3：AGACCGATAGCGAACAAGTA(SEQ ID NO：32)

BIP：

CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG(SEQ ID NO：33)

B3：CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC(SEQ ID NO：34)

LB：CAAGGATGCTGGCATAATGGTT(SEQ ID NO：35)

[用于检测底部发酵酵母菌(SBFY1LF1LB1)的引物组]

FIP：

GCAATTGCTCACTGACGTCGCACACCCCTCAAATGGGTTGG(SEQ ID NO：36)

F3：CCGAGTTACAATGGCCTTGG(SEQ ID NO：37)

BIP：

ACCGCTGACCGGATTTCTGAAAACTAGACCAGCAGTCATCCA(SEQ ID NO：38)

B3：CCTTGTCTGCAACGAGTGT(SEQ ID NO：39)

LF：GGCAAATGTGTTCCAATTGTC(SEQ ID NO：40)

LB：GGACTAAAGGATTTGGGTTACAC(SEQ ID NO：41)

根据实施例1(c)和(d)的说明，使用前述引物组，通过LAMP方法检测各种类型的菌株。结果显示在图3和4中。

(b)引物的评价

结果，据发现SSC1LB1与几乎所有检验的酵母属酵母菌的细胞菌株反应，因此，其不能用于鉴定酵母属的酵母菌。另外，SBFY1LF1LB1与贝酵母以及底部发酵酵母菌反应。已经根据底部发酵酵母菌的蜜二糖酶基因设计了这样的SBFY1LF1LB1。因为在用于设计引物组的区域中存在与贝酵母的基因组显示出96％同源性的碱基序列，据认为发生了交叉反应。

实施例3：使用Sc型-Lg型染色体易位区域评价PCR引物

如上所述，用在右臂GPH1的ORF至QCR2的ORF的区域内的Lg型染色体易位底部发酵酵母菌的Sc型染色体XVI。用来自右臂的MAT基因座至其末端的Sc型染色体易位这样的底部发酵酵母菌的Lg型染色体III。而且，用来自左臂KEM1基因ORF至其末端的Sc型染色体易位底部发酵酵母菌的Lg型染色体VII。根据所述Sc型染色体一侧的碱基序列和所述Lg型染色体一侧的碱基序列设计用于PCR方法的引物，使得底部发酵酵母菌的染色体III、染色体VII和染色体XVI的染色体易位位点可以侧面与其相接。使用各种类型的酵母属的酵母菌评价引物。

使用Takara Bio Inc.制造的Ex Taq用于所述PCR方法。用于所述PCR的引物的碱基序列如下。

[用于染色体III易位区域的引物组(扩增产物：约3.2kb)]

IIIjunc1(Lg型侧)：TGTTGGGGTGTACTATGGTCTTT(SEQ IDNO：23)

IIIjunc2(Sc型侧)：ACAAAGAATGATGCTAAGAATTGA(SEQID NO：24)

[用于染色体VII易位区域的引物组(扩增产物：约350bp)]

VIISL1(Lg型侧)：CGACTCAAACTGTATTACTCC(SEQ ID NO：25)

VIISL2(Sc型侧)：AATTTTGATGTTCAAGCG(SEQ ID NO：26)

[用于染色体XVI易位区域的引物组(扩增产物：XVISL1-2，约720bp；XVISL3-4，约630bp)]

XVISL1(Lg型侧)：CGACAGAGTTGACCAGTTTG(SEQ ID NO：27)

XVISL2(Sc型侧)：GTTCTTCTTGCAAGATGTGG(SEQ ID NO：28)

XVISL3(Lg型侧)：CCTTGGCAGATGTGTTGTAT(SEQ ID NO：29)

XVISL4(Sc型侧)：CTTGCCCTTCTTCAAATCCG(SEQ ID NO：30)

根据Takara Bio Inc.制造的Ex Taq的使用说明将这些试剂彼此混合(总量：15μl)，然后，将该混合物置入热循环仪中。重复94℃-30秒、55℃-30秒和72℃-1分钟的温度方案(在用于染色体III易位区域的引物组的情况下，72℃-2分钟)30次，以便进行PCR反应。结果，当使用各个PCR引物组用于底部发酵酵母菌时，出现具有推定分子量的条带。存在或不存在扩增产品如显示在表5中。

