CN116287352A - 引物探针组、检测产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物探针组、检测产品及其应用。本发明提供了引物，具有：如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任意所示的核苷酸序列；或与上述核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与上述核苷酸序列不同的核苷酸序列；或与上述核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与上述核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或与上述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。本发明提出了将液滴数字PCR平台用来检测结核分枝杆或结核分枝杆菌复合群，本发明另一方面提出了将rRNA结合IS6110同时检测DNA和RNA作为核酸检测试剂盒的靶标。

Description

引物探针组、检测产品及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及引物探针组、检测产品及其应用。
背景技术
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)简称为结核杆菌(tubercle bacilli)，是人类结核病的病原体。是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性。无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖。德国细菌学家郭霍(Robert Koch，1843-1910)于1882年发现并证明为人类结核病的病原菌。该菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，经过与其几个世纪的抗争后逐渐得到控制，但近年来由于多种因素的影响，该疾病变得日趋严重。
由于结核分枝杆菌比较难破壁，其核酸提取效率最高只能达到40％左右，经提取这一步就大大的降低了结核分枝杆菌的检测灵敏度，目前市场上存在的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，为了提高检测效率在选用高拷贝序列IS6110和IS1081的同时，使用了巢式扩增。该方法确实大大的提高了结核分枝杆菌的检测灵敏度，但是其检测的靶标是DNA。结核分枝杆菌只要存在过，无论死菌活菌都有DNA的存在，故检测DNA无法完全明确患者体内是否有活的结核分枝杆菌存在，该方法只能用于结核患者的筛查，不能用于患者的治疗监控。
同时，大量患者在使用药物以后，即使结核分枝杆菌全被杀死，但是体内仍有大量的结核分枝杆菌DNA存在，导致选用高拷贝序列并使用巢式等以DNA为靶标的方法检测仍然显示阳性结果。在治疗上为医生提供错误信息，引起过度治疗。
因此，寻找一种灵敏度高、特异性好，同时可以用于对结合患者药物治疗反应进行监测的试剂盒至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了引物探针组、检测产品及其应用。本发明提出了将液滴数字PCR平台用来检测结核分枝杆或结核分枝杆菌复合群，本发明另一方面提出了将rRNA结合IS6110同时检测DNA和RNA作为核酸检测试剂盒的靶标。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物，具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任意所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明还提供了探针，具有：
(5)、如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9中任意所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述探针具有荧光报告基团和/或淬灭基团。
在本发明的一些实施方案中，上述探针中所述荧光报告基团包括FAM和/或VIC，所述淬灭基团包括MGB和/或BHQ1。
本发明还提供了引物探针组，包括上述引物和/或上述探针。
本发明还提供了上述引物、上述探针和/或上述引物探针组在制备检测结核分歧杆菌和/或结核分歧杆菌复合群的核酸的产品中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述结核分枝杆菌复合群包括：结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌或非洲分枝杆菌。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述产品包括：检测试剂和/或试剂盒。
本发明还提供了检测产品，包括上述引物、上述探针和/或上述引物探针组以及可接受的助剂或载体。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，以体积份数计，其反应体系包括：
Figure BDA0004209760860000031
；所述引物探针混合液包括上述引物探针组。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品，以体积份数计，所述引物探针混合液包括：
上游引物 0.35份
下游引物 0.35份 探针 0.105份
