CN107974511B - 粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括Tar‑1F/Tar‑1R引物对，其中Tar‑1F/Tar‑1R引物对序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示，该引物能够特异识别粉棒束孢，本发明还公开了土壤样品中粉棒束孢污染的方法，土壤样品检测是通过清洗液清洗，再用裂解液、溶菌酶和蛋白酶K处理，经纯化后用于检测，该方法去除了土壤中腐殖酸，防止了因腐植酸螯合Mg2+、HiFi酶或与DNA共价结合对检测结果的影响，准确度好、灵敏度高，还公开了虫体中粉棒束孢污染检测的方法，对冬虫夏草的人工培育过程中粉棒束孢检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢特异性检测试剂盒，还涉及土壤样品中粉棒束孢检测方法。
背景技术
冬虫夏草是指由冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)侵染蝙蝠蛾幼虫而形成的虫菌复合体，是我国传统的名贵中药材。近年来，随着全球气候和青藏高原生态环境变化及冬虫夏草的过度采挖，导致冬虫夏草价格昂贵，野生冬虫夏草资源已濒临枯竭。为了保护青藏高原的生态环境、虫草资源，同时让冬虫夏草为人类健康服务，进行冬虫夏草规模化人工培育迫在眉睫。在冬虫夏草的人工培育过程中，蝙蝠蛾幼虫的饲养是十分重要的一个环节，能否成功的饲养蝙蝠蛾幼虫直接影响冬虫夏草产量。在目前的饲养过程中，粉棒束孢(Isaria farinosa)作为重要的病原，一旦污染饲养环境，将会引起蝙蝠蛾幼虫大批量的死亡，造成严重的经济损失。因此及早检测出环境中和幼虫虫体中的粉棒束孢，对提高人工培养蝙蝠蛾幼虫存活率具有重要作用。
作为一种存在广泛、宿主广泛、致死性强的虫生真菌，粉棒束孢的应用主要作为农业和林业有害昆虫的生物杀虫剂。但随着新兴农业的发展，昆虫饲养也越来越普遍，粉棒束孢作为生物杀虫剂，其污染势必会带来严重的经济损失，但尚未有针对其快速检测的研究。
目前针对粉棒束孢病原的检测，主要通过筛选培养基进行平板培养，继而通过菌落形态进行判定。此方法耗时较长，通常需要数天的培养才能观察；而且对检测人员的经验要求较高，需要准确判定粉棒束孢和其他丝状真菌的差异，主观性较强；此外，由于需要检测粉棒束孢污染的环境多为土壤样品和虫体本身，样品成分复杂，土壤中的其他微生物背景和虫体中的共生菌往往会干扰实验结果，影响实验的灵敏度。
随着现代生物技术的发展，尤其是分子生物学、免疫学和生物信息学等方面的进步，微生物检测的新方法和技术不断涌现。微生物检测方法大致可分为三个方向：生化法、血清免疫法、分子生物学法。生化法通过检测特定微生物的特定代谢产物，来进行微生物鉴定；血清免疫法指抗原抗体特异性反应，相关技术包括荧光抗体技术，酶免疫技术等；分子生物学方法即基因水平的检测，包括核酸杂交法、PCR及其衍生技术等。
由于土壤样品中与粉棒束孢同源关系较近的微生物和虫体中高丰度的自身蛋白背景较深，提取纯化蛋白的工艺较为复杂等因素，在蛋白质水平很难找到合适的靶标进行检测。PCR技术作为研究土壤微生物多样性的分子生物学方法应用较多，解决了传统土壤微生物培养和鉴定上不准确的问题。以PCR为基础的检测方法其优点在于特异性强、灵敏度高、操作简便和省时等。
而基于PCR法的土壤微生物检测也存在一定的局限性，这主要是由于土壤理化性质复杂，其中含有较多的腐殖酸，可以螯合Mg2+、HiFi酶或与DNA共价结合，从而影响检测结果，因此，样品的前期处理，是获得良好的PCR检测结果的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种粉棒束孢特异性检测试剂盒；本发明的目的之二在于提供利用试剂盒检测土壤样本中粉棒束孢的方法；本发明的目的之三在于提供检测虫体中粉棒束孢污染的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、粉棒束孢特异性检测试剂盒，所述试剂盒包括Tar-1F/Tar-1R引物对，所述Tar-1F/Tar-1R引物对序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。
进一步，所述试剂盒还包括ITS5-172/ITS4-95引物对，所述ITS5-172/ITS4-95引物对序列如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示。
进一步，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和ddH2O。
2、利用所述试剂盒检测土壤样本中粉棒束孢污染的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取土壤样品中总核酸；
(2)以步骤(1)提取的总核酸为模板，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示序列为引物进行PCR扩增，若结果为阳性，再将提取的总核酸用SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示序列为引物进行PCR扩增，扩增结果为阳性表明样本中含有粉棒束孢。
进一步，步骤(1)中，提取土壤样品中总核酸方法如下：
1)取土壤样品，加石英砂充分研磨；
