CN112041441A - 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种耳念珠菌的检测方法，其是对由检测体得到的核酸试样进行根据LAMP法的核酸扩增反应并检测扩增产物的耳念珠菌的检测方法，其中，LAMP法中引物组中的FIP是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，BIP是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，F3是由序列号3构成的多核苷酸，B3是由序列号4构成的多核苷酸。

Description

耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的 检测方法

技术领域

本发明涉及耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法。

背景技术

耳念珠菌(Candida auris)是2005年在东京首次发现的，由本发明人等作为新品种报道的病原酵母(非专利文献1)。

直到2017年8月，在日本发现的耳念珠菌(Candida auris)是从局部感染部位(外耳道)培养得到的，具有较低的致病性。另外，虽然对一部分抗真菌药(氟康唑)表现出略低的敏感性，但也只不过是一株非耐药菌。

但是，之后，随着其传播到世界各地，包括韩国、印度、南非、委内瑞拉、英国、美国，报道了产生败血症等的强毒化的多药耐药菌株，结果，直至2016年为止，其被认为是世界上第一个作为真菌的全球流行(流行病)的致病菌(非专利文献2)。在2017年5月17日的最新报道中，美国已经有122人(上一年为7人)感染了耳念珠菌(Candida auris)，报道了其高致命率。另外，在英国耳念珠菌(Candida auris)也在不断扩散，感染者已经达到200人，被报道为“日本真菌”，引起医疗机构的注意。

目前，耳念珠菌(Candida auris)的感染仅限于易感染患者，以医院感染的形式爆发，但鉴于日本以外的流行情况，本发明人等认为像最初报道的第1例那样健康人成为载体而通过鼻腔、外耳道等扩散医院感染的可能性高。事实上，在已经处于该菌感染流行下的美国，该菌的感染容易经由医护人员的手指等的皮肤扩大(非专利文献3)。因此，以盛行的国际交流和东京奥运会等为契机，日本以外的强毒耐性化的菌被带入日本的可能性很高，用于防止有害真菌的输出和输入的检查体制的维护是燃眉之急。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Satoh K,Makimura K,Hasumi Y,Nishiyama Y,Uchida K,Yamaguchi H.2009.Candida auris sp.nov.,a novel ascomycetous yeast isolatedfrom the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital.MicrobiolImmunol 53:41-44.https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.2008.00083.x。

非专利文献2：美国疾病管理中心(CDC)网站、Tracking Candida auris https://www.cdc.gov/fungal/diseases/candidiasis/tracking-c-auris.html(2018年4月22日接续)。

非专利文献3：Shawn R.Lockhart,Elizabeth L.Berkow,Nancy Chow,RoryM.Welsh,Candida auris for the Clinical Microbiology Laboratory:Not YourGrandfather＇s Candida Species,ClinicalMicrobiology Newsletter,Volume 39,Issue13,2017,Pages 99-103,ISSN 0196-4399,https://doi.org/10.1016/j.clinmicnews.2017.06.003.

(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0196439917300417)。

非专利文献4：Nakayama T,Yamazaki T,Yo A,Tone K,Mahdi AlshahniM,Fujisaki R,Makimura K.2017.Detection of fungi from an indoor environmentusing loop-mediated isothermal amplification(LAMP)method.Biocontrol Sci22:97-104.https://doi.org/10.4265/bio.22.97。

非专利文献5：Shigekazu Iguchi,Ryo Mizushima,Keisuke Kamada,YasutomoItakura,Atsushi Yoshida,Yutaka Uzawa,Yuko Arai,Miyako Takaoka,SumieSato,AekoGoto,Toshiko Karasawa,Naoki Tsuruoka,Daisuke Totsuka,Erika Ono,Manabu Nonaka,Koichi Makimura,Ken Kikuchi:The Second Candida auris Isolate from AuralDischarge in Japan.Jpn J Infect Dis.2018Mar22；71(2)：174-175.doi:10.7883/yoken.JJID.2017.466.Epub 2018Feb 28。

发明内容

发明要解决的课题

然而，耳念珠菌(Candida auris)是新品种的病原真菌(酵母)，例如，通过像VITEK2 YST card(生物梅里埃公司(bioMerieux)，法国的马西伊特莱尔(Maracy I＇Etoile))、API20C AUX(生物梅里埃公司)那样的临床检查室中通常使用的自动识别系统，不能区分近缘种(希木龙假丝酵母(Candida haemulonii)、黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)等)，不能正确地判定菌种。因此，在诊断/治疗、临床检查、医院感染对策、流行病学解析等中，建立高灵敏度且特异性地检测(鉴定)耳念珠菌(Candida auris)的方法成为重大课题。进一步，为了使对耳念珠菌(Candida auris)的传染病的治疗有效并且抑制感染扩大，除了检测精度高以外，能够迅速地检测也是必须的。

本发明是鉴于以上情况而完成的，其课题在于提供能够迅速且正确地检测耳念珠菌(Candida auris)的检测方法。另外，其课题在于提供用于该检测方法的引物组以及检测试剂盒。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本发明的耳念珠菌检测用引物组是通过LAMP法(环介导等温扩增反应法)对检测体中的耳念珠菌的目标序列进行扩增并检测时使用的包括由FIP、BIP、F3以及B3构成的4种引物的耳念珠菌检测用引物组，其特征在于，FIP是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，BIP是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，F3是由序列号3构成的多核苷酸，B3是由序列号4构成的多核苷酸。

在该耳念珠菌检测用引物组中，优选的是，FIP是由序列号1构成的多核苷酸，BIP是由序列号2构成的多核苷酸。

在该耳念珠菌检测用引物组中，更优选的是，还包括作为环引物的序列号5、6的多核苷酸。

本发明的耳念珠菌检测试剂盒包括所述耳念珠菌检测用引物组。

本发明的耳念珠菌的检测方法是对由检测体得到的核酸试样进行根据LAMP法的核酸扩增反应并检测扩增产物的耳念珠菌的检测方法，其特征在于，LAMP法中的引物组包括由FIP、BIP、F3以及B3构成的4种引物，FIP是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，BIP是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，F3是由序列号3构成的多核苷酸，B3是由序列号4构成的多核苷酸。

在该耳念珠菌的检测方法中，优选的是，FIP是由序列号1构成的多核苷酸，BIP是由序列号2构成的多核苷酸。

在该耳念珠菌的检测方法中，更优选所述引物组还包括作为环引物的序列号5、6的多核苷酸。

发明的效果

根据本发明的耳念珠菌的检测方法，能够迅速且准确地检测耳念珠菌。本发明的引物和检测试剂盒用于本发明的耳念珠菌的检测方法。

附图说明

图1是使用包括耳念珠菌(Candida auris)特异性的DNA片段的pTAC-2Auris质粒并用每个检测反应的质粒拷贝数(拷贝数/反应)表示根据使用LAMP Auris引物组(LAMP耳念珠菌引物组)的本发明的检测方法检测扩增产物的结果的图。A：阴性对照(无反应)，B：2×10⁰拷贝数/反应(34分钟)，C：2×10¹拷贝数/反应(33分钟)，D：2×10²拷贝数/反应(26分钟)，E：2×10³拷贝数/反应(24分钟)，F：2×10⁴拷贝数/反应(24分钟)，G：2×10⁶拷贝数/反应(22分钟)，H：2×10⁸拷贝数/反应(17分钟)。

