CN101942511A

CN101942511A - 原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN101942511A
Application number: CN 201010259678
Authority: CN
Inventors: 叶宇鑫; 石磊
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-08-20
Also published as: CN101942511B

Abstract

本发明公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。本发明根据结核分枝杆菌gyrB基因保守区设计了四条特异性引物，应用这四条引物，同时结合原位荧光环介导恒温核酸扩增技术，能特异性地检测出结核分枝杆菌。本发明实现样品原位检测、无需增菌、特异性高，能在不到2小时完成扩增，最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％。使用本发明所述的方法和试剂盒鉴定结核分支杆菌简便。

Description

原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。

背景技术

目前，结核病是当今世界传染病中的头号杀手，是单因致死率最高的传染性疾病，其主要致病菌为结核分枝杆菌。据世界卫生组织统计，全世界现有结核病人2000万，每年新发生约900万例，每年死亡300万人，约1/3人群有潜伏性结核分枝杆菌感染。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病呈日益严重回升趋势。我国的结核病疫情相当严峻，耐多药结核病、艾滋病合并非结核分支杆菌病的发病呈逐年上升趋势。结核分枝杆菌的大面积出现主要是不合理用药所致，其主要原因是多重耐药结核菌的流行以及人类免疫缺陷病毒感染、器官移植、免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素，使结核分枝杆菌感染难以控制。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制水平，现在迫切需要更为精确快速的诊断新技术用于临床鉴定结核分枝杆菌。

近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测结核分枝杆菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4～8小时)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。

DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：(1)特殊引物要求极为苛刻，限制该方法的广泛应用；(2)需要对细胞或组织破碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；(3)为了满足扩增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；(4)仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足之处和缺陷，提供一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法。

本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)设计引物：设计外引物1对和内引物1对，具体为：

外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；

内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；

内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；

(2)对被检样品进行处理：

A、将被检样品中的菌体进行固定；

B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；

(3)环介导等温扩增反应(LAMP)：

(4)样品复染：反应结束后，用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；

(5)分析判断反应产物结果：置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果；

步骤(2)中所述将被检样品中的菌体进行固定，优选通过以下步骤实现：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000～1200rpm离心2～3分钟，取上清；10000～12000rpm离心3～4分钟沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次；10000～12000rpm离心3～4分钟后，在细胞沉淀中加入体积百分比4％的多聚甲醛，然后静置过夜，多聚甲醛的作用是固定细胞；10000～12000rpm离心3～4分钟后，将细胞沉淀悬浮于磷酸缓冲液，得到细胞悬浮液；细胞悬浮液滴加到用质量百分比为0.03％的多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干；

所述静置的时间优选为16小时；

步骤(2)中所述将增加固定后的菌体的细胞壁通透性，优选通过以下步骤实现：将固定好的细胞分别依次置于体积百分比为50％、80％、100％浓度的乙醇液中各处理1分钟，进行脱水；再用溶菌酶、蛋白酶K、甘氨酸溶液和RNA酶依次处理；

所述溶菌酶的使用浓度优选为0.5mg/ml，处理条件优选为室温下处理细胞45分钟，达到部分降解细胞壁的目的；

所述蛋白酶K的使用浓度优选为0.1μg/ml，处理条件优选为室温下处理细胞5分钟，去除细胞壁以及与DNA结合的蛋白；

所述甘氨酸的使用浓度优选为0.1mol/L，处理条件优选为室温下处理细胞30s，去除蛋白酶K；

所述RNA酶的使用浓度优选为0.5mg/ml，处理条件优选为室温下处理20min，除掉细胞中的RNA，减少对DNA扩增的影响；

步骤(3)中所述的LAMP反应缓冲液按每毫升体积计算，含有320μl 10mMdNTP，200μl 10×ThemoPol Buffer，80μl 150Mm MgSO₄，400μl 5mM Betina；

步骤(4)中所述DAPI的使用浓度优选为1mg/ml；

实现上述方法的试剂盒，包括引物、酶、通透性处理试剂、缓冲液和染料，其中：

所述的引物由一对外引物和一对内引物组成，具体为：

外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；

内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；

内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；

所述的引物优选为将其分别配制成浓度为10pmol/μl的引物溶液；

所述的酶包括Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶和溶菌酶；Bst DNA聚合酶的使用浓度优选为8U/μl；蛋白酶K的使用浓度优选为0.1μg/ml；RNA酶的使用浓度优选为0.5mg/ml；溶菌酶的使用浓度优选为0.5mg/ml；

所述的通透性处理试剂包含多聚甲醛、多聚赖氨酸和甘氨酸；多聚甲醛的使用浓度优选为体积百分比4％；多聚赖氨酸的使用浓度优选为质量百分比0.03％；甘氨酸的使用浓度优选为0.1mol/L；