2)向研磨样品中加入清洗液，震荡，离心，收集沉淀；重复2次，再加入PBS缓冲液洗涤；所述清洗液各组分浓度如下：6g/L三羟甲基氨基甲烷，5.8g/L EDTA，5.8g/L NaCl，10g/L交联聚维酮，pH＝8.5；
3)向经步骤2)处理的样品中加入裂解液，溶菌酶，蛋白酶K，振荡，充分裂解，离心，收集上清；所述裂解液各组分浓度如下：100mmol pH＝8.0的Tris-HCl，100mmol pH＝8.0的EDTA，100mmol Na3PO4，1.5mol NaCl，50g聚乙烯吡咯烷酮，10g CTAB，pH＝8.0，加水定容至1L；
4)加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心收集上清；
5)加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3mol/L的NaAc，再加入相当于上清液0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀，离心，用体积分数70％的乙醇洗涤，离心，沉淀晾干，最后用水溶解即可。
进一步，步骤(1)中，提取土壤样品中总核酸方法如下：
1)取土壤样品，加石英砂充分研磨；
2)向研磨样品中按重量体积比为0.5：3，单位g/ml，加入清洗液，震荡5min，18～25℃、12000rpm离心5min，收集沉淀，重复2次，加入与清洗液等体积的PBS缓冲液，洗涤一次；
3)向经步骤2)处理的样品中按清洗液：裂解液：溶菌酶：蛋白酶K体积比为3：5：0.5：0.015分别加入裂解液，浓度为20mg/mL的溶菌酶和浓度为20mg/mL的蛋白酶K，振荡10min，37℃水浴30min，8000rpm离心10min，收集上清；
4)上清中加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，18～25℃、12000rpm离心10min，收集上清；
5)向步骤4)所得上清中加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3mol/L的NaAc，再加入相当于上清液体积0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀1h，12000rpm离心10min，用体积分数为70％的乙醇洗涤，12000rpm离心10min，晾干，最后用水溶解。
进一步，步骤(2)中，所述PCR扩增条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min，最后16℃保存。
3.检测虫体中粉棒束孢污染的方法，包括如下步骤：
(1)提取虫体样品中总核酸；
(2)以步骤(1)提取的总核酸为模板，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示序列为引物进行PCR扩增，若结果为阳性，再将提取的总核酸用SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示序列为引物进行PCR扩增，扩增结果为阳性表明样本中含有粉棒束孢。
优选的，包括如下步骤：
1)取检测虫体样品，加石英砂充分研磨；
2)向经步骤1)处理的样品中加入裂解液，溶菌酶，蛋白酶K，振荡，充分裂解，离心，收集上清；所述裂解液各组分浓度如下：100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA，100mmolNa3PO4，1.5mol NaCl，50g/L聚乙烯吡咯烷酮，10g/L CTAB，pH＝8.0，加水定容至1L；
3)加入与上清液等体积的积酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心收集上清；
4)加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3mol/L的NaAc，再加入相当于上清液0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀，离心，用体积分数70％的乙醇洗涤，离心，沉淀晾干，最后用水溶解即可。
本发明的有益效果在于：本发明公开了粉棒束孢特异性检测试剂盒，其含有特异性识别粉棒束孢的引物，样品中其他微生物的背景不敏感，特异性好，灵敏度高；本发明还公开了检测土壤样本中粉棒束孢污染的方法，该方法相较于传统的培养手段检测耗时短，能在一天之内检测出是否存在粉棒束孢污染，检测效果直观，PCR反应后的电泳图谱是否有目的条带，可以直接判断是否存在粉棒束孢，同时由于改进了样品处理方法，能够去除土壤样品中的腐植酸等物质，防止因腐植酸与Mg2+、HiFi酶螯合或与DNA共价结合从而对检测结果的影响，因此准确度高，能够用于检测土壤样品中粉棒束孢污染。本发明还公开检测虫体中粉棒束孢污染的方法，样品处理简单，检测周期短，特异性和灵敏度均高，对虫体粉棒束孢污染具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为检测引物初筛电泳图(1：点青霉；2、草青霉；3：粉棒束孢；4：白僵菌；5：蝙蝠蛾拟青霉；6：蛹虫草；A：09964；B：03924；C：09085；D：08837；E：03220；F：04887；G：04892；H：07208；I：07212；J：03925；K：06294；L：08423-1；M：08423-2；N：08451；O：08460；P：08463；Q：08465-1；R：08465-2；S：08871；T：08846)。