图2是表示根据本发明的检测方法检测临床检测体中的耳念珠菌(C.auris)的结果的图。

图3是表示根据本发明的检测方法检测环境样品中的耳念珠菌(C.auris)的结果的图。

具体实施方式

本发明人等着眼于作为用于迅速、特异性且高灵敏度地检测耳念珠菌(Candidaauris)的手段的LAMP法。然后，成功地设计了4种用于通过LAMP法特异性地对耳念珠菌(Candida auris)的目标DNA进行扩增的引物和2种用于使基因扩增加速的环引物，从而完成了本发明。

LAMP法是以往已知的，是使用从靶基因的序列中选择6个区域组合而成的4种引物，利用链置换反应进行扩增的方法。

LAMP法中的引物的设计是在作为扩增对象的区域(在本发明中，有时也称为“模板(核苷酸、DNA)”)中，从5’侧开始，利用F3区域、F2区域、F1区域、B1区域、B2区域、B3区域6个区域实施。在这6个区域中互补的区域分别表示为F3c区域、F2c区域、F1c区域、B1c区域、B2c区域、B3c区域。在LAMP法中，使用4种引物(2种内引物(FIP和BIP)以及2种外引物(F3引物和B3引物)。内引物是通过连结F1c(与F1区域互补的区域)区域和F2区域、B1c(与B1区域互补的区域)区域和B2区域而构成的。一般来说，与PCR法相比，LAMP法具有不需要从单链到双链的改性反应而在60～65℃的恒温条件下进行反应的特征，不需要像热循环仪那样的设备，另外，还具有扩增速度快、特异性也高的特征。

另外，使用环引物的LAMP法也是以往已知的。环引物通常被设计为具有与LAMP法扩增产物的哑铃结构的5’末端侧的环的单链部分(B1区域与B2区域之间，或者F1区域与F2区域之间)互补的序列。分别称为环引物B(LB)、环引物F(LF)。通过使用环引物，能够增加DNA合成的起点，因此能够使基因扩增加速。

在本发明的耳念珠菌的检测方法中，作为检测对象的检测体能够使用从受试者采取的临床检测体(例如血液、组织、腹水、支气管肺泡灌洗液及皮肤/粘膜/外耳道拭液等)或培养菌体等材料。这些检测体能够进行菌体的浓缩、分离、从菌体中分离核酸、浓缩等作为根据LAMP法的扩增反应的前处理。

试样核酸能够按照公知的方法由作为检测对象的检测体准备。准备试样核酸的方法能够使用以往公知的方法，例如，能够举例化学溶菌(蛋白酶K等)处理、物理破碎(珠破碎等)处理、碱溶解的方法、使用苯酚/氯仿提取、磁珠、二氧化硅膜等纯化核酸的方法等(非专利文献4)。另外，也能够适当利用市售的核酸提取试剂盒(例如，钟化株式会社(株式会社カネカ)制；Kanaka简易DNA提取试剂盒第2版等)。

本发明的检测方法中使用的引物组(耳念珠菌检测用引物组)包括4种引物(FIP、BIP、F3、B3)以及根据需要的环引物(环-B、环-F)。

引物(FIP、BIP、F3、B3)和环引物(环-B、环-F)包括由以下的多核苷酸构成的序列。根据本发明人等的认识，该引物(FIP、BIP、F3、B3)和环引物(环-B、环-F)是基于适于LAMP法的耳念珠菌(Candida auris)的特异性碱基序列(目标序列)设计的。

下面，示出了本发明的引物组的优选的实施方式。

(耳念珠菌检测用引物组)

FIP：AGGCTACTGAGCTTGCTGGTGTAACCAAACCAACAGGAGAGG(序列号1)

BIP：ACGGTTTCAGGGTTAGCATGGCTCAACAAAGTCGCTGGTACA(序列号2)

F3：GGGAAAGGAACCCTGACCT(序列号3)

B3：GGACACAGCATTCGAAGTGT(序列号4)

环-F：CATCTCGAAGGCCTCGGT(序列号5)

环-B：CACATACTCGAACGGAGTC(序列号6)

在不阻碍根据LAMP法特异性检测耳念珠菌(Candida auris)的范围内，在本发明的引物组中还可以包括进行上述序列中的碱基的置换、缺失、序列长度的变更等设计变更的引物。特别是，FIP和BIP引物对于其中央部的大致10个碱基容许任意的序列，还可以包括插入1个碱基至200个碱基左右的任意的序列。另外，环-F和环B引物只要具有与LAMP法的扩增产物的哑铃结构的5’末端侧的环的单链部分(B1区域与B2区域之间，或者F1区域与F2区域之间)互补且与该区域特异性的序列，就能发挥作用，因此，该序列并不限定于序列号5或6。

即，在本发明的引物组中，FIP只要是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸即可，另外，BIP只要是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸即可。

在本发明的检测方法中，使用上述引物(FIP、BIP、F3、B3)以及根据需要的环引物(环-B、环-F)，对检测体的核酸试样进行根据LAMP法的核酸扩增反应，检测扩增产物。

对通过LAMP法使核酸试样的目标序列扩增的条件没有特别的限定，能够适当设定。具体而言，作为根据LAMP法的核酸扩增反应的温度，例如能够举例约50℃～约65℃的范围，作为反应时间，例如能够举例20分钟～60分钟的范围。

另外，在用于本发明的检测方法的耳念珠菌检测试剂盒中，除了上述引物组以外，还能够包括聚合酶、缓冲液、dNTPs、MgSO₄等作为使试样核酸扩增时使用的试剂。在本发明的检测方法中使用的试剂的浓度等能够根据反应容量、反应时间等适当制备。另外，使试样核酸扩增时使用的聚合酶能够适当使用公知的聚合酶。例如，能够使用Bst DNA聚合酶(荣研化学公司制)、Csa DNA聚合酶(日本基因株式会社(ニッポンジーン社)制)等。

另外，在该检测试剂盒中，引物组和其他试剂可以单独容纳，也可以将其一部分形成混合物。另外，引物组由4种引物和环引物构成，这些引物可以分别单独容纳，也可以将其一部分形成混合物。

进一步，在本发明的检测方法中，在根据LAMP法的扩增产物的检测中，能够适当采用公知的方法。例如，对于扩增产物，能够举例用肉眼观察反应液的白色混浊的方法、用分光光度计测定反应液的白色混浊的方法、荧光目视检测的方法、使用特异性地识别扩增的碱基序列的标记寡核苷酸、荧光性嵌入剂的方法等。另外，将反应结束后的反应液直接进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，通过紫外线照射也能够确认扩增产物特异性的梯形泳动图像。

另外，在本发明的检测方法中，在根据LAMP法的扩增产物的检测中，不仅包括仅检测有无扩增产物，还可以包括测定扩增产物的量等。

在本发明的检测方法中，使用包括上述引物组的检测试剂盒，对检测体的核酸试样进行根据LAMP法的核酸扩增反应，检测扩增产物。引物组是以耳念珠菌(Candida auris)的特异性碱基序列为目标而设计的。

在本发明的检测方法中，能够特异性且高灵敏度地检测耳念珠菌(Candidaauris)而不检测近缘种，因此，例如即使是混入了各种微生物的检测体(污染临床检测体或环境检测体)，也能够准确地检测耳念珠菌(Candida auris)。另外，在本发明的检测方法中，检测所需的时间也短(20分钟～60分钟左右)，能够进行迅速的检测。

