CN112553350A - 一种能快速检测多种分枝杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种能快速检测多种分枝杆菌的方法。包括如下步骤：(1)获得患者体液样本，并对体液样本进行处理；(2)提取体液样本核酸；(3)制备试剂；(4)在反应管内加入反应混合液和体液样本核酸，离心；(5)将反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；(6)检测步骤(5)中得到的扩增产物，得到检测结果。本发明利用环介导等温扩增技术自建的体系可快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶发分枝杆菌等6种分枝杆菌，可快速实现结核病和常见非结核分枝杆菌肺病的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种能快速检测多种分枝杆菌的方法。
背景技术
分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌感染人类引发的重大疾病主要包括结核病(tuberculosis,TB)和近年来因发病率不断攀升而备受关注的非结核分枝杆菌病(nontuberculous mycobacterial diseases)。TB是以结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)为代表的结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex,MTC)侵犯全身多个器官和组织引起的慢性传染性疾病，其中以侵犯肺部的肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)最为多见，占结核病总病例数的90％以上。TB为全球十大死亡原因之一，已超越艾滋病成为单种病原体引起死亡最多的感染性疾病。WHO《2019年全球结核病报告》显示，全球目前约有四分之一的人口感染MTB，其中5-10％将最终罹患结核病。中国的结核病发病率高居全球第二，是新增结核病例最多、多药耐药结核病发生率最高的国家之一，有效地遏制结核病的流行刻不容缓。
非结核分枝杆菌病是除MTC和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)以外的分枝杆菌-非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria,NTM)引发的疾病。NTM普遍存在于土壤和水等自然环境中，能够引起肺部、淋巴结、关节、中枢神经系统以及与导管相关的播散性感染。非结核分枝杆菌肺病(Nontuberculous mycobacterial pulmonary disease,NTM-PD)占非结核分枝杆菌病的绝大多数，发病率约为2/10万至78/10万，在全球范围内呈逐年快速增多的趋势。在一些发达国家，NTM-PD的发病率甚至已超过PTB，成为又一个由分枝杆菌引起的严重威胁人类健康的重要公共卫生问题。更为棘手的是NTM-PD的临床症状和体征(咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、气急、盗汗、低热、乏力、消瘦和萎靡不振等)以及影像学特征与PTB十分相似，很多病例在不能及时获得有效的病原微生物学证据的情况下，极易被误诊为PTB，甚至多药耐药PTB。然而，NTM对抗结核药物的天然耐药率非常高，多数NTM对一线抗结核药物的耐药率在60％以上，个别甚至达到80％以上。一旦NTM-PD患者被误诊为PTB，按照抗结核方案治疗必将导致临床症状迁延不愈，终末期患者常因肺组织的持续破坏出现大咯血或呼吸衰竭而死亡。因此，临床诊疗中对NTM-PD和PTB疑似病例精准快速的鉴别十分重要。国内外多个指南和共识明确指出，快速可靠的病原微生物学证据，特别是对分枝杆菌精确到“种水平”的鉴定是鉴别NTM-PD和PTB的关键所在。
目前临床上广泛采用的分枝杆菌分子诊断方法多基于PCR技术和核酸杂交技术构建，因此，需要配备精密热循环装置的昂贵的PCR分析仪和核酸杂交仪，同时需根据相关法规配置完备的实验室条件以及经过严格培训的专业技术人员。且大多数此类项目临床应用中仍存在假阳性率高、检测周期过长及操作繁杂等诸多弊端。最重要的是，基于PCR技术和杂交技术的现行方法不能快速检测结核病和常见分枝杆菌肺病。
发明内容
本发明提供了一种能快速检测多种分枝杆菌的方法。本发明利用环介导等温扩增技术自建的体系可快速检测结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶发分枝杆菌等6种分枝杆菌，可快速实现结核病和常见非结核分枝杆菌肺病的快速检测。
本发明通过下述技术方案实现：
一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)获得患者体液样本，并对体液样本进行处理；
(2)提取体液样本核酸；
(3)制备试剂：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合得；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六；
(4)在多个反应管内分别内加入混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，再在多个反应管内加入体液样本核酸，离心；
(5)将多个反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