图2为引物Tar-1F/Tar-1R检测草青霉、蛹虫草、蝙蝠蛾拟青霉、粉棒束孢、白僵菌的结果。
图3为Tar-1F/Tar-1R检测土壤中分离的细菌和真菌结果(A：土壤中分离的细菌和真菌进化树；B：细菌检测结果，1：Rahnella sp.；2：Serratia sp.-01；3：Microbacteriumsp.-01；4：Klebsiella sp.；5：Microbacterium sp.-02；6：Bacillus sp.；7：Stenotrophomonas sp.；8：Enterobacteriaceae sp.；9：Erwinia sp.；10：Serratia sp.-02；11：Serratia sp.-03；C：真菌检测结果，1：Penicillium sp.-01；2：Trametes sp.；3：Penicillium sp.-02；4：Penicillium sp.-03；5：Irpex sp.；6：Penicillium sp.-04；7：Trichoderma sp.；8：Cladosporium sp.；9：Ceriporia sp.；10：Ophiocordyceps sp.)。
图4引物对ITS5-172/ITS4-95检测结果。
图5为土壤中粉棒束孢的检测结果(M:DL2000；1：不使用清洗液，使用PBS代替裂解液(土壤中混入粉棒束孢)；2：实施例2方法处理样本(土壤中混入粉棒束孢)；3：实施例2方法处理样本(土壤中混入粉棒束孢和蝙蝠蛾拟青霉)；4：实施例2方法处理样本(土壤中混入蝙蝠蛾拟青霉)；阴：阴性对照(土壤中未混入粉棒束孢)；阳：阳性对照(粉棒束孢基因组作为模板)。
图6为僵化死亡的蝙蝠蛾幼虫中粉棒束孢检测结果(1、2、3、4、5分别表示左图中感染粉棒束孢死亡后虫体，按照实施例4方法处理后，Tar-1F/Tar-1R扩增结果)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明实施例中清洗液、裂解液、PBS缓冲液、3mol/LNaAc溶液、20mg/mL溶菌酶及20％SDS溶液由以下方法配制。
清洗液：6g Tris-Base，5.8g EDTA，5.8g NaCl，10g PVPP，pH＝8.5，加水定容至1L；
裂解液：100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA，100mmol Na3PO4，1.5mol NaCl，50g/L聚乙烯吡咯烷酮，10g/L CTAB，pH＝8.0，加水定容至1L；
PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，0.6g Na2HPO4，0.19g KH2PO4，pH＝7.4，加水定容至1L；
3mol/L NaAc溶液：称取20g NaAc，加水定容至50mL，pH＝5.2；
20mg/mL溶菌酶：称取0.1g溶菌酶，加水定容制5mL；
20％SDS溶液：称取10g SDS，加水定容至50mL，pH自然。
实施例1、特异性靶标的筛选及验证
通过检索粉棒束孢基因组数据，预测其开放阅读框(ORF)，通过比对得到无同源信息的靶标序列。以从蝙蝠蛾幼虫饲养土壤环境中分离的高丰度的细菌、真菌和与粉棒束孢同源性较近的白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)等作为背景。设计105对引物，部分引物序列如表1所示。
表1、粉棒束孢检测引物对
利用设计的引物对分别以点青霉，草青霉，粉棒束孢，白僵菌，蝙蝠蛾拟青霉和蛹虫草基因组DNA进行PCR检测，检测体系如下：模板DNA 1μl，Tar-1F 0.5μl，Tar-1R 0.5μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5μl，ddH2O 10.5μl，总体积25μl；扩增条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min，最后16℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。结果显示，上述引物中08465-1能在粉棒束孢和蝙蝠蛾拟青霉基因组中扩增出目的条带。但是08465-1扩增结果中存在非特异性扩增，将08465-1引物进行优化，获得优化引物对Tar-1F/Tar-1R，具体为：
5’-gtaaagggtctgtgcttgtatgg-3’(SEQ ID NO.41)；
5’-cgttgacgggaatctggaa-3’(SEQ ID NO.42)；
以优化的引物进行检测，结果如图2所示。结果显示，优化的引物Tar-1F/Tar-1R能特异扩增出目的条带，且无非特异性扩增。
然后用引物Tar-1F/Tar-1R检测土壤中分离的细菌和真菌，结果如图3所示。结果显示，土壤中分离得到的细菌和真菌中，检测引物Tar-1F/Tar-1R无法扩增出符合预期大小的目的条带。
为了能够将粉棒束孢和蝙蝠蛾拟青霉更好的区分，通过对粉棒束孢和蝙蝠蛾拟青霉rDNA区域进行分析，设计特异扩增粉棒束孢的引物对ITS5-172/ITS4-95，进行PCR检测，ITS5-172/ITS4-95引物序列如下：
ITS5-172：5’-gtatcttctgaatccgccgcaag-3’(SEQ ID NO.43)
ITS4-95：5’-attactacgcagaggtcgccg-3’(SEQ ID NO.44)