本发明的耳念珠菌的检测方法、引物组和检测试剂盒不限于上述实施方式。

实施例

下面，通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

＜实施例1＞LAMP Auris引物组的设计

为了设计LAMP法中使用的引物组，使耳念珠菌(PRJNA342691)、热带假丝酵母(GCF_000006335.2)、白色念珠菌(GCA_000182965.3)以及葡萄牙假丝酵母(LYUB00000000.2)4个念珠菌种的基因组序列排列，使用Mauve(版本20150226)比较，通过检索与其他念珠菌种同源性低的序列，得到大致几百个碱基序列。

这几百个碱基序列中的大部分序列不适于引物设计，但根据基于本发明人等的经验的认识筛选了被认为能够设计LAMP引物组的4种碱基序列(候选序列)(序列号7-10)。

(序列号7)

CACTACAGCAGGATCAACGGATGCTTCATACTCTGAAATCACCTTTAATGCTGGGATTGGCGCCCACACAAAGTTGGCTG

GGTGGACAAACTCCTCCACAGAAACAGAACCGAAACGGCCAGCGAGGAACAACGAAGCAGCAACGTCAGCCTTCAAGGTT

GAGCCAGCATCCGAAGATACCACAACAACCTTGCGTGCAGACGAAGGCACAGAAGCCACGAAGTGTTCTTGAGCAAATGG

GAAAGGAACCCTGACCTTAACCAAACCAACAGGAGAGGAAACCGAGGCCTTGGAGATGACACCAGCAAGCTCAGTAGCCT

GGTGAGCACCAAAAGCGACAAAAACAGTTTCAGGGTTAGCATGGCCCACATACTCGAACGGAGTCAAATTTGTACCAGCG

ACTTTGTTGAACACTTCGAATGCTGTGTCCACTGCCTTTTCCAAAGAATAGTCGCCGTCGGGAATCGAAGACACCAATTG

CTGGTATAAGCGGCCCACATCGGTCACAGACAAGATGTCATCGAACTTGGAGATCGCTTTAGCAAACTCAGGACCGTCGA

AAACGTGCAAGGCTGGTCCCTGAAGCAAAGTAGCCACAAAGTGAGTGAAGATGGTGATGTACTGCAACTCCACGGCGCTC

TGCGAGTCCGCCGGGGCCACCACAGGGATACCCGTGGAGCGAGCAGTTGCCAAAGGAGTCGTATAGTTTGAAACCAACGA

GTTTGTTTCCACATCAAAGTCGATAGCGGAAACGTTCAAGGTCAATGGCAATTTTGCAGCCTTGGCCAAAGTGGGCTGCA

TCCATGGCAAGGCGTTGGCGCCCAACACAGCAGTATGTGGTCCAGTGGAGGACACGTTGCTAGCGGCATAGC

(序列号8)

AGTAAGAGCTGCGGTCATCAAGCTCAACATCTTCATCGTCTATCGCCGACAGAGACGCCTCCATTT

GGTTTTTTCTTGTT

AAATTGTCCACCGACAAAGGCTGGTGGCCTGAAGTCTCCGCAGAGTCTGCCATAAAGTTTGAGCAATTGTAGATGTTGTA

GGTTTTTTTTGCAAGTGTTATCGGCGTCCGAAGTTGAAGTGTGACGGGCGCGCAGGAAGGTCAGAAAGCAGCAAGGAAAC

GGCCAAAGGTACCAGATAGAAGAAACGGTCTGTTGGGGCTGATTTTGTAGAAACTGATGTTTAATTCACATTTTCTTCAC

CCGTGGGGGTTCGTTGGGAACCGTCACGAGGCACGTTTGTTGTGGGGCACGTGTGGTTGCAAAATGAGATAAGCAAGGTA

GTGTGGTTTGACAGCTTCATATAGGAAGGTGCAAAAAAGTGCAAAGAGAGAAGAATGTAAATTGAAATTGTAATATTCCA

ATGAGTGAAGTGCTAATTTTGGAAATCTGAGCTTTTTAATGTCTACTCAACTTTGATGTTTCAGTGGATGAAGCCTGTTT

GGCGTAAAGTCCACAGGTTTTCGGAGTTTTGGCGAGCATCGACACATAACAAGGCAACAATGCAAAGTCACGAAAATCTC

GAACAATGGCGAGTCGTAAATTGGGTCTCTGATTTTCCTAGCGTGAATTGAACAGAAACAGTCCAAGTCCATGCTTGCAT

TCAGTCACTTGTTTTGAGATGTGGCCGGTGAGAGCCACTGAAAGCGAACCACATACATGTATCCATAATGTACACAATAA

AGGCTCCTAGATCAAAGGATCAAGCTCATAATACAAGCAACAACGCCATCGTGTCAGCCGAGCTATTTGAGTGTCACCTG

AAGAATAATACCCATACTTGCGCTCTTAAGTGGTAGTATCTGCTGAGCGTCTATCTGATCTGTTGAACTGCTACCACGAG

CTTTGGGGATTTTTCGCAGCAATTATACCTGGGCAAATACAAAGCACAATATTCACAAGCACAGCACTTGTAGGCGACCT

CATGCCACTGGTCTGATTAACAAACAATAAGCTTTTGTTTGATAAAACTAATAACGGATCTTGCGAGGGTGATGTAGCTA

TGAAGAACATGCATGCAACCTCAGCCAGCATGAGGTATTAGCTCGTAGAATGGCTACGAAGAGACCTAAACAAAAGTAGA

AGTAAGTTTAAAGCCTTTCCGATGGAATTTAACAAACTACAAAGTGGAGCAATTCTTTTTGTCGGCTGTTATCTGCTTGA

GTGGTATTCATCACGCTGTCTGTGCTCCCGAGGACTCTCCGATACCACAAACTATAATGTTAAATCCACATATTTTACAT

GAGCCGAGATGAAGTTATGCAGACTCAACACAAAGGAAATCAGGGGTCGTATCTTAAGTTCTTCTTGTTTCTAATAATCC

TCTCCAGAGGACTCCATTTGCAGCCACAAATACCTCATCGCGAAAAAGTGCAGCTTCATCTCACTCCATAACTATGTCAG

CTGCCGTCGAAAC

(序列号9)