(6)检测步骤(5)中得到的扩增产物，得到检测结果。
进一步地，步骤(6)中的检测方法包括色度法，包括如下步骤，
A：将阳性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
将阴性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
B：对步骤A得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液七和混合液八；
C：在2个反应管内分别加入混合液七和混合液八，再向阳性混合液七的反应管内加入体液样本核酸，向阴性混合液八对应的反应管中加入无核酶PCR级纯水，离心；
D：将阳性混合液七和阴性混合液八的反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
E：将含有混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六的反应管与含有混合液七和混合液八的反应管在光照下对比；
则步骤(3)中试剂制备时也需要加入荧光剂。
进一步地，步骤(3)中加入荧光剂的制备方法为：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六。
进一步地，所述荧光剂包括Calcein/钙黄绿素、SYBR Green、Eva Green、HNB。
进一步地，步骤(6)中的检测方法包括试纸检测方法，
体液样本核酸扩增结束后，室温放置，离心，加入TE(Tris-EDTA)缓冲液，混匀，用一次性核酸试纸检测。
进一步地，步骤1中所述患者体液样本包括痰样本和其他体液样本；
所述痰样本的处理方法为：使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH)进行消化灭活15min；
所述其他体液样本的处理方法为：离心富集细菌。
进一步地，步骤(3)中所述的缓冲液包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH4)2SO4。
进一步地，所述结核分支杆菌复合群引物、胞内分枝杆菌引物、鸟分枝杆菌引物、脓肿分枝杆菌引物、堪萨斯分枝杆菌引物和偶发分枝杆菌引物的标记包括FITC(异硫氰酸荧光素)、FAM(6-羧基荧光素)、Biotin(生物素)。
采用上述技术方案，本发明具有如下优点：
1、本发明以环介导等温扩增技术替代了PCR技术和核酸杂交技术，脱离了对精密且昂贵的热循环仪和杂交仪的依赖。
2、本发明以国产Bst DNA聚合酶及自建体系构建了针对结核分枝杆菌复合群及5种非结核分枝杆菌的环介导等温扩增方法，大大降低了试剂成本。
3、本发明利用环介导等温扩增技术自建的体系可同步快速检测结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶发分枝杆菌等6种(群)分枝杆菌，可在1小时内实现结核病和常见(95％以上)非结核分枝杆菌肺病的快速检测。
4、本发明脱离了对大型仪器，甚至中小型实验室仪器的依赖，可以真正做到现场快速检测。
5、本发明基于环介导等温扩增技术，通过多序列比对寻找新的靶基因，以国产BstDNA聚合酶替代国外高成本进口酶等技术手段，构建了新型的、可快速同步检测和鉴定包括结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和山羊分支杆菌，以及常见能够引起人类非结核分枝杆菌肺病的鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌等在内的多种分枝杆菌的低成本、便携式、现场快速检测方法；其中用于检测结核分枝杆菌复合群的环介导等温扩增引物组合基于插入序列6110基因(insert sequence 6110,IS6110)保守区域设计，具有良好的灵敏度和特异性；用于检测鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶发分枝杆菌等非结核分枝杆菌的等温扩增引物组合分别基于插入序列1245基因(insert sequence 1245,IS1245)、16S-23S基因间序列(internal transcribed spacer(ITS)sequence)、MKAN_rs12360、tuf基因和ku基因的菌种特异性序列设计，具有良好的灵敏度和特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明分枝杆菌复合群引物组合的检测灵敏度测定结果；
图2为本发明鸟分枝杆菌引物组合的检测灵敏度测定结果；
图3为本发明胞内分枝杆菌引物组合的检测灵敏度测定结果；
图4为本发明脓肿分枝杆菌引物组合的检测灵敏度测定结果；
图5为本发明堪萨斯分枝杆菌引物组合的检测灵敏度测定结果；
图6为本发明偶发分枝杆菌引物组合的检测灵敏度测定结果；
图7为本发明试纸结构及结果判读示意图。
具体实施方式
以下的说明提供了许多不同的实施例、或是例子，用来实施本发明的不同特征。以下特定例子所描述方式，仅用来精简的表达本发明，其仅作为例子，而并非用以限制本发明。
本发明提供了一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)获得患者体液样本，并对体液样本进行处理；
(2)提取体液样本核酸；
(3)制备试剂：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合得；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六；