；所述上游引物、所述下游引物或所述探针的初始浓度为100μM。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品的扩增程序包括：
Figure BDA0004209760860000032
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品适用于液滴数字PCR。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品包括检测试剂和/或试剂盒。
本发明还提供了检测方法，取上述引物、上述探针、上述引物探针组和/或如上述检测产品对待测样品扩增，检测。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述检测的检测靶标包括：rRNA或IS6110。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述待测样品包括结核分歧杆菌和/或结核分歧杆菌复合群。
本发明提供了引物，具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任意所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明提出了将液滴数字PCR平台用来检测结核分枝杆或结核分枝杆菌复合群，本发明另一方面提出了将rRNA结合IS6110同时检测DNA和RNA作为核酸检测试剂盒的靶标。该试剂盒不仅灵敏度高、特异性好；同时，因其绝大部分的检测值是通过rRNA反应出来的，还可以用于结核患者对药物治疗反应的监测。
(2)本发明选用核糖体RNA(rRNA)结合IS6110为检测靶标。因为蛋白质是生命活动的体现者，核糖体是蛋白质的加工厂，所以无论是原核生物还是真核生物体内均含有大量的核糖体。所以检测rRNA不仅能大大的提高检测靶标的拷贝数，提高检测的灵敏度；而且核糖体RNA也不会像信使RNA(mRNA)一样，虽然检测的都是活菌，但是mRNA与细胞的生命状态有关，不仅极容易降解，而且在不同的细胞也差异极大，就算是相同的细胞不同的时间测量差异也极其明显，导致检测极其不稳定。rRNA是一种稳定的RNA靶标，它的半衰期比mRNA长相对来说比较稳定，比mRNA丰度高，估计是mRNA总量的100倍。特别适合用作结核分枝杆菌检测活菌的靶标。当患者使用药物以后，只要结核分枝杆菌被大量的杀死，检测值就会明显降低，可以及时反应治疗信息。同时保留了DNA，结合数字PCR灵敏度高的特点，即使收集的样本未必能及时处理，或未严格按照RNA样本保存的要求保存，仍然具有较高的灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明合成阳性质控品的质粒图谱；
图2示多种分枝杆菌的16s rRNA序列引物探针选择的结核分枝杆菌特异性序列；其中：从上到下依次为：龟分枝杆菌、结核分枝杆菌、草分歧杆菌、蝉分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌。
具体实施方式
本发明公开了引物探针组、检测产品及其应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明实施例1、实施例2及效果例中，所用原料及试剂均可由市场购得。本发明的样品来源：菌株核酸样品：外购灭菌株，按照领航基因科技有限公司开发的痰液核酸村花试剂盒TF1的使用说明书，磁珠法提取核酸；人基因组DNA样品：培养的细胞系：hela细胞；无菌痰液/肺泡灌洗液，磁珠法提取核酸；外源内参模板：生物公司合成，溶解稀释后备用。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1引物探针设计
依据多种分枝杆菌(龟分枝杆菌、结核分枝杆菌、草分歧杆菌、蝉分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌)序列分析结果，采用Primer Express软件，设计一对引物和一条探针；同时搭配一组外源内参的引物探针，具体信息如表1所示；
表1
Figure BDA0004209760860000061
Figure BDA0004209760860000071
实施例2数字PCR扩增体系
(1)引物探针混合液如表2所示；
表2
Figure BDA0004209760860000072
Figure BDA0004209760860000081
(2)ddPCR反应体系如表3所示；
表3
试剂 体积(μL) 终浓度
水 5.195
5XddPCRMix 3 1X
引物探针混合液 0.805
IC-S 1
DNA 5
合计 15
(3)扩增程序如表4所示；
表4
Figure BDA0004209760860000082
效果例
(1)引物探针设计的特异性
如图1所示，本发明实施例1设计的引物探针在结核分枝杆菌16s rRNA基因序列上的位置，及多种分枝杆菌16s rRNA基因序列在该位置上的差异。
因此，与8种非结核分枝杆菌序列对比，实施例1设计的引物探针具有序列特异性。
(2)引物探针特异性的验证如表5所示；
表5
Figure BDA0004209760860000091
Figure BDA0004209760860000101
本体系检测了8种常见的非结核分枝杆菌和多种常见的肺部感染细菌真菌，结果显示实施例1设计的引物探针在实践中特异性较高，且检测结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群三个重复的稳定性也较好。
(3)与只检测DNA相比灵敏度的提高
提取从合作医院提供的结核患者的痰液样本500μL，按照诺唯赞逆转录试剂盒R312的使用说明书，逆转录30μL：分别取两个500μL无RNA酶的PCR管，管1按试剂盒使用说明书做逆转录，并使用DNA wiper清除DNA；管2除用DEPC水取代逆转录酶以外，其他所有操作与管1一致；管3不使用DNA wiper清除DNA其他步骤与管2除一致。