ATACTTCAACGAAGGAGATTACTTCCAATTTCGAAGCAAAAGATTGGGGTCAGAAGAGCCCAAGTCACCAAGGTCAGGTT

ATGACTCGACAAAGCAAGCAACAGCCGACGAAGATAAATCGGAGGGAGATGAGGACGATATATTAAATGAGGGAAACCTC

CATTTCCTTGACTTTATTGAGAATAAAACCTTTGGTGTCAACCCCAGATCAAAGTCGGTCTTCGACCGCCTGGCATACGA

CTCTGTTGCTTTCATGTCGAACGATGCTGAGGAAGAGGAAAAGGAGAAATCTCTCACGACTACCTTAGAAGTTCTTGTTG

CTCCAGATTCTCCGCCTCCAAGCGATTACGTGATCGATCTTATTCACGAGATATCATCAATTTGCACGGACGTAAAACTC

ATGTTACGTTCGCTCAATGTGAAACAAATGTCGAAAGCGTTGAAGCAGACTGAGGAGGACTACCACAAGCTTGAAAGTTT

GGCTCGTCAAGAACGTGAAACCGACGAAGACAACAATCTGCAAATCACTATGAAACAGACGTCACCTACTAGGCCATCGG

TGACGACGCTAAAGACGGGCAGTGGATCTGTGGCTTCTGTTCCGTTCAGGCGTCTGCAAACACTGGAAATCAGTGAGCAG

ATTCCGCCACCGTCGCAATTGCAAGGCATGAGATCGTCAACATCGCTCAACACCACAACATCGGCTCTCAAATTCACGCC

TCTTAAGTCTGCAACAACAGGTGGTAAAACATTTTCTAAGGGCCTGCTCGAAGACAACAAAGATTTGGACCGGCGCATTG

CACAACTTGTGAAAGAAGATGAGAAGAAGAAGCTGAAGGCTGCCAAAGAAGAGAAGCAAAGATTGGCGAAAGAAGAGAAG

CTAGCTGCTAAACAAAGCAAGCAGAGGGAAAAGGAAAAACAAAGAGAGGAGTTGTCGCATACGAAGCACAAGGCTACTCC

TCTTGAAAGGAACCATACTGAGCCACAAGACTTCTTCTCTACGAAGCTGAACCGCGAAGATACCGATGAGTCTTCGTTGT

TTTCGAAGCCATCGATCACTTCGAAAGACAAGAAAGGAAGCATTATACTGCGGATCGGACACAAACTCAAACATACCGAG

CCGCTCAAGCACACGGAGTCTGTTGACAGTGATGTGAGGAGTATTTCCACAACTAAATCGTCCAGTAGCCAAACGTCAAA

CACTAGCAAGAAGTCGTCACGCAAGGTTGGATTATTTGGGTTGCGCAAGAGGAATTGAGAAACAAAAGGCAAGAGAGAAA

AAAAAAAAAAAAATATATATATATATACTAAGTTGGAGGAGAAATCAATCTGCTCCTTGTCAGTGTCTTTTGGAATGATT

GCATCGTAATATTCTTTTCTGGAGATTTTTTTTGGGTTTTTTGGAACAGCTGCAACACCATCAACACTCTGAGAAACAAC

TCCCCGAGACGCGCCAGCTGCGGCTGCCGCGTAGGAAAGTTGAGCCCCACTGGACTTTTGAGAAGTCTGGGTGCCGGAGG

AGGGACCTTCGGCGCGATTTGGGGAGGAAGCAACCTTAGTTGCTTTCTCCAGGATCATTGGATCGCTGAGCAGGGAGTTT

CTGTTCTCCTGACGCGTACCGCCTTCTACGGATGCGACGCTAGAAGATACAGAAACACCTTTTCCAGGACGATCAAACTC

GATAGGTGGTTCAGGAGGTCGGGAATCTCGCTCCACGGTACCGGGAGGTCGATTCGCGCCTTCTGCTTGATGCCGAACGA

TATTATTCAGCATTTTTCAAAAAGGATCTAAGGGTGTAAGCTTGAGCTTGTAAATGTATTCTAGAACACCGAAGTATTTA

AAACTTTGCTTTGAGTCTTTTATTGTATTATTAACTACTGTTTACTATTGCTGTCATATTGAACACCTTTTTGAAATTCG

CCAC

(序列号10)

CTTCGTTGCGTTGAGAAGCGCCTTGTCCAACTTTTTGGACTGCTCTAAAAAGCTGCGAAGCTTCTTAGACTTGGAGTAAA

CTTGTAGGAATGACACGGCTACACCTTGAAGAAGGGTGATGGGGGGAGTGACTCCTCCGTGAACGTAGAGCATGTACATG

AAAGTTGCGTAGAGGCCACCTTTCGAGCCGGCAACAAAGATCTCAAATACTTGTGTGTAAATGGGCTTGTTCTCCCACAC

ACGTTCTGAAACATCTTCGTCGTCGGGATCCTCGTCCTCATCGCTGATTTCCTCATCATTCGATACCTCGTTGCCACCCG

GCGACAGCAATCCCTGATTATTGGGGATGGTGTAGAACATGAGCTCATAAACGTTGAGTACGAGTTTACCGAAGTATGCT

ATTGCTTCCATCCCGAGCACTCCGTAGTGGATACCAAACAAGAGACTACCAACAGAACGTGTGCCCTGGAAGACGTCGTA

AGCCAAAAACTTCGCTAGGAGGAGGTCGGCGACAGTAAATACCTCGAGAAGAATCAGAACCCTATACGTGGCGAAGTTGT

AGAAGACCTGGCGAGAGGTTGATATCTGATGCGGAATCATGTTCGTGATTTTCATCTGAAACGAGTCAAGACGGTCCGTC

ATGATGATATGAAACACTTTGAACATGATCGTGAGGTTGATCCACACTATATTGAGAAGAAGATTATCGTCACTAAACAT

GATTATGAGAAGATTAATAAGGTAGAAGGGTAACTCCTCCGAAATATGCTCAATTTCAATGATCCGAAGCTCTCTGAAGA

TCAATTTGATCCCTGCAAACCCCATGAGAATAAAGCAACTTACCACGAAGTTGAGGAGAATTAGGAGTCTCACGCTCTCC

GTGAGCTCGTACATCATGGTAAGATAATCGACAGAGTTCATGGCCAGAACCACGAGCGATGCAGCGAAAAGGCCGAAGCT

AATGCCGCCATACACTGCAATTGCAATGGTGCCCTTTCGAGGCATGGTTATGGTGTTTTGTCTTTCTTTTGTGGGGACGA

AAGGTGTGGAAGCCGGAAGTAAACACCTCACCTTCGCGATAATCCTAGATCTACGCTAACTTGCGCATAGAGGGTCGTGC

GCGCAAAATTTTCCCCAGACTTCCAATTAGTGGTCGCTTGAGTCTATTAAAGTTGCGGAATTCGGGACTTATGGAGGTCA

TTGCGTAATGGTGACATTTCAGTTCGTCTTCTTTTGATGTCTGGAATCATGCTCTGTCCGTTTAATTGCCTCATAGGCAG

CCTCAGTGGCAGTCTCATGGGCAGTCGCAGAGGTGATCTGGATGCTGGTGAAGTTGCCGGGCGCTTCAATTGAGCAGGTG

ATCTTTGTAGCTCTGACAATGATTGGGAAAATATTTTGAGGTTCTTCTCGGTGTGATTTAAGTCGCGAGAAATTCCGTGG

TAGTTCTTATCGATCATGTCGGATACAATATGTGCCTTTTGAGTTGCAGCTTTCTCTATAGAGTCCGCCTGGCTGCGACT

AGTATTGGTAATATCAGCCAAAGCATTATCAATAACTTGTTTGGTCTCCTTCTGTAATCTTCCAAAGGCTCCCTGCACAT

CTTTGGTGGCAACCTCTTTGAAGGACTTGAGATCCGTGGCCACTGACTTGGTCTTTGTTGATATCGACTGTAGCGTTTGG

GAATTTTGATGAATGTAGGCCTGATACTCTTTGCTTAGAGTTGTCTTCTCTTCTTGCATGAATTCTGTTGCACTTTCCCT

AACCGCCTCGGCATTGGCGTCCTTGCTTGACTTCACGAACCCGTCAAATGCTAGGTGCATTTGTTGCATATATTGCTCCT

TAAGTGCCTCATACGTCTCTGCCATACGAGCCTTGAACTTCTTCTCAAAGGCCTTGTACATTGCGGAGTCTTCCAGAAGA

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ACAAACATTATGAAGGGTAGAAAAGTCCATCAGATTAGCGAGAACCTGCTCGAAGGCTGATGTCTCCTTCTCTACTTTGG