表5：使用各种类型的酵母属的酵母菌株评价引物(+：存在扩增； -：不存在扩增)

[表5]

	IIIjunc1-2	VIISL1-2	XVISL1-2	XVISL3-4
	IIIjunc1-2	VIISL1-2	XVISL1-2	XVISL3-4	底部发酵酵母菌BFY70	+	+	+	+
底部发酵酵母菌BFY84	+	+	+	+	底部发酵酵母菌BFY70	+	+	+	+
底部发酵酵母菌BFY84	+	+	+	+	底部发酵酵母菌BFY85	+	+	+	+
底部发酵酵母菌W34/70	+	+	+	+	底部发酵酵母菌BFY85	+	+	+	+
底部发酵酵母菌W34/70	+	+	+	+	底部发酵酵母菌BFY427	+	+	+	+
底部发酵酵母菌BFY253	+	+	+	+	底部发酵酵母菌BFY427	+	+	+	+
底部发酵酵母菌BFY253	+	+	+	+	酿酒酵母S288C	-	-	-	-
贝酵母NBRC11022	-	-	-	-	酿酒酵母S288C	-	-	-	-

序列表

<110>Kirin Beer Kabushiki Kaisha

<120>用于检测酵母菌属酵母菌的引物组

<130>166765

<150>JP 274166/2006

<151>2006-10-05

<150>JP 329377/2006

<151>2006-12-05

<160>41

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(LGM1LB1)

<400>1

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(LGM1LB1)

<400>2

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(LGM1LB1)

<400>3

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(LGM1LB1)

<400>4

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(LGM1LB1)

<400>5

<210>6

<211>785

<212>DNA

<213>巴斯德酵母

<400>6

<210>7

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>7

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>8

<210>9

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>9

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>10

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>11

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCM1LF2LB1)

<400>12

<210>13

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBR2LB1)

<400>13

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBR2LB1)

<400>14

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBR2LB1)

<400>15

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBR2LB1)

<400>16

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBR2LB1)

<400>17

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCC1LB1)

<400>18

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCC1LB1)

<400>19

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCC1LB1)

<400>20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCC1LB1)

<400>21

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SCC1LB1)

<400>22

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>23

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>24

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>25

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>26

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>27

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>28

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>29

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物序列

<400>30

<210>31

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SSC1LB1)

<400>31

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SSC1LB1)

<400>32

<210>33

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SSC1LB1)

<400>33

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SSC1LB1)

400>34

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SSC1LB1)

<400>35

<210>36

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>36

<210>37

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>37

<210>38

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>38

<210>39

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>39

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>40

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>LAMP引物序列(SBFY1LF1LB1)

<400>41

Claims

1.一种用于检测巴斯德酵母的探针或引物，其由由至少10个碱基组成的多核苷酸组成，所述多核苷酸与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交；或者由至少10个碱基组成的多核苷酸组成，所述多核苷酸与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

2.一种用于检测巴斯德酵母的LAMP引物组，其由两个或多个类型的根据权利要求1的引物组成。

3.根据权利要求2的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

4.根据权利要求3的LAMP引物组，其进一步包括具有SEQ IDNO：5碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

5.一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其由两个或多个类型的根据权利要求1的引物组成。

6.一种用于检测酿酒酵母的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

7.根据权利要求6的LAMP引物组，其进一步包括下述多核苷酸中的任一个或两个：

具有SEQ ID NO：11碱基序列的多核苷酸(LF)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：12碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

8.一种用于检测贝酵母的LAMP引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：16碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

9.根据权利要求8的引物组，其进一步包括具有SEQ ID NO：17碱基序列的多核苷酸(LB)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

10.一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：23碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：24碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

11.一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：25碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：26碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

12.一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：27碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：28碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

13.一种用于检测巴斯德酵母的PCR引物组，其包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：29碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交；和

