CN109486970A

CN109486970A - 一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

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Publication number: CN109486970A
Application number: CN201811369192.8A
Authority: CN
Inventors: 陶均; 陈银华; 何朝族; 郑琳琳; 李春霞; 牛晓磊; 冯世鹏
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109486970B

Abstract

本发明公开了一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。本发明基于水稻黄单胞菌基因组特异性分子标记特征，通过比较基因组学方法，获得了水稻黄单胞菌保守的、特异性的DNA片段xcp，采用环介导等温扩增技术成功检测出带病水稻幼苗及种子，而且该检测方法快速、简单、高效。整个检测过程不需要特殊仪器，可在田间及实验室45‑90分钟内完成。该方法灵敏度高，可以检测低至含10个细菌的水稻材料，特异性好，其它病原菌及植物基因组不会对结果造成影响。该方法安全无害，没有有机试剂，没有核酸结合染料，所有试剂可以直接释放到环境中，可以对一切可能的病原菌传播源做检测。

Description

一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

技术领域：

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

水稻(Oryza sativa)是世界上一半以上人口的主要粮食作物，其中大部分人口主要分布于发展中国家(韦淑亚等，2013)。中国是世界上人口最多的国家，且中国的水稻种植广泛，产量最多。水稻的产量对人们的生活影响重大，对社会经济的发展具有重要作用。据了解。在我国大约有60％以上的人以大米作为他们主要的粮食来源，这充分说明了水稻在人们生活中的重要作用。在我国，南方是水稻的主要种植场所，是我国大多数人们赖以生存的“粮仓”，同时也是该区农民经济来源的主要方面，推动经济发展。

粮食安全问题已成为全球性的重要问题。近年来，由于进口、天气、种植面积、病虫害等原因导致小麦和水稻等主要粮食价格大幅上涨。其中，病害是导致水稻减产的重要原因。到目前为止，仍未找到水稻病害有效的防控方法。这些病害主要包括真菌性和细菌性病害。真菌性病害包括：稻瘟病，损失可高达100％(Dean et al.,2005)；纹枯病，可造成水稻减产率高达50％(Zheng et al.,2013)；稻曲病，可造成水稻产量损失高达44％；褐斑病，曾于1942年引起孟加拉较大的饥荒，可造成水稻减产量最高可达到45％(Condon et al.,2013)等。

由细菌性病原菌引起的水稻病害主要包括：白叶枯病，由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起，造成水稻减产量达(10％-50％)(Lee etal.,2005)；水稻细菌性条斑病，由细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起，可使水稻产量减产8％-32％(Bogdanove et al.,2011)。水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)包括水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)两个致病变种。

在细菌性和真菌性病原菌引起的水稻病害中，稻瘟病与白叶枯病是最严重的、最具毁灭性的两种水稻病害，且它们也是植物最重要的10种真菌和细菌疾病之一(Mansfieldet al.,2012)。由黄单胞菌引发的白叶枯病及条斑病每年给我国水稻生产造成严重的经济损失，带菌种子、种苗及腐烂植株是造成细菌病害爆发的重要原因，如何保证种子种苗的无菌特性是减少病害流行的主要因素。因此，在种子及种苗阶段检测是否带有病原菌将极大地减少病害发生。目前还没有特异、高效、简便的在田间快速检测病原菌的方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性强、高效、简便的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

FIP：5’-GGTGGACACCGAGGTGATCATCCGAGCAGTCGGACTACGT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

BIP：5’-GCGAGGACCGTCTGACCGAACGGCTGGAACGAATACTTGA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

Floop：5’-CACGCCTTCGCTGAGTTCGA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

Bloop：5’-ACCCTGCATTTCGGCAAGTT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

F3：5’-GATTCGGCCACGCTGTAC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

B3：5’-TGCTTCTTGCCCTTGTCG-3’(如SEQ ID NO.7所示)。

本发明的第二个目的是提供一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素显色液和检测引物组，所述的检测引物组如下所示：

