CN104313128A

CN104313128A - 基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物

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Publication number: CN104313128A
Application number: CN201410456539.8A
Authority: CN
Inventors: 郑小波; 陆辰晨; 王源超; 张海峰
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2014-09-09
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2034-09-09
Also published as: CN104313128B

Abstract

本发明公开了基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物。用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。本发明所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。本发明的检测体系在62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆禾谷镰孢菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆禾谷镰孢菌的现场检测。

Description

基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基于环介导等温扩增技术检测禾谷镰孢菌的方法及引物组合物。

背景技术

大豆镰刀菌根腐病主要危害大豆根系，影响作物对水分和养分的吸收。此病的发生可使大豆植株的根活性、根重、根瘤重、固氮酶活性以及侧根数等均受到不同程度的影响，最早是由Crommell在1917年报道于美国。据调查病害该病可使大豆一般减产10％‐30％，严重时可达60％。现已知该病分布于中国、美国、印度、日本及菲律宾等国，是严重影响我国东北和黄淮海地区大豆生产的重要病害，在黑龙江省三江平原尤为严重。

大豆镰刀菌根腐病可由多种镰孢菌侵染引起，迄今中国已报道的镰孢菌有尖孢镰孢菌(F.oxysporum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、燕麦镰孢菌(F.aveneum)、半裸镰孢菌(F.semitectum)等。本发明针对大豆禾谷镰孢菌的分子检测进行了一系列的研究。

传统真菌菌种鉴定方法主要以形态学为依据，将菌种鉴定到纲、目、科、属、种。然而真菌的形态特征复杂，且有些菌类形态特征和生理生化特征随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不一致。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

随着生物化学、遗传学以及分子生物学的发展，为真菌的分类鉴定提供了技术条件。同工酶分析、RFLP、PFGE、RAPD以及DNA序列分析等技术为研究真菌的遗传变异提供了有利的手段。应用特导性的引物PCR扩增真菌DNA是一种较常规技术，具有灵敏度高、快速的特点。

目前用于检测大豆禾谷镰孢菌的方法有PCR，Real‐time PCR，分子标记等，虽然这些方法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是需要依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop‐mediated isothermal amplification,LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。

此外，普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过加入SYBR Green I观察颜色和荧光变化便可直接判断结果，大大降低了对实验人员的伤害，并且增加了在田间的应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中大豆禾谷镰孢菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆禾谷镰孢菌的问题，而提供了大豆禾谷镰孢菌新的分子检测方法，对大豆禾谷镰孢菌进行LAMP检测，检测周期短(仅需1h)、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

SEQ ID NO.1所示的大豆禾谷镰孢菌CYP51c基因序列作为靶标在LAMP检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。

用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。

本发明所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。

本发明所述的引物组合物在制备大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。

一种检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，含有本发明所述的引物组合物。

所述的检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，优选包含检测溶液以及染料SYBR Green I；其中所述的检测溶液由：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4％Triton X‐100、Bst DNA polymerase320单位/mL，加入超纯水制备得到。

一种检测大豆禾谷镰孢菌的方法，取待检微生物DNA，以该DNA为模板，利用本发明所述的引物组合物进行LAMP；扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日光下目测或在245nm波长紫外光照射观察荧光；以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：日光下目测呈黄绿色表示检测结果为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，日光下目测呈黄色表示检测结果为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌；紫外光下，发强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧光表示检测为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌。

8、根据权利要求7所述的检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于LAMP反应程序为：62℃，60min。

有益效果

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)，然而许多学者认为该靶标不能够很明确的区分镰孢属真菌。

CYP51基因编码的甾醇14α‐去甲基化酶是分布最广的细胞色素P450家族成员，是生物甾醇合成过程中的关键酶。在人类基因和植物病原真菌中发现了多个拷贝的CYP51基因，如曲霉菌、稻瘟菌等中含有两种拷贝CYP51A、CYP51B。另外还存在第三种拷贝CYP51C，被发现特异地存在于镰孢菌种基因中。发明人以普通PCR技术检测大豆尖孢镰孢菌的研究中发现，CYP51C基因序列在Fusarium种内不同菌株间高度保守，种间存在丰富的变化，是相比rDNA‐ITS、β‐tubulin序列更好的分子检测靶标。

本发明分析了大豆禾谷镰孢菌CYP51C基因和其他镰孢菌在序列上的差异，选取特定区域，设计了四条特异性的LAMP引物和一条环引物，在此基础上建立了检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP体系。

本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：

(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过SYBR Green I的颜色和荧光变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。

(2)恒温扩增。不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

(3)准确性高。由于传统大豆禾谷镰孢菌检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明根据大豆禾谷镰孢菌的CYP51C序列，该序列在大豆禾谷镰孢菌中的基因组中非常保守，利用Bioedit软件将大豆禾谷镰孢菌的CYP51C序列和其他镰孢菌的CYP51C序列进行比较，选取大豆禾谷镰孢菌特有的一段CYP51C序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。

说明书附图

图1LAMP检测大豆禾谷镰孢菌阳性结果和阴性结果示意图。其中，作左图为目测结果图，右图为紫外光下观测结果；每幅照片中左边的EP管为阳性结果，右边的EP管为阴性结果。

图2LAMP检测大豆禾谷镰孢菌的特异性

通过对镰孢属8个其它种的菌株共计180个菌株，以及和10个其它属病原菌菌株共计57个菌株进行了LAMP扩增，特异性LAMP反应只能在供试的F.graminearum菌株中产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光(1‐3：大豆禾谷镰孢菌菌株；4：层出镰孢菌；5：木贼镰孢菌；6：尖孢镰孢菌；7：茄腐镰孢菌；8：雪腐镰孢菌；9：燕麦镰孢菌；10：串珠镰孢菌；11：黄色镰孢菌；12：米曲霉菌；13：链格孢菌；14：胶胞炭疽菌；15：平头炭疽菌；16：大豆锈菌；17：大豆拟茎点肿腐病菌；18：大豆疫霉菌；19：大豆炭腐病菌；20：稻瘟菌；21：油瓶霉菌；22：阴性对照。)上两排为目测结果，下两排为紫外光下观测结果。

图3LAMP检测大豆禾谷镰孢菌的灵敏度

LAMP扩增不同浓度基因组DNA；25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA的扩增结果。

颜色和荧光判定LAMP检测大豆禾谷镰孢菌菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色并有强烈的绿色荧光，阴性对照为黄色，不显荧光。结果表明LAMP反应的灵敏度达到100pg。第一排为目测结果，第二排为紫外光下观测结果。

图4LAMP检测发病植株中的大豆禾谷镰孢菌

取被禾谷镰孢菌侵染的大豆植物组织，提取基因组，进行LAMP扩增。颜色和荧光判定LAMP 反应能够检测侵染植物中的禾谷镰孢菌。(1‐4：发病植株；5：禾谷镰孢菌基因组；6：健康植株；7：空白阴性对照。)第一排为目测结果，第二排为紫外光下观测结果。

具体实施方式

实施例1田间采集植株中检测大豆禾谷镰孢菌

大豆禾谷镰孢菌检测试剂盒，包括以下成分：

大豆禾谷镰孢菌LAMP分子检测的四条特异性引物FIP、BIP、F3、B3和一条环引物LB：

F3(正向外引物)：GGGATCCTCATCGTTGGGA(19bp，SEQ ID NO.4)；

B3(反向外引物)：AGGCTGTTCAATGTGAACCA(20bp，SEQ ID NO.5)；

FIP(正向内引物)(F1C+F2)

TGACGGATTTGCTCATCACCCCGAAGACCGCCGAAGATGG(40bp，SEQ ID NO.2)；

BIP(反向内引物)(B1C+B2)：

TTGCCCTTTGGAGCTGGACGGTGGCAACAATAGCTCCCA(39bp，SEQ ID NO.3)。

LB(环引物)：ACATCGATGTGTTGGCGAGAATTA(24bp，SEQ ID NO.6)

试剂盒反应体系

1mL检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mM MgSO4、4％Triton X‐100、Bst DNA polymerase 320单位，加入超纯水制备成1mL检测溶液；染料SYBR Green I 25μL。保存期限为1年。

实施例2

为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆禾谷镰孢菌菌株，与禾谷镰孢不同种的镰孢菌菌株(层出镰孢菌；木贼镰孢菌；尖孢镰孢菌；茄腐镰孢菌；雪腐镰孢菌；燕麦镰孢菌；串珠镰孢菌；黄色镰孢菌)，以及与大豆尖镰孢不同属的菌株(米曲霉菌；链格孢菌；胶胞炭疽菌；平头炭疽菌；大豆锈菌；大豆拟茎点肿腐病菌；大豆疫霉菌；大豆炭腐病菌；稻瘟菌；油瓶霉菌)的DNA作为模板，取4μl DNA溶液，利用实施例1的检测试剂盒，进行LAMP反应，LAMP反应程序为：62℃，60min，扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日光下目测或在245nm波长紫外光照射观察荧光。结果显示用LAMP引物去扩增大豆木贼镰孢菌的DNA模板时，产生黄绿色的颜色变化与产生绿色荧光；而其他的菌株与阴性对照一样，没有颜色变化或者强烈的绿色荧光(图2)。

实施例3

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的大豆禾谷镰孢菌菌株的DNA用分光光度计测定浓度(1μg/μl)后用DEPC水进行10倍比稀释，‐70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液4μL作为模板，按实施例2的方法，进行LAMP反应和结果观察。结果显示LAMP方法可以检测到浓度是100pg的大豆禾谷镰孢菌的DNA(图3)

实施例4从海关进境大豆带菌土样中检测大豆禾谷镰孢菌：

上述大豆禾谷镰孢菌检测试剂盒用于检测大豆禾谷镰孢菌的方法，包括：

1)土壤中卵孢子的富集：

取待检土壤样品20克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。

2)从微量卵孢子中提取DNA：

将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min‐1转速下离心5分钟，倒出液体；

加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；

加入等体积氯仿抽提，在12000r·min^‐1转速下离心10分钟，吸取上清；

加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r·min^‐1转速下离心10分钟，倒干液体；

加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r·min^‐1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；

加10μL无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。

3)大豆禾谷镰孢菌LAMP检测，包括：

(1)大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测：取4μL DNA溶液，加入18μL试剂盒溶液和3μL灭菌去离子水，总体积为25μL；

(2)反应程序为：62℃，60min；

(3)扩增产物的检测：扩增后加入0.25μL染料SYBR Green I作为反应指示剂，肉眼观察，以及245nm波长紫外光照射观察荧光。以SYBR Green I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准。日光下，黄绿色表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，黄色表示检测结果为阴性；紫外光下，强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧光表示检测为阴性。

实施例5从发病大豆组织中鉴定大豆禾谷镰孢菌

将被病原物侵染的大豆叶片或根茎部位用70％酒精消毒后，采用改进的NaOH法提取DNA。取一段新发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5mol/L NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的离心管中，12000r·min^‐1转速下离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mmol/L Tris(pH8.0)，混匀后吸取4uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行LAMP反应，结果见图4，可见发病植株管在日光下目测为黄绿色，紫外光下产生绿色荧光，与禾谷镰孢菌基因组管的颜色相同；证明所检测的病原为大豆禾谷镰孢菌；而健康植株和空白阴性对照则在日光下目测为黄色，紫外