AAGAAACATCATTTAATTTGCCCTCGAGAGTCTTCTTAAAAAGGCAAAGATGCGTTTGAACGACGGTGGGGATCTCCTTC

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TCCTGTAACATTAGAGACTCGCTCTTTTTGAGAGCTGTATTTGTCTTTTAAATGCATGAACTCTTTTGTAGTCTTGTGAA

GCTCAGCGTCTTTAGCTGCGAGGTCCAGCCTGCTTTTCGAGTTCTCGCTAAGTGTTTGCTCGATCTGTAGTTTGAGTTCT

GCAATATCCTTGTCCCTCCCTTGAAGTTTGGCGTGTAGCCCTGTAATCTGAGTGTCTTTCTCCTTCAACTCGGTTCTAAG

TTCCGCAATTTTCCTTTCAAAGTCCTCGTAGTTCTGAAGACTGATCCTGATGCTGTTGTCTTTGCCTTTTGTAGCCAATA

AGTCTCTATTCAATCTAGAAATCTCCGCTGATAACTCCCTTATCTTTGTACGTTTGAGAACGAGCTCGCTGTCGGCCGTC

GATTGTGGTATATTTTTGATATTCTTCGCCTTGGAAGCGTAAGTTAGCGTCAGCATCGTTTCCATTAAGTTCAGCTTTGC

CGGGGAAATGGTAGCAATCAATGCGGTTTTGGTCCGCCCTCCAATAGAGCCTTGAAGAAGACGGGTGAGTTTAGACTCTC

TATAAGGTATATGTCTAGGTTCTTTGCCTTCACTCAATGCACTGATGACCTTTCCCAAAGTCAAAAGACTCTGGTTGATC

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ACGTACTGTACTAGCCTTCGCTCGTGTGACGATTAGCCAGCCGTACTTTTCCCCATCACCGTAAACCATCTATTGATGTT

CATATATACAGATTCCAATGACGACGCCAATGGCAATGCCACGAGCCCCCAAAAACCTCAATCAAAGAAATCATCGTCATCTTCAT

从序列号7-10所示的序列中，进一步根据本发明人等的经验，筛选序列号7的碱基序列作为最适合LAMP反应的1kbp左右的序列。通过美国国立生物技术信息中心的BLAST检索，确认了该序列编号7的碱基序列是含有丙酮酸盐：铁氧还蛋白氧化还原酶结构域的耳念珠菌(C.auris)基因组(登录号：XM_018317007)。

此处，使用由作为模板的C.auris JCM15448^T和Auris F(序列号11：GCTATGCCGCTAGCAACG)以及Auris R(序列号12：CACTACAGCAGGATCAACGG)构成的一对引物通过EcoRIdAmp(注册商标)PCR Master Mix(宝生物工程株式会社(タカラバイオ社)制)对序列号7的DNA片段进行扩增。

为了制备该菌的DNA特异性的pTAC-2Auris质粒，用QIAquick(注册商标)PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，芬洛，荷兰)纯化单位复制序列，使用DynaExpress TA PCR克隆试剂盒(生物动力学实验室公司，东京，日本)克隆为pTAC-2载体。克隆的碱基序列使用ABIPRISM(注册商标)3130×1基因分析仪(美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州，美国)确认。

以192bp片段(基因座XM_018317007：774b～965b内的位置)为目标，使用PrimerExplorer V5软件(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计作为候选的LAMP引物组。将确定的LAMP Auris引物组(以下，有时记作“LAMP Auris引物组”)示于表1。

表1

但是，LAMP引物的设计即使使用专用的软件也不一定容易。例如，确认了除了表1所示序列号1-4所示的LAMP的基本引物组以外，作为能够根据序列号7设计的引物组，能够举例序列号13-16的多核苷酸等，但这些引物组均不会对耳念珠菌(Candida auris)产生根据LAMP法的基因扩增反应。

(序列号13)

GTGGTATCTTCGGATGCTGGCTCCAGCGAGGAACAACGAA(FIP)

(序列号14)

ACAACCTTGCGTGCAGACGAAGGGTTCCTTTCCCATTTGC(BIP)

(序列号15)

AGAAACGGAACCGAAACGG(F3)

(序列号16)

CCTCTCCTGTTGGTTTGGTT(B3)

＜实施例2＞根据LAMP法的扩增反应

对于耳念珠菌(Candida auris)的培养检测体，根据LAMP法的扩增反应使用loopamp Turbidimeter RT-160C(荣研化学株式会社制)在56℃下进行90分钟。通过在80℃下使DNA聚合酶失活5分钟来停止反应。对于各反应液，添加2×反应混合液(荣研化学制)12.5μL、上述LAMP Auris引物组的各引物(40μM FIP、40μM BIP、20μM环-F、20μM环-B、5μMF3、5μM B3)、1μL的BstDNA聚合酶、2μL样品DNA溶液以及蒸馏水，使各反应的总容量为25μL。

为了确定LAMP Auris引物组的检出限，连续稀释pTAC-2Auris(1×10⁰～10¹⁰拷贝/μL)，作为三联反应中的模板使用。扩增产物的检测通过loopamp Turbidimeter RT-160C进行。

将结果示于图1。

如图1所示，也确认了根据使用LAMP Auris引物组的LAMP法，即使为每个反应2×10¹拷贝以下的浓度时，也能够检测pTAC-2Auris，具有高灵敏度。另外，也确认了对于从菌体中提取DNA，即使在直接(不破碎)用DNA提取试剂处理菌体的情况下，也能够高效地提取DNA。

＜实施例3＞LAMP Auris引物组的特异性评价

为了评价LAMP Auris引物组对于耳念珠菌(C.auris)的特异性，对38种(20种丝状菌及18种酵母)共计57株进行了试验(表2)。

按照非专利文献4中记载的方法，提取并纯化了模板株的全部DNA。对于酵母株，将在沙氏葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar，SDA)上增殖的一部分菌落悬浮在蒸馏水25μL中，在100℃下加热15分钟，进行短时间的离心分离。关于各LAMP Auris的反应，使用了2μL的上清液或纯化DNA作为模板。

将结果示于表2。

表2

+：阳性；-：阴性；*：在一般检查中被误认为是耳念珠菌(C.auris)的菌种。

通过使用LAMP Auris引物组的LAMP法，确认了所有16个耳念珠菌(C.auris)株的扩增。另一方面，其他所有丝状菌和酵母种包括通常被误认为耳念珠菌(C.auris)的菌种(通过以往的检查法无法与耳念珠菌(C.auris)鉴别的菌种：表2中用*指示)，没有显示出增幅。

此外，为了验证基于LAMP Auris的反应中使用的DNA模板的品质，分别进行了使用泛真菌LAMP引物组(非专利文献4)的LAMP反应，结果在来自所有试验种的模板中检测到扩增。

＜实施例4＞根据LAMP法检测临床检测体中的耳念珠菌(C.auris)

将使用上述LAMP Auris引物组的LAMP法应用于临床检测体。对由C.aurisLC318417引起的耳炎(非专利文献5)得到的耳拭子标本进行了试验。

将耳拭子检测体放在SDA琼脂表面，在37℃条件下培养。通过该LAMP法、MALDI-TOFMS(布鲁克道尔顿公司(Bruker DaltonicsK.K.)，神奈川，日本)和rDNA的序列分析，能够将得到的小乳膏状菌落(菌体)鉴定为耳念珠菌(C.auris)。