逆转录完成后，分别取5μL作为检测模板进行数字PCR扩增，每管做3个重复，同时做两个NTC，连续3天，检测结果如表6所示。测48例临床上判为结核阳性的患者痰液样本(取样后一直在-80℃冻存)，按照使用说明书，使用同样的提取试剂盒(领航基因的TF1痰液核酸纯化试剂盒)提取核酸后，同上分别与管1和管3的操作步骤一致做数字PCR检测，结果如表6所示；
表6
Figure BDA0004209760860000102
Figure BDA0004209760860000111
如表6所示，rRNA的检测，可以使结核分枝杆菌的检测值提高60倍左右，且连续三天重复抽提同一样本，做以上实验增加逆转录的检测值均在6000Copies/μL以上，说明rRNA作为靶标稳定性高重复性较好。
表7
Figure BDA0004209760860000112
如表7所示，在真实样本中因为检测rRNA为检测靶标的检测灵敏度远高于DNA，所以大大提高了临床检测率。
(4)不同引物扩增效率比较
分别设计结核分枝杆菌的16s rRNA和Is6110基因引物探针，使用合成的含有目标片段的质粒(质粒结构如下图1)，做qPCR检测结果如下表8所示；
表8引物探针扩增效率检测
0.001ng人工合成模板 0.0001ng人工合成模板 0.00001ng人工合成模板
rRNA Ct＝24.39 Ct＝27.11 Ct＝30.28
Is6110 Ct＝24.73 Ct＝27.36 Ct＝30.12
如表8所示，分别以实施例1筛选的最优引物探针浓度，以上3种人工合成DNA模板的浓度做qPCR，结果浓度每降低10倍，Ct值就增加约3。因为2的3.3次方约等于10，说明在该体系中，实施例1设计的引物探针的扩增效率均接近100％。
(5)与检测mRNA相比重复性较好
提取从合作医院提供的结核患者的痰液样本，按照诺唯赞逆转录试剂盒R312的使用说明书，逆转录20μL；分别取两个500μL无RNA酶的PCR管，按试剂盒使用说明书做逆转录，逆转录完成后，分别取5μL作为检测模板进行数字PCR扩增，管1使用rRNA的引物探针扩增；管2使用Is6110的引物探针扩增，每管做3个重复，同时做两个NTC，连续做3天，检测结果如表9所示；
表9
测试1(Copies/μL) 测试2(Copies/μL) 测试3(Copies/μL)
管1 6573.72 6452.31 6389.42
管2 1028.84 436.29 152.79
NTC 0 0
如表9所示，与使用mRNA相比，使用rRNA作为检测靶标，不仅灵敏度高而且稳定性好。
综上所述，以rRNA和IS6110作为检测靶标，与只检测DNA和只检测mRNA相比，不仅灵敏度高而且稳定性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.引物，其特征在于，具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中任意所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)、(2)或(3)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
2.探针，其特征在于，具有：
(5)、如SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9中任意所示的核苷酸序列；或
(6)、与(5)所示的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(5)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(7)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)、(6)或(7)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，其具有荧光报告基团和/或淬灭基团。
4.引物探针组，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和/或如权利要求2或3所述的探针。
5.如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组在制备检测结核分歧杆菌和/或结核分歧杆菌复合群的核酸的产品中的应用。
6.检测产品，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组以及可接受的助剂或载体。
7.如权利要求6所述的检测产品，其特征在于，以体积份数计，其反应体系包括：
Figure FDA0004209760760000021
所述引物探针混合液包括如权利要求4所述的引物探针组。
8.如权利要求6或7所述的检测产品，其特征在于，以体积份数计，所述引物探针混合液包括：
上游引物0.35份下游引物0.35份探针0.105份；所述上游引物、所述下游引物或所述探针的初始浓度为100μM。
9.检测方法，其特征在于，取如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针、如权利要求4所述的引物探针组和/或如权利要求6至9任一项所述的检测产品对待测样品扩增，检测。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测的检测靶标包括：rRNA或IS6110。
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