检测体系如下：模板DNA 1μl，ITS5-172 0.5μl，ITS4-95 0.5μl，PrimeSTAR MaxPremix(2×)12.5μl，ddH2O 10.5μl，总体积25μl，扩增条件如上。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。结果显示，引物ITS5-172/ITS4-95仅能在粉棒束孢样品中扩增出条带大小相符的目的条带。
实施例2、土壤样品中粉棒束孢检测体系的建立
提取土壤样品中核酸的方法，包括如下步骤：
1)取500mg土壤样品加入500mg石英砂，充分研磨；
2)向研磨样品中加入3mL清洗液，震荡5min，12000rpm室温(18～25℃)离心5min，弃上清，重复两次，加3mL PBS缓冲液，洗涤一次；
3)向上述洗涤处理的离心管中加入5mL裂解液，500μL溶菌酶(20mg/mL)，15μL蛋白酶K(20mg/mL)，振荡10min，37℃水浴30min，8000rpm离心10min，将上清液转入新的5mL离心管中；
4)上清中加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12000rpm室温(18～25℃)离心10min，收集上清至新离心管；
5)上清中加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3mol/L的NaAc，再加入相当于上清液体积0.6倍体积的异丙醇4℃沉淀1h，12000rpm离心10min，70％乙醇洗涤，12000rpm离心10min晾干，溶于20μL ddH2O作为模版进行PCR检测。
实施例3、土壤中粉棒束孢的检测
按照实施例2的方法提取土壤中总核酸为模板，以Tar-1F/Tar-1R和ITS5-172/ITS4-95为引物进行PCR扩增，扩增体系及扩增条件与实施例1相同。同时分别以不使用清洗液，使用PBS代替裂解液，未加入粉棒束孢，不使用裂解液提取的总核酸为模板进行PCR扩增。扩增结果进行电泳检测，结果如图5所示。结果显示，按照技术方案2给出的步骤，以经清洗液、裂解液处理后提取的土壤中总核酸为模板，以Tar-1F/Tar-1R和ITS5-172/ITS4-95为引物进行PCR扩增能扩增出目的条带。因此，只有使用实施例2的样品处理方法才能实现对土壤中粉棒束孢的检测。
本实施例中，使用ITS5-172/ITS4-95引物的目的是排除样品中含有蝙蝠蛾拟青霉而出现假阳性。
实施例4、僵化死亡的蝙蝠蛾幼虫中粉棒束孢检测
僵化死亡的蝙蝠蛾幼虫中粉棒束孢检测，具体步骤如下：
A)取检测虫体500mg，加入液氮或500mg石英砂充分研磨；
B)加入5mL裂解液，500μL溶菌酶(20mg/mL)，15μL蛋白酶K(20mg/mL)，振荡10min，37℃水浴30min，8000rpm离心10min，将上清液转入新的5mL离心管中；
C)上清中加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12000rpm室温(18～25℃)离心10min，收集上清至新离心管；
D)上清中加入0.1倍体积3mol/L NaAc，0.6倍体积异丙醇4℃沉淀1h，12000rpm离心10min，70％乙醇洗涤，12000rpm离心10min晾干，溶于20μL ddH2O作为模版，Tar-1F/Tar-1R为引物进行PCR扩增，结果如图6所示。结果显示，只有感染粉棒束孢的虫体样本能扩增出目的条带。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 重庆太极医药研究院有限公司
西南大学
<120> 粉棒束孢特异性检测试剂盒及其检测方法
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ggaatgtcca ctcttgctaa cc 22
<210> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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ggtcagtagc gttgtctttg ga 22
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<212> DNA
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attactacgc agaggtcgcc g 21
Claims (9)
1.粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括Tar-1F/Tar-1R引物对，所述Tar-1F/Tar-1R引物对序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。
2.根据权利要求1所述粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括ITS5-172/ITS4-95引物对，所述ITS5-172/ITS4-95引物对序列如SEQ ID NO.43和SEQ IDNO.44所示。
3.根据权利要求1或2所述粉棒束孢特异性检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA聚合酶和ddH2O。
4.利用权利要求1~3任一项所述试剂盒检测土壤样本中粉棒束孢污染的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）提取土壤样品中总核酸；