Floop：5’-CACGCCTTCGCTGAGTTCGA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

Bloop：5’-ACCCTGCATTTCGGCAAGTT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

F3：5’-GATTCGGCCACGCTGTAC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

B3：5’-TGCTTCTTGCCCTTGTCG-3’(如SEQ ID NO.7所示)。

本发明的第三个目的是提供一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：提取水稻样品的基因组DNA作为模板，使用所述的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素显色液及水稻样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，确认水稻样品中是否含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌。

所述的确认水稻样品中是否含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌具体为：若扩增产物有绿色荧光，则水稻样品中含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌；若扩增产物没有绿色荧光，则水稻样品中不含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌。

优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积20μL，包括20mM Tris-Cl、10mMKCl、8mM MgSO₄、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Tween 20、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、0.5mMMnCl₂、25μM钙黄绿素、2pmol/μL Floop、2pmol/μL Bloop、8pmol/μL FIP、8pmol/μL BIP、1pmol/μLF3、1pmol/μL B3、Bst DNA聚合酶10U和基因组DNA 8μL，余量为ddH₂O。

所述的环介导等温扩增反应的反应条件优选为：65℃水浴45分钟。

本发明基于水稻黄单胞菌基因组特异性分子标记特征，通过比较基因组学方法，获得了水稻黄单胞菌保守的、特异性的DNA片段xcp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，采用环介导等温扩增技术成功检测出带病水稻幼苗及种子，而且该检测方法快速、简单、高效。整个检测过程不需要特殊仪器，可在田间及实验室45-90分钟内完成。该方法灵敏度高，可以检测低至含10个细菌的水稻材料，特异性好，其它病原菌及植物基因组不会对结果造成影响。该方法安全无害，没有有机试剂，没有核酸结合染料，所有试剂可以直接释放到环境中，可以对一切可能的病原菌传播源做检测。

附图说明：

图1是利用LAMP技术扩增水稻黄单胞菌特异性DNA；其中，A.以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)基因组DNA为模板，4套引物P1-P4的扩增效果；B.利用P1引物对三种不同黄单胞菌的扩增效果。

图2是水稻黄单胞菌基因组LAMP分析；Xoc，Xoo基因组为模板扩增产物能产生强的绿色荧光。

图3是不同田间来源的水稻叶片基因组的LAMP分析；1-7为不同田间来源的水稻叶片，+：Xoo基因组，-：健康水稻；其中1，2，3和5，6，7都能产生明显的绿色荧光，5，6，7荧光强度几乎与正对照(Xoo基因组)相同，表明这6个不同地方的水稻叶片含有水稻黄单胞菌。

图4是不同来源的水稻种子基因组的LAMP分析；1-6为不同来源的水稻种子，+：Xoo基因组，-：ddH₂O；其中3和5号能产生明显的绿色荧光，表明这两份水稻种子还有水稻单胞菌污染。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1材料与方法

1.1材料：

带病水稻种子及叶片采自海南省海口市罗牛山农场，水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌为实验室保存，化学试剂购自广州化学试剂公司和Sigma-Aldrich，DNA聚合酶及扩增相关试剂购自New England Biolabs。引物如表1所示，由生工生物工程有限公司合成。

表1.本研究所用P1引物

1.2设备：

1.5mL离心管，0.2mL PCR管，台式常温离心机，旋涡震荡仪，移液器，tip头，电泳设备。

1.3方法：

1.3.1水稻总基因组提取

提取缓冲液(Buffer DL)：50mM Tris-CL(pH7.8)，0.35mM山梨醇，5mM EDTA，1％巯基乙醇，1％CTAB，5mM NaCl。

1a.水稻幼苗：用剪刀剪取2-3cm叶片，充分剪碎，加入少量石英砂，再加入100μLBufferDL，电动研磨器研磨2min，放在95℃水浴5min，取出混匀，静止2min，取10μL上清加入990μL ddH₂O，充分混匀，95℃水浴5min，立即放冰上备用，得到水稻幼苗的基因组提取液。