(4)在多个反应管内分别内加入混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，再在多个反应管内加入体液样本核酸，离心；
(5)将多个反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
(6)检测步骤(5)中得到的扩增产物，得到检测结果。
需要说明的是，所述阴性对照物和阳性对照物为含有靶基因的质粒。
进一步地，进一步地，步骤(6)中的检测方法包括色度法，包括如下步骤，
A：将阳性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
将阴性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
B：对步骤A得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液七和混合液八；
C：在2个反应管内分别加入混合液七和混合液八，再向阳性混合液七的反应管内加入体液样本核酸，向阴性混合液八对应的反应管中加入无核酶PCR级纯水，离心；
D：将阳性混合液七和阴性混合液八的反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
E：将含有混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六的反应管与含有混合液七和混合液八的反应管在光照下对比；
则步骤(3)中试剂制备时也需要加入荧光剂。
进一步地，步骤(3)中加入荧光剂的制备方法为：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六。
进一步地，所述荧光剂包括Calcein/钙黄绿素、SYBR Green、Eva Green、HNB。
进一步地，步骤(6)中的检测方法包括试纸检测方法，
体液样本核酸扩增结束后，室温放置，离心，加入TE(Tris-EDTA)缓冲液，混匀，用一次性核酸试纸检测。
具体参数控制可以为：体液样本核酸扩增结束后，室温放置10min，3000转/分钟瞬时离心后，打开反应管，取扩增产物1微升，加入50微升TE(Tris-EDTA)缓冲液，混匀后，取一根一次性核酸检测试纸，插入液面垫最上端，待判读区全部浸润(约需30-60秒)，将试纸平放1min，等待红色条带出现(约2min)。如图7所示，根据试纸条显色情况直接读取检测结果。
需要说明的是，本申请的使用的试纸可以使用商品化的产品，现有技术中的试纸即可使用，同时也可以实验室自行制作，只要能达到检测核酸扩增产物的核酸检测试纸条均可，不限于具体品牌和标记。
进一步地，步骤1中所述患者体液样本包括痰样本和其他体液样本；
所述痰样本的处理方法为：使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH)进行消化灭活15min；
所述其他体液样本的处理方法为：离心富集细菌。
进一步地，步骤(3)中所述的缓冲液包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH4)2SO4。需要说明的是，缓冲液的使用包括上述所述Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH4)2SO4，但不限于所述缓冲液。
进一步地，所述所述结核分支杆菌复合群引物、胞内分枝杆菌引物、鸟分枝杆菌引物、脓肿分枝杆菌引物、堪萨斯分枝杆菌引物和偶发分枝杆菌引物的标记包括FITC(异硫氰酸荧光素)、FAM(6-羧基荧光素)、Biotin(生物素)。需要说明的是，引物标记包括并不限于所列举的FITC(异硫氰酸荧光素)、FAM(6-羧基荧光素)、Biotin(生物素)。
在将混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六和体液样本核酸混合时，取6个反应管，先在6个反应管内分别加入20μL混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，然后再加入5μL体液样本核酸。
取2个反应管，在一个反应管中加入20μL混合液七，再加入5μL体液样本核酸，为阳性对照管；在另一个反应管加入20μL混合液八，再加入5μL无核酶PCR级纯水，为阴性对照管。
需要说明的是，在向反应管内加入混合液、体液样本核酸和对照物后，需要将反应管封闭，避免造成气溶胶污染。
在体液样本核酸扩增过程中，保证反应管65℃恒温放置60分钟。
具体方法构建前的设计：
1、靶基因选择及引物筛选
分别以结核分枝杆菌IS6110插入序列(Genebank号:X17348.1)、鸟分枝杆菌IS1245插入序列(Genebank号:L33879.1)、胞内分枝杆菌16S-23S ITS序列(Genebank号:LR031428.1)、堪萨斯分枝杆菌MKAN_rs12360序列、脓肿分枝杆菌tuf基因(CU458896.1_3895075-3896267)和偶发分枝杆菌ku基因(NZ_CP011269.1)为目的序列，同时以人源核糖核酸酶P基因(RNase P)为目的序列，利用序列比对软件Clustal X2挖掘保守和(或)差异序列，再利用在线环介导等温扩增引物设计软件PrimerExplorer V5设计引物，经过一系列在线和实验筛选优化后，最终选定的引物序列如下表所示。
2、灵敏度测定