同时，通过以下的方法，不经过培养，尝试了从临床检测体直接进行耳念珠菌(C.auris)DNA的检测。把棉签放入2毫升的微管中，用补充了0.05％吐温-80(Tween80)的1mL生理盐水洗涤，振荡10分钟。用20000g离心分离该悬浊液10分钟，用生理盐水100μL洗涤生成的颗粒后，使用kaneka简易DNA提取试剂盒第2版(钟化株式会社(カネカ株式会社)制)按照制造商的指示提取全部DNA。以提取的2μl的DNA作为LAMP反应液的试样核酸，使用上述LAMP Auris引物组，进行根据LAMP法的核酸扩增反应。反应条件和扩增产物的检测与实施例2同样地进行。

将结果示于图2。

如图2所示，对于临床检测体，以27分钟检测根据LAMP法的扩增产物。确认了使用上述LAMP Auris引物组的LAMP法能够直接适用于临床检测体。另外，确认了即使包括直接提取(不破碎地提取)DNA的工序在内，鉴定过程也能够在整体上约1小时以内完成，能够迅速检测。

＜实施例5＞根据LAMP法检测环境样品中的耳念珠菌(C.auris)

还评价了使用上述LAMP引物组的LAMP法在环境调查中的适用性。将含有1×10⁶个耳念珠菌(C.auris)的约25μL生理盐水在清洁的培养皿中干燥，使用为了环境采样而最优化的拭子法回收细胞(样品A～D)。

将样品A～D的菌量和回收率示于表3。

表3

样品	回收的菌量(细胞/μL)	回收率(％)
			A	5×10<sup>2</sup>	51
B	5.6×10<sup>2</sup>	57
			C	6.25×10<sup>2</sup>	63
D	3.75×10<sup>2</sup>	38

除了振荡以外，与实施例2、4同样地进行拭子的处理和DNA提取。样品A、B不使用振动摇床，样品C、D使用了振动摇床10分钟。另外，对于根据LAMP法的核酸扩增反应中的反应条件及扩增产物的检测，也与实施例2、4同样地进行。

将各样品的LAMP反应时间和检测结果示于表4、图3。

表4

如表4、图3所示，确认了各样品(A～D，阳性对照)在根据LAMP法的核酸扩增反应开始约20分钟后检测到扩增产物(LAMP阳性)，能够检测耳念珠菌(C.auris)DNA。表明了通过使用上述LAMP Auris引物组的LAMP法能够应用于环境调查，能够迅速且准确地检测。

根据以上的实施例的结果，确认了通过使用上述LAMP Auris引物组的LAMP法，以100％的特异性鉴定所有的耳念珠菌(C.auris)株，能够从近缘种可靠地区分并检测。另外，每个反应能够检测2×10¹拷贝的目标DNA，也没有扩增装置使用上的技术问题，能够在短时间内得到结果。进一步，确认了也能够从临床检测体中检测，缩短了培养和DNA提取所需的时间，能够实现早期诊断。另外，近年来，由于能够在商业上获得便携式LAMP扩增装置等，因此根据使用了本发明的LAMP Auris引物组的LAMP法，在环境控制很重要的医疗设施中的环境调查等中也能够迅速且准确地检测耳念珠菌(C.auris)。

序列表

<110> 学校法人帝京大学（Teikyo University）

<120> 耳念珠菌检测用引物组、耳念珠菌检测试剂盒和耳念珠菌的检测方法（Amethod for detection of Candida auris）

<130> 19F004PCT

<150> JP2018-086653

<151> 2018-04-27

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

aggctactga gcttgctggt gtaaccaaac caacaggaga gg 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

acggtttcag ggttagcatg gctcaacaaa gtcgctggta ca 42

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gggaaaggaa ccctgacct 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggacacagca ttcgaagtgt 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

catctcgaag gcctcggt 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cacatactcg aacggagtc 19

<210> 7

<211> 872

<212> DNA

<213> 耳念珠菌(Candida auris)

<400> 7

cactacagca ggatcaacgg atgcttcata ctctgaaatc acctttaatg ctgggattgg 60

cgcccacaca aagttggctg ggtggacaaa ctcctccaca gaaacagaac cgaaacggcc 120

agcgaggaac aacgaagcag caacgtcagc cttcaaggtt gagccagcat ccgaagatac 180

cacaacaacc ttgcgtgcag acgaaggcac agaagccacg aagtgttctt gagcaaatgg 240

gaaaggaacc ctgaccttaa ccaaaccaac aggagaggaa accgaggcct tggagatgac 300

accagcaagc tcagtagcct ggtgagcacc aaaagcgaca aaaacagttt cagggttagc 360

atggcccaca tactcgaacg gagtcaaatt tgtaccagcg actttgttga acacttcgaa 420

tgctgtgtcc actgcctttt ccaaagaata gtcgccgtcg ggaatcgaag acaccaattg 480

ctggtataag cggcccacat cggtcacaga caagatgtca tcgaacttgg agatcgcttt 540

agcaaactca ggaccgtcga aaacgtgcaa ggctggtccc tgaagcaaag tagccacaaa 600

gtgagtgaag atggtgatgt actgcaactc cacggcgctc tgcgagtccg ccggggccac 660

cacagggata cccgtggagc gagcagttgc caaaggagtc gtatagtttg aaaccaacga 720

gtttgtttcc acatcaaagt cgatagcgga aacgttcaag gtcaatggca attttgcagc 780

cttggccaaa gtgggctgca tccatggcaa ggcgttggcg cccaacacag cagtatgtgg 840

tccagtggag gacacgttgc tagcggcata gc 872

<210> 8

<211> 1533

<212> DNA

<213> 耳念珠菌(Candida auris)

<400> 8

agtaagagct gcggtcatca agctcaacat cttcatcgtc tatcgccgac agagacgcct 60

ccatttggtt ttttcttgtt aaattgtcca ccgacaaagg ctggtggcct gaagtctccg 120

cagagtctgc cataaagttt gagcaattgt agatgttgta ggtttttttt gcaagtgtta 180

tcggcgtccg aagttgaagt gtgacgggcg cgcaggaagg tcagaaagca gcaaggaaac 240

ggccaaaggt accagataga agaaacggtc tgttggggct gattttgtag aaactgatgt 300

ttaattcaca ttttcttcac ccgtgggggt tcgttgggaa ccgtcacgag gcacgtttgt 360

tgtggggcac gtgtggttgc aaaatgagat aagcaaggta gtgtggtttg acagcttcat 420

ataggaaggt gcaaaaaagt gcaaagagag aagaatgtaa attgaaattg taatattcca 480

atgagtgaag tgctaatttt ggaaatctga gctttttaat gtctactcaa ctttgatgtt 540

tcagtggatg aagcctgttt ggcgtaaagt ccacaggttt tcggagtttt ggcgagcatc 600

gacacataac aaggcaacaa tgcaaagtca cgaaaatctc gaacaatggc gagtcgtaaa 660

ttgggtctct gattttccta gcgtgaattg aacagaaaca gtccaagtcc atgcttgcat 720

tcagtcactt gttttgagat gtggccggtg agagccactg aaagcgaacc acatacatgt 780

atccataatg tacacaataa aggctcctag atcaaaggat caagctcata atacaagcaa 840

caacgccatc gtgtcagccg agctatttga gtgtcacctg aagaataata cccatacttg 900

cgctcttaag tggtagtatc tgctgagcgt ctatctgatc tgttgaactg ctaccacgag 960

ctttggggat ttttcgcagc aattatacct gggcaaatac aaagcacaat attcacaagc 1020

acagcacttg taggcgacct catgccactg gtctgattaa caaacaataa gcttttgttt 1080

gataaaacta ataacggatc ttgcgagggt gatgtagcta tgaagaacat gcatgcaacc 1140

tcagccagca tgaggtatta gctcgtagaa tggctacgaa gagacctaaa caaaagtaga 1200

agtaagttta aagcctttcc gatggaattt aacaaactac aaagtggagc aattcttttt 1260

gtcggctgtt atctgcttga gtggtattca tcacgctgtc tgtgctcccg aggactctcc 1320

gataccacaa actataatgt taaatccaca tattttacat gagccgagat gaagttatgc 1380

agactcaaca caaaggaaat caggggtcgt atcttaagtt cttcttgttt ctaataatcc 1440

tctccagagg actccatttg cagccacaaa tacctcatcg cgaaaaagtg cagcttcatc 1500

tcactccata actatgtcag ctgccgtcga aac 1533

<210> 9

<211> 1924

<212> DNA

<213> 耳念珠菌(Candida auris)