1b.水稻种子：取3-5粒种子放入1.5mL离心管中，加入100μL Buffer DL，95℃水浴5min，电动研磨器研磨2min，再放在95℃水浴3min，取出混匀，静止2min，取10μL上清加入990μL ddH₂O，充分混匀，95℃水浴5min，立即放冰上备用，得到水稻种子的基因组提取液。

1.3.2等温扩增(LAMP)检测

表2.MixA(2×)的配方

表3.MixB(10×)的配方

成分	浓度
		Floop	20pmol/μL
Bloop	20pmol/μL
		FIP	80pmol/μL
BIP	80pmol/μL
		F3	10pmol/μL
B3	10pmol/μL
		Bst DNA polymerase	10U/2μL

表4.LAMP反应体系

检测类别	Mix A(2×)	Mix B(10×)	模板DNA	总体积
					正对照	10μL	2μL	Xoo基因组8μL	20μL
样品	10μL	2μL	基因组提取液8μL	20μL
					负对照	10μL	2μL	ddH<sub>2</sub>O 8μL	20μL

对照上表2和3配制Mix A(2×)和Mix B(10×)，对照上表4在装有10微升Mix A(2×)的PCR管中加入2微升Mix B(10×)及8微升基因组提取液或水，用移液器反复吸打5次，充分混匀，65℃水浴45分钟，取出观察颜色变化，与负对照(没有绿色荧光)比较，有绿色荧光即为阳性。

2结果与讨论

2.1高效引物的筛选

通过已经测序的水稻黄单胞菌基因组序列比对分析，并与其它细菌和水稻基因组做比较，筛选水稻黄单胞菌保守的、特异性的DNA片段xcp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。根据此特异性DNA设计用于LAMP的6条引物，共设计4套引物(P1-P4引物)。通过筛选获得了2套能高效扩增xcp的引物(P1和P2引物)，其中1套(P1引物)的效率最好，扩增效果如图1A所示。将P1引物(见表1)再检测Xoc及野油菜黄单胞菌(Xcc)，发现其能有效扩增Xoc，但不能扩增Xcc(图1B)，表明该引物具有高度水稻黄单胞菌特异性。

xcp序列(如SEQ ID NO.1所示)：

AGCACAAGGACCAAGTGCCGATCATTGCCTGGTCGTGGGGCACCAGCAACACCGGCAACCTGCATACCGGCGCCGGGTATGCAGCCGGCGGCAAGGCCAATGTGAAGGATATTTCCATCACCAAGTACGTCGATAGTTGCTCCAATGCCTTGCTCAACGCCTGCTGCACGGGTGCGCGTGTGGATTCGGCCACGCTGTACGTCACCAACGCCACCGGCGAGCAGTCGGACTACGTGACGATCGAACTCAGCGAAGGCGTGATGATCACCTCGGTGTCCACCGGCGGTAGCGGTGGCGAGGACCGTCTGACCGAAAACGTGACCCTGCATTTCGGCAAGTTCAAGTATTCGTTCCAGCCGCAGGACGACAAGGGCAAGAAGCAGGGCGGCACCAAGGAC

2.2带菌水稻叶片及种子的检测

为检测上述LAMP方法是否能够用于田间带病水稻的检测，我们首先采用人工接种病原菌的方法，在接种3天后剪取水稻叶片提取基因组并进行检测，发现无论接种水稻白叶枯病菌还是细菌性条斑病菌，接种水稻叶都能呈现阳性结果，而接种水的结果为阴性(图2)，这说明该方法可以很好地检测带病水稻。然后我们将采自田间的疑似病害的叶片进行检测，发现仍能高效地检测出病原菌。在7份样品中，共有6份(NO.1、2、3、5、6、7)检测出疑似病原菌感染(图3)，后期跟踪发现，检测出病原菌的稻田均感染白叶枯病。这说明该法可用于前期水稻细菌性病害的预警。