所述的缓冲液为LAMP反应缓冲和磷酸缓冲液；LAMP反应缓冲液为10mMdNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO₄和5mM Betina按体积比8∶5∶2∶10配制；每升磷酸缓冲液中含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mMNa₂HPO₄和1.5mM KH₂PO₄；

所述的染料为DAPI；使用浓度优选为1mg/ml。

本发明的原理：本发明结合了环介导等温扩增技术与原位荧光杂交技术，是在这两种技术的技术上衍生出来的一种新型技术。该技术利用LAMP反应的高效性，在扩增靶基因的同时，将引物上的Cy3生物荧光染料活性酯结合到大量扩增的目标片段中，并利用Cy3的荧光特性，能够利用不同的光进行激发并产生出相应颜色的光，从而进行结果判断。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)高特异性：本发明根据结核分枝杆菌gyrB基因保守区设计了四条特异性引物，应用这四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99％，假阳性率小于1％。

(2)无需增菌：应用本发明所述方法，在检测之前不需要对待检菌进行培养。

(3)实现样品原位检测：在不增菌的条件下，本发明所述方法能直接对样本中的病原菌微生物进行原位基因扩增。

(4)快速、高效扩增：本发明所述方法在不到2小时即可完成扩增，且产率高。

(5)灵敏度高：本发明所述方法在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％。

(6)鉴定简便：本发明通过荧光显微镜观察细胞是否发荧光进行鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。

附图说明

图1是通过本发明所述方法检测的结核分枝杆菌在紫外光激发光下的图片。

图2是通过本发明所述方法检测的结核分枝杆菌在绿色光激发光下的图片。

图3是未经过处理的结核分枝杆菌在紫外光激发光下的图片。

图4是未经过处理的结核分枝杆菌在绿色光激发光下的图片。

图5是通过本发明所述方法检测的耻垢分枝杆菌在紫外光激发光下的图片。

图6是通过本发明所述方法检测的耻垢分枝杆菌在绿色光激发光下的图片。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)按下列配方配制结核分枝杆菌原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒：

——引物混合液：四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：

外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；

内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；

内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；

——Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；

——蛋白酶K：浓度为0.1μg/ml；

——RNA酶：浓度为0.5mg/ml；

——溶菌酶溶液：0.5mg/ml溶菌酶，100mM Tris-HCl(pH 8.2)，50mMEDTA；

——LAMP反应缓冲液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mMMgSO₄∶5mM Betina按体积比8∶5∶2∶10混合；

——每升磷酸缓冲液：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na₂HPO₄，1.5mMKH₂PO₄；

——通透性处理试剂1：体积百分比为4％的多聚甲醛；

——通透性处理试剂2：质量百分比为0.03％的多聚赖氨酸；

——通透性处理试剂3：0.1mol/L甘氨酸溶液；

——系列浓度乙醇溶液：体积百分比分别为50％、80％、100％的乙醇；

——复染剂：荧光染料1mg/ml DAPI；

以上溶液的溶剂为去离子双蒸水。

(2)用上述试剂盒按以下方法对结核分枝杆菌进行检测，同时用上述试剂盒按以下方法对与结核分枝杆菌类似的耻垢分支杆菌进行检测作为对照：

①被检样品(分别为结核分枝杆菌，Mycobacterium tuberculosis 27294，购买自ATCC；和耻垢分支杆菌，Mycobacterium smegmatis 700084，购买自ATCC)的菌体固定处理：

A、分别取1ml被检样品悬浮于磷酸缓冲液中，制成细胞悬浮液，1000rpm离心2分钟，取上清；

B、12000rpm离心3分钟沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次，然后加入1ml 4％多聚甲醛，固定16h；12000rpm离心3分钟后，将细胞沉淀悬浮于磷酸缓冲液中，得到细胞悬浮液；

C、用步骤B得到的细胞悬浮液20μl滴加到用0.03％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。

②被检样品的细胞壁通透性处理：

A、将步骤①固定好的细胞分别依次置于体积百分比50％，80％，100％浓度的乙醇液中各处理1分钟，进行脱水；

B、用0.5mg/ml浓度的溶菌酶溶液20μl室温下处理细胞45分钟；

C、用0.1μg/ml的蛋白酶K溶液20μl室温下处理细胞5分钟；

D、用0.5mg/ml的RNA酶溶液20μl室温下处理20min；

③环介导等温扩增(LAMP)反应；

④样品复染：反应结束后，将玻片置于1mg/mlDAPI染料中染色12分钟，然后在无菌水中漂洗两次，每次12分钟，自然干。

⑤分析判断反应产物结果：将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，紫外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。