<400> 9

atacttcaac gaaggagatt acttccaatt tcgaagcaaa agattggggt cagaagagcc 60

caagtcacca aggtcaggtt atgactcgac aaagcaagca acagccgacg aagataaatc 120

ggagggagat gaggacgata tattaaatga gggaaacctc catttccttg actttattga 180

gaataaaacc tttggtgtca accccagatc aaagtcggtc ttcgaccgcc tggcatacga 240

ctctgttgct ttcatgtcga acgatgctga ggaagaggaa aaggagaaat ctctcacgac 300

taccttagaa gttcttgttg ctccagattc tccgcctcca agcgattacg tgatcgatct 360

tattcacgag atatcatcaa tttgcacgga cgtaaaactc atgttacgtt cgctcaatgt 420

gaaacaaatg tcgaaagcgt tgaagcagac tgaggaggac taccacaagc ttgaaagttt 480

ggctcgtcaa gaacgtgaaa ccgacgaaga caacaatctg caaatcacta tgaaacagac 540

gtcacctact aggccatcgg tgacgacgct aaagacgggc agtggatctg tggcttctgt 600

tccgttcagg cgtctgcaaa cactggaaat cagtgagcag attccgccac cgtcgcaatt 660

gcaaggcatg agatcgtcaa catcgctcaa caccacaaca tcggctctca aattcacgcc 720

tcttaagtct gcaacaacag gtggtaaaac attttctaag ggcctgctcg aagacaacaa 780

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tgccaaagaa gagaagcaaa gattggcgaa agaagagaag ctagctgcta aacaaagcaa 900

gcagagggaa aaggaaaaac aaagagagga gttgtcgcat acgaagcaca aggctactcc 960

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cattatactg cggatcggac acaaactcaa acataccgag ccgctcaagc acacggagtc 1140

tgttgacagt gatgtgagga gtatttccac aactaaatcg tccagtagcc aaacgtcaaa 1200

cactagcaag aagtcgtcac gcaaggttgg attatttggg ttgcgcaaga ggaattgaga 1260

aacaaaaggc aagagagaaa aaaaaaaaaa aaatatatat atatatacta agttggagga 1320

gaaatcaatc tgctccttgt cagtgtcttt tggaatgatt gcatcgtaat attcttttct 1380

ggagattttt tttgggtttt ttggaacagc tgcaacacca tcaacactct gagaaacaac 1440

tccccgagac gcgccagctg cggctgccgc gtaggaaagt tgagccccac tggacttttg 1500

agaagtctgg gtgccggagg agggaccttc ggcgcgattt ggggaggaag caaccttagt 1560

tgctttctcc aggatcattg gatcgctgag cagggagttt ctgttctcct gacgcgtacc 1620

gccttctacg gatgcgacgc tagaagatac agaaacacct tttccaggac gatcaaactc 1680

gataggtggt tcaggaggtc gggaatctcg ctccacggta ccgggaggtc gattcgcgcc 1740

ttctgcttga tgccgaacga tattattcag catttttcaa aaaggatcta agggtgtaag 1800

cttgagcttg taaatgtatt ctagaacacc gaagtattta aaactttgct ttgagtcttt 1860

tattgtatta ttaactactg tttactattg ctgtcatatt gaacaccttt ttgaaattcg 1920

ccac 1924

<210> 10

<211> 4646

<212> DNA

<213> 耳念珠菌(Candida auris)