我们也利用此法检测了不同来源的水稻种子。首先6种不同来源种子每一来源随机挑选5粒，按上述方法提取DNA，进行LAMP检测，结果发现其中2份(NO.3和5)显示阳性(图4)。然后将这6份种子挑选20粒种植，2个月后发现，检测阳性种子的水稻90％感染白叶枯病菌。这说明我们发明的检测方法也能用于种子的检疫，有很好的应用前景。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> DNA

<213> 水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)

<400> 1

agcacaagga ccaagtgccg atcattgcct ggtcgtgggg caccagcaac accggcaacc 60

tgcataccgg cgccgggtat gcagccggcg gcaaggccaa tgtgaaggat atttccatca 120

ccaagtacgt cgatagttgc tccaatgcct tgctcaacgc ctgctgcacg ggtgcgcgtg 180

tggattcggc cacgctgtac gtcaccaacg ccaccggcga gcagtcggac tacgtgacga 240

tcgaactcag cgaaggcgtg atgatcacct cggtgtccac cggcggtagc ggtggcgagg 300

accgtctgac cgaaaacgtg accctgcatt tcggcaagtt caagtattcg ttccagccgc 360

aggacgacaa gggcaagaag cagggcggca ccaaggac 398

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggacacc gaggtgatca tccgagcagt cggactacgt 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgaggaccg tctgaccgaa cggctggaac gaatacttga 40

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacgccttcg ctgagttcga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accctgcatt tcggcaagtt 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gattcggcca cgctgtac 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcttcttgc ccttgtcg 18

Claims

1.一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：

FIP：5’-GGTGGACACCGAGGTGATCATCCGAGCAGTCGGACTACGT-3’；

BIP：5’-GCGAGGACCGTCTGACCGAACGGCTGGAACGAATACTTGA-3’；

Floop：5’-CACGCCTTCGCTGAGTTCGA-3’；

Bloop：5’-ACCCTGCATTTCGGCAAGTT-3’；

F3：5’-GATTCGGCCACGCTGTAC-3’；

B3：5’-TGCTTCTTGCCCTTGTCG-3’。

2.一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素显色液和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组如下所示：

FIP：5’-GGTGGACACCGAGGTGATCATCCGAGCAGTCGGACTACGT-3’；

BIP：5’-GCGAGGACCGTCTGACCGAACGGCTGGAACGAATACTTGA-3’；

Floop：5’-CACGCCTTCGCTGAGTTCGA-3’；

Bloop：5’-ACCCTGCATTTCGGCAAGTT-3’；

F3：5’-GATTCGGCCACGCTGTAC-3’；

B3：5’-TGCTTCTTGCCCTTGTCG-3’。

3.一种水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取水稻样品的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、钙黄绿素显色液及水稻样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应，确认水稻样品中是否含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌。

4.根据权利要求3所述的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的确认水稻样品中是否含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌具体为：若扩增产物有绿色荧光，则水稻样品中含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌；若扩增产物没有绿色荧光，则水稻样品中不含有水稻白叶枯病菌或细菌性条斑病菌。

5.根据权利要求3所述的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应体系总体积20μL，包括20mM Tris-Cl、10mM KCl、8mM MgSO₄、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Tween 20、0.8M甜菜碱、1.4mM dNTPs、0.5mM MnCl₂、25μM钙黄绿素、2pmol/μL Floop、2pmol/μL Bloop、8pmol/μL FIP、8pmol/μL BIP、1pmol/μL F3、1pmol/μL B3、BstDNA聚合酶10U和基因组DNA 8μL，余量为ddH₂O。

6.根据权利要求3所述的水稻黄单胞菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应的反应条件为：65℃水浴45分钟。