检测结核分枝杆菌的实验结果如图1至图4所示：图1是通过本发明所述方法检测的结核分枝杆菌在紫外光激发光下的图片，可以看见有白色的细菌；图2是通过本发明所述方法检测的结核分枝杆菌在绿色光激发光下的图片，可以看见有发红色光的细菌，其中红色荧光的细胞就是阳性结果；图3是未经过处理的结核分枝杆菌在紫外光激发光下的图片，可以看见有白色的细菌；图4是未经过处理的结核分枝杆菌在绿色光激发光下的图片，图片中没有细菌发光。

检测耻垢分枝杆菌的实验结果如图5至图6所示：图5是通过本发明所述方法检测的耻垢分枝杆菌在紫外光激发光下的图片，可以看见有白色的细菌；图6是通过本发明所述方法检测的耻垢分枝杆菌在绿色光激发光下的图片，图片中没有细菌发光。

在紫外光下经过处理与没有经过处理结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌均可见，但在绿光下只有经过处理的结核分枝杆菌发红光。实验证明本试剂盒能够特异、灵敏的检测出样品中的结核分枝杆菌。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)设计引物：设计外引物1对和内引物1对，具体为：

外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；

内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；

内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；

(2)对被检样品进行处理：

A、将被检样品中的菌体进行固定；

B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；

(3)环介导等温扩增反应：

A、反应体系为：每25μl反应体系含有10pmol外引物1、10pmol外引物2、10pmol内引物1、10pmol内引物2、8单位Bst DNA聚合酶和12.5微升LAMP反应缓冲液，双蒸去离子水补至25μl；

所述LAMP反应缓冲液为10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO₄和5mM Betina按体积比8∶5∶2∶10配制；

B、反应条件为：将配制好的反应体系滴加到步骤(2)处理好的菌体上，聚酯封层，63℃恒温反应2h；

(4)样品复染：反应结束后，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；

(5)分析判断反应产物结果：置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述将被检样品中的菌体进行固定，是通过以下步骤实现的：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000～1200rpm离心2～3分钟，取上清；10000～12000rpm离心3～4分钟沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞三次；10000～12000rpm离心3～4分钟后，在细胞沉淀中加入体积百分比4％的多聚甲醛，然后静置过夜；接着10000～12000rpm离心3～4分钟后，将细胞沉淀悬浮于磷酸缓冲液，得到细胞悬浮液；细胞悬浮液滴加到用质量百分比为0.03％的多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述将增加固定后的菌体的细胞壁通透性，是通过以下步骤实现的：将固定好的细胞分别依次置于体积百分比为50％、80％、100％浓度的乙醇液中各处理1分钟，进行脱水；再用溶菌酶、蛋白酶K、甘氨酸溶液和RNA酶依次处理。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述溶菌酶的使用浓度为0.5mg/ml，处理条件为室温下处理细胞45分钟；

所述蛋白酶K的使用浓度为0.1μg/ml，处理条件为室温下处理细胞5分钟；

所述甘氨酸的使用浓度为0.1mol/L，处理条件为室温下处理细胞30s；

所述RNA酶的使用浓度为0.5mg/ml，处理条件为室温下处理20min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述4′，6-二脒基-2-苯基吲哚的使用浓度为1mg/ml。

6.实现权利要求1～5任一项所述方法的试剂盒，包括引物、酶、通透性处理试剂、缓冲液和染料，其特征在于：

所述的引物由一对外引物和一对内引物组成，具体为：

外引物1：5’-CAGCACGCTAATTACCCGG-3’；

外引物2：5’-CGAGTTTGGTCATCAGCCG-3’；

内引物1：5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT-3’；

内引物2：5’-Cy3-CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG-3’；

所述的酶包括Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶和溶菌酶；

所述的通透性处理试剂包含多聚甲醛、多聚赖氨酸和甘氨酸；

所述的缓冲液为LAMP反应缓冲和磷酸缓冲液；

所述的染料为4′，6-二脒基-2-苯基吲哚。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：

所述的引物是浓度为10pmol/μl的引物溶液；

所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl；

所述蛋白酶K的浓度为0.1μg/ml；

所述RNA酶的浓度为0.5mg/ml；

所述溶菌酶的浓度为0.5mg/ml；

所述多聚甲醛的浓度为体积百分比4％；

所述多聚赖氨酸的浓度为质量百分比0.03％；

所述甘氨酸的浓度为0.1mol/L；

所述磷酸缓冲液的组成如下：每升中含有137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na₂HPO₄和1.5mM KH₂PO₄；

所述4′，6-二脒基-2-苯基吲哚的浓度为1mg/ml。