<400> 10

cttcgttgcg ttgagaagcg ccttgtccaa ctttttggac tgctctaaaa agctgcgaag 60

cttcttagac ttggagtaaa cttgtaggaa tgacacggct acaccttgaa gaagggtgat 120

ggggggagtg actcctccgt gaacgtagag catgtacatg aaagttgcgt agaggccacc 180

tttcgagccg gcaacaaaga tctcaaatac ttgtgtgtaa atgggcttgt tctcccacac 240

acgttctgaa acatcttcgt cgtcgggatc ctcgtcctca tcgctgattt cctcatcatt 300

cgatacctcg ttgccacccg gcgacagcaa tccctgatta ttggggatgg tgtagaacat 360

gagctcataa acgttgagta cgagtttacc gaagtatgct attgcttcca tcccgagcac 420

tccgtagtgg ataccaaaca agagactacc aacagaacgt gtgccctgga agacgtcgta 480

agccaaaaac ttcgctagga ggaggtcggc gacagtaaat acctcgagaa gaatcagaac 540

cctatacgtg gcgaagttgt agaagacctg gcgagaggtt gatatctgat gcggaatcat 600

gttcgtgatt ttcatctgaa acgagtcaag acggtccgtc atgatgatat gaaacacttt 660

gaacatgatc gtgaggttga tccacactat attgagaaga agattatcgt cactaaacat 720

gattatgaga agattaataa ggtagaaggg taactcctcc gaaatatgct caatttcaat 780

gatccgaagc tctctgaaga tcaatttgat ccctgcaaac cccatgagaa taaagcaact 840

taccacgaag ttgaggagaa ttaggagtct cacgctctcc gtgagctcgt acatcatggt 900

aagataatcg acagagttca tggccagaac cacgagcgat gcagcgaaaa ggccgaagct 960

aatgccgcca tacactgcaa ttgcaatggt gccctttcga ggcatggtta tggtgttttg 1020

tctttctttt gtggggacga aaggtgtgga agccggaagt aaacacctca ccttcgcgat 1080

aatcctagat ctacgctaac ttgcgcatag agggtcgtgc gcgcaaaatt ttccccagac 1140

ttccaattag tggtcgcttg agtctattaa agttgcggaa ttcgggactt atggaggtca 1200

ttgcgtaatg gtgacatttc agttcgtctt cttttgatgt ctggaatcat gctctgtccg 1260

tttaattgcc tcataggcag cctcagtggc agtctcatgg gcagtcgcag aggtgatctg 1320

gatgctggtg aagttgccgg gcgcttcaat tgagcaggtg atctttgtag ctctgacaat 1380

gattgggaaa atattttgag gttcttctcg gtgtgattta agtcgcgaga aattccgtgg 1440

tagttcttat cgatcatgtc ggatacaata tgtgcctttt gagttgcagc tttctctata 1500

gagtccgcct ggctgcgact agtattggta atatcagcca aagcattatc aataacttgt 1560

ttggtctcct tctgtaatct tccaaaggct ccctgcacat ctttggtggc aacctctttg 1620

aaggacttga gatccgtggc cactgacttg gtctttgttg atatcgactg tagcgtttgg 1680

gaattttgat gaatgtaggc ctgatactct ttgcttagag ttgtcttctc ttcttgcatg 1740

aattctgttg cactttccct aaccgcctcg gcattggcgt ccttgcttga cttcacgaac 1800

ccgtcaaatg ctaggtgcat ttgttgcata tattgctcct taagtgcctc atacgtctct 1860

gccatacgag ccttgaactt cttctcaaag gccttgtaca ttgcggagtc ttccagaaga 1920

tgtgttgagt tgatgtaatc cgttagttgc tcattcctct tgttcactcc agctacgtgc 1980

agcgagaaat cgaggttttg acaaacatta tgaagggtag aaaagtccat cagattagcg 2040

agaacctgct cgaaggctga tgtctccttc tctactttgg aagaaacatc atttaatttg 2100

ccctcgagag tcttcttaaa aaggcaaaga tgcgtttgaa cgacggtggg gatctccttc 2160

acattcagca gcacctgagt taggtcatta agattgttaa tcacctcatt aacgtcccta 2220

atgatactca gaattccagt tcctgtaaca ttagagactc gctctttttg agagctgtat 2280

ttgtctttta aatgcatgaa ctcttttgta gtcttgtgaa gctcagcgtc tttagctgcg 2340

aggtccagcc tgcttttcga gttctcgcta agtgtttgct cgatctgtag tttgagttct 2400

gcaatatcct tgtccctccc ttgaagtttg gcgtgtagcc ctgtaatctg agtgtctttc 2460

tccttcaact cggttctaag ttccgcaatt ttcctttcaa agtcctcgta gttctgaaga 2520

ctgatcctga tgctgttgtc tttgcctttt gtagccaata agtctctatt caatctagaa 2580

atctccgctg ataactccct tatctttgta cgtttgagaa cgagctcgct gtcggccgtc 2640

gattgtggta tatttttgat attcttcgcc ttggaagcgt aagttagcgt cagcatcgtt 2700

tccattaagt tcagctttgc cggggaaatg gtagcaatca atgcggtttt ggtccgccct 2760

ccaatagagc cttgaagaag acgggtgagt ttagactctc tataaggtat atgtctaggt 2820

tctttgcctt cactcaatgc actgatgacc tttcccaaag tcaaaagact ctggttgatc 2880

aggcccgctt ctttggcact agcatcggta gcgccagact tgatgatatc ttccagcccc 2940

gcgagatcca ccaaattcat ttttgacagc cgcaccacct cttgccctga cgacgacatt 3000

actgttttgt gaagcgttat ggtgaaaatg gtgtgagaac gtgatgagcg ggagttgagt 3060

ttagtggtac ccatcttcct cttccctagg cacttttgta gcatctcaaa ccccagcttc 3120

gcatccacca cgtcaagctc atacaaattc tggatcattg ttccccttcc atctctcgaa 3180

ccatccccta ggagccttag tttcggcttt tttgagttca actcaagctc atcgttgacg 3240

agatcatgga gctcttcctt gtacaattcc acacacgaca acttgacaca gatgtcgtct 3300

ttggccacct gaaaaagctc ttgcaacaca cgaggcacaa tacccgcatg ctctcccact 3360

aaatccccca acattgtata cgtctttcct gagcctgtca ggccatacgc aaggatagtg 3420

acattcatgc ctgccatgaa atctcgaagt aacggacgag caatgttttt gtaaatgagt 3480

tcctgatcag cattggcacc atagacttgg tctagtgtaa atactttgcc tgaaccgtct 3540

gatccagagc caaaggaagt gttgggggaa gcattcacgc taacgtaggg ttcatccgtg 3600

gaacagaaat cgtcaggcac cgagaccaca atcggggact gggcggctat ctccagctca 3660

gttcttcttc gcacacgggc gctgacctgg attttgtcgg acatatagta cagttttttt 3720

tttgtagtct ttctttgtgg agattatggt gatgtttatg tttgtttacg atgggcggcc 3780

tgtgtgcagg tcggaacggt caaagcatgt agagtgtcta gagtctttat cgatgaatgg 3840

aagtagagga ggtaaaattc taatagtgag attctttttt cgatggacgt gtttttgttt 3900

acgttcctcg tacttagtta tgtttcgggt ttaatggtgt ttagtgagaa atggctgcaa 3960

aatgcaaaat gctgcgaaaa agtatagatc agagaaagac aatactactg tctgataaaa 4020

aacaaaagtt gatgataaga ataccagaat ttgtactcac atataggaaa tcacctagag 4080

tttgatatat aatctgacac agcaatgtca aaatcgcttt taccacgtgc tataaaaagt 4140

ttctaaggac gtcaccttct cgatataaga taagcattct gtgaacggct gttaggaaag 4200

agcatagtga ggtatttcag ttgaaatacg tatgccaaaa aaaaggcaac cattaattag 4260

attccacgtg gttcactaca ctgaaaacag atgaactgtc tacaatacag tctgtcagtg 4320

caatgcctac cagttgctgg tggcatagca cctcacgaat ggatatattc gctaccaggt 4380

tttgtacagc tcaaaccact acatagctgg tttctgtcaa cctcgtcgct atcaactaac 4440

aaactctttt actaaaaaag agaagctctt ctttcactac acgtactgta ctagccttcg 4500

ctcgtgtgac gattagccag ccgtactttt ccccatcacc gtaaaccatc tattgatgtt 4560

catatataca gattccaatg acgacgccaa tggcaatgcc acgagccccc aaaaacctca 4620

atcaaagaaa tcatcgtcat cttcat 4646

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

gctatgccgc tagcaacg 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cactacagca ggatcaacgg 20

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gtggtatctt cggatgctgg ctccagcgag gaacaacgaa 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

acaaccttgc gtgcagacga agggttcctt tcccatttgc 40

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

agaaacggaa ccgaaacgg 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

cctctcctgt tggtttggtt 20

Claims (7)

1.一种耳念珠菌检测用引物组，其是通过LAMP法对检测体中的耳念珠菌的目标序列进行扩增并检测时使用的包括由FIP、BIP、F3以及B3构成的4种引物的耳念珠菌检测用引物组，其特征在于，

FIP是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，

BIP是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，

F3是由序列号3构成的多核苷酸，

B3是由序列号4构成的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的耳念珠菌检测用引物组，其特征在于，

FIP是由序列号1构成的多核苷酸，BIP是由序列号2构成的多核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的耳念珠菌检测用引物组，其特征在于，

其还包括作为环引物的序列号5、6的多核苷酸。

4.一种耳念珠菌检测试剂盒，其特征在于，

其包括权利要求1～3中任一项所述的耳念珠菌检测用引物组。

5.一种耳念珠菌的检测方法，其是对由检测体得到的核酸试样进行根据LAMP法的核酸扩增反应并检测扩增产物的耳念珠菌的检测方法，其特征在于，

LAMP法中的引物组包括由FIP、BIP、F3以及B3构成的4种引物，

FIP是包括序列号1所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，

BIP是包括序列号2所示的碱基序列中的5’末端侧的5～20个碱基和3’末端侧的5～20个碱基的多核苷酸，

F3是由序列号3构成的多核苷酸，

B3是由序列号4构成的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的耳念珠菌的检测方法，其特征在于，

FIP是由序列号1构成的多核苷酸，BIP是由序列号2构成的多核苷酸。

7.如权利要求5或6所述的耳念珠菌的检测方法，其特征在于，

所述引物组还包括作为环引物的序列号5、6的多核苷酸。

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