（2）以步骤（1）提取的总核酸为模板，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示序列为引物进行PCR扩增，若结果为阳性，再将提取的总核酸用SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示序列为引物进行PCR扩增，扩增结果为阳性表明样本中含有粉棒束孢。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，提取土壤样品中总核酸方法如下：
1）取土壤样品，加石英砂充分研磨；
2）向研磨样品中加入清洗液，震荡，离心，收集沉淀；重复2次，再加入PBS缓冲液洗涤；所述清洗液各组分浓度如下：6 g/L三羟甲基氨基甲烷，5.8 g/L EDTA，5.8 g/L NaCl，10g/L交联聚维酮，pH=8.5；
3）向经步骤2）处理的样品中加入裂解液，溶菌酶，蛋白酶K，振荡，充分裂解，离心，收集上清；所述裂解液各组分浓度如下：100mmol pH=8.0的Tris-HCl，100mmol pH=8.0的EDTA，100mmol Na3PO4，1.5mol NaCl，50g 聚乙烯吡咯烷酮，10g CTAB，pH=8.0，加水定容至1L；
4）加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心收集上清；
5）加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3 mol/L的 NaAc，再加入相当于上清液0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀，离心，用体积分数70%的乙醇洗涤，离心，沉淀晾干，最后用水溶解即可。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，提取土壤样品中总核酸方法如下：
1）取土壤样品，加石英砂充分研磨；
2）向研磨样品中按重量体积比为0.5：3，单位g/ ml，加入清洗液，震荡5min，18~25℃、12000 rpm离心5 min，收集沉淀，重复2次，加入与清洗液等体积的 PBS缓冲液，洗涤一次；
3）向经步骤2）处理的样品中按清洗液：裂解液：溶菌酶：蛋白酶K体积比为3：5：0.5：0.015分别加入裂解液，浓度为20 mg/mL的溶菌酶和浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，振荡10min，37℃水浴30 min，8000 rpm离心10 min，收集上清；
4）上清中加入与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，18~25℃、12000 rpm离心10 min，收集上清；
5）向步骤4）所得上清中加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3 mol/L的 NaAc，再加入相当于上清液体积0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀1 h，12000 rpm离心10 min，用体积分数为70%的乙醇洗涤，12000 rpm离心10 min，晾干，最后用水溶解。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述PCR扩增条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，最后16℃保存。
8.检测虫体中粉棒束孢污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取虫体样品中总核酸；
（2）以步骤（1）提取的总核酸为模板，SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示序列为引物进行PCR扩增，若结果为阳性，再将提取的总核酸用SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示序列为引物进行PCR扩增，扩增结果为阳性表明样本中含有粉棒束孢；所述方法是非诊断目的的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，提取虫体样品中总核酸方法如下：
1）取检测虫体样品，加石英砂充分研磨；
2）向经步骤1）处理的样品中加入裂解液，溶菌酶，蛋白酶K，振荡，充分裂解，离心，收集上清；所述裂解液各组分浓度如下：100mmol Tris-HCl，100mmol EDTA，100mmol Na3PO4，1.5mol NaCl，50 g/L聚乙烯吡咯烷酮，10 g/L CTAB，pH=8.0，加水定容至1L；
3）加入与上清液等体积的积酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心收集上清；
4）加入相当于上清液0.1倍体积的浓度为3 mol/L的 NaAc，再加入相当于上清液0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀，离心，用体积分数70%的乙醇洗涤，离心，沉淀晾干，最后用水溶解即可。
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