具有SEQ ID NO：30碱基序列的多核苷酸，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

14.根据权利要求1的探针或引物，其中由至少10个碱基组成的与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，和由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸分别包括与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的至少10个邻接核苷酸和SEQ ID NO：6碱基序列的至少10个邻接核苷酸。

15.根据权利要求1的探针或引物，其中由至少10个碱基组成的与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，和由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸分别为与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列具有至少90％同一性的多核苷酸和与SEQ ID NO：6碱基序列具有至少90％同一性的多核苷酸。

16.根据权利要求1的探针或引物，其中由至少10个碱基组成的与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，和由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸分别为由如下修饰的碱基序列组成的多核苷酸：其中在与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列中一个或几个核苷酸被修饰并且与具有SEQ ID NO：6碱基序列的多核苷酸杂交，和由如下修饰的碱基序列组成的多核苷酸：其中在SEQ ID NO：6碱基序列中一个或几个核苷酸被修饰并且与具有与SEQ ID NO：6碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

17.根据权利要求3、4和6-13中任一项的引物组，其中由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：1至5、7至17或23至30碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸包括相应碱基序列的至少10个邻接核苷酸。

18.根据权利要求3、4和6-13中任一项的引物组，其中由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：1至5、7至17或23至30碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸为与相应碱基序列具有至少90％同一性的多核苷酸。

19.根据权利要求3、4和6-13中任一项的引物组，其中由至少10个碱基组成的与具有与SEQ ID NO：1至5、7至17或23至30碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交的多核苷酸为由如下修饰的碱基序列组成的多核苷酸，其中在相应碱基序列一个或几个核苷酸被修饰，并且与具有与相应碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

20.一种用于检测巴斯德酵母的试剂盒，其包括根据权利要求2至4中任一项的引物组与用于检测贝酵母的LAMP引物组的组合。

21.根据权利要求20的试剂盒，其中所述用于检测贝酵母的LAMP引物组为根据权利要求8或9的LAMP引物组。

22.一种用于检测巴斯德酵母的试剂盒，其包括根据权利要求2至4中任一项的LAMP引物组与用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组的组合。

23.根据权利要求22的检测试剂盒，其中所述用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组包括下述多核苷酸：

具有SEQ ID NO：21碱基序列的多核苷酸(B3)，或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

24.根据权利要求23的检测试剂盒，其进一步包括作为用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物的具有SEQ ID NO：22碱基序列的多核苷酸(LB)或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

25.一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过LAMP方法进行核酸扩增反应，所述LAMP方法使用根据权利要求2至4中任一项的引物组。

26.根据权利要求25的检测方法，其进一步包括通过LAMP方法进行核酸扩增反应，所述LAMP方法使用用于检测贝酵母的LAMP引物组。

27.根据权利要求26的检测方法，其中所述用于检测贝酵母的LAMP引物组为根据权利要求8或9的LAMP引物组。

28.根据权利要求25的检测方法，其进一步包括通过LAMP方法进行核酸扩增反应，所述LAMP方法使用用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组。

29.根据权利要求28的检测方法，其中所述用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物组包括下述多核苷酸：

30.根据权利要求29的检测方法，其进一步包括作为用于检测酿酒酵母和巴斯德酵母的LAMP引物的具有SEQ ID NO：22碱基序列的多核苷酸(LB)或者由至少10个碱基组成的多核苷酸，所述多核苷酸与具有与所述碱基序列互补的序列的多核苷酸杂交。

31.一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括通过PCR方法进行核酸扩增反应，所述PCR方法使用根据权利要求5的PCR引物组或根据权利要求10至13中任一项的PCR引物组。

32.一种用于检测巴斯德酵母的方法，其包括使用根据权利要求1的探针检测杂交复合物。

33.一种用于检测酿酒酵母的方法，其包括通过LAMP方法进行核酸扩增反应，所述LAMP方法使用根据权利要求6或7的LAMP引物组。

34.一种用于检测贝酵母的方法，其包括通过LAMP方法进行核酸扩增反应，所述LAMP方法使用根据权利要求8或9的LAMP引物组。