根据上述筛选得到的针对6个目标菌种(群)的引物，以包含靶目标序列的结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和偶发分枝杆菌等标准菌株的基因组DNA为模板，以100pg/μL为最高浓度，利用无核酶PCR级纯水做10×倍比稀释至1fg/μL，然后以每个浓度作为模板进行环介导等温扩增实验，上样量为1μL，以测定本发明构建的环介导等温扩增体系的灵敏度，结果如图1-6所示。
如图1-6所示，本发明中基于结核分枝杆菌IS6110插入序列、鸟分枝杆菌IS1245插入序列、胞内分枝杆菌16S-23S ITS序列、堪萨斯分枝杆菌MKAN_rs12360序列、脓肿分枝杆菌tuf基因和偶发分枝杆菌ku基因等分别构建的环介导等温扩增体系，在以相应的6种标准菌株基因组DNA作为模板的灵敏度测定结果分别为：结核分枝杆菌10fg/反应、鸟分枝杆菌100fg/反应、胞内分枝杆菌1pg/反应、脓肿分枝杆菌1pg/反应、堪萨斯分枝杆菌100fg/反应、偶发分枝杆菌100fg/反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得患者体液样本，并对体液样本进行处理；
(2)提取体液样本核酸；
(3)制备试剂：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、引物标记、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六；
(4)在多个反应管内分别内加入混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六，再在多个反应管内加入体液样本核酸，离心；
(5)将多个反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
(6)检测步骤(5)中得到的扩增产物，得到检测结果。
2.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(6)中的检测方法包括色度法，包括如下步骤，
A：将阳性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
将阴性对照引物、缓冲液和dNTPs混合；
B：对步骤A得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液七和混合液八；
C：在2个反应管内分别加入混合液七和混合液八，再向阳性混合液七的反应管内加入体液样本核酸，向阴性混合液八对应的反应管中加入无核酶PCR级纯水，离心；
D：将阳性混合液七和阴性混合液八的反应管放置在温度为65℃的环境中，使体液样本核酸发生扩增反应；
E：将含有混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六的反应管与含有混合液七和混合液八的反应管在光照下对比；
则步骤(3)中试剂制备时也需要加入荧光剂。
3.如权利要求2所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(3)中加入荧光剂的制备方法为：
Ⅰ、将结核分支杆菌复合群引物、缓冲液和dNTPs混合；
将胞内分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将鸟分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将脓肿分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将堪萨斯分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
将偶发分枝杆菌引物、缓冲液和dNTPs混合；
Ⅱ、对步骤Ⅰ得到的混合液分别加入荧光剂和Bst DNA聚合酶，振荡、离心得到混合液一、混合液二、混合液三、混合液四、混合液五和混合液六。
4.如权利要求2或3所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：所述荧光剂包括Calcein/钙黄绿素、SYBR Green、Eva Green、HNB。
5.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(6)中的检测方法包括试纸检测方法，
体液样本核酸扩增结束后，室温放置，离心，加入TE(Tris-EDTA)缓冲液，混匀，用一次性核酸试纸检测。
6.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤1中所述患者体液样本包括痰样本和其他体液样本；
所述痰样本的处理方法为：使用N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法(NALC-NaOH)进行消化灭活15min；
所述其他体液样本的处理方法为：离心富集细菌。
7.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的缓冲液包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、KCl、Tris、甜菜碱、Tween、(NH4)2SO4。
8.如权利要求1所述的一种能快速检测多种分枝杆菌的方法，其特征在于：所述结核分支杆菌复合群引物、胞内分枝杆菌引物、鸟分枝杆菌引物、脓肿分枝杆菌引物、堪萨斯分枝杆菌引物和偶发分枝杆菌引物的标记包括FITC(异硫氰酸荧光素)、FAM(6-羧基荧光素)、Biotin(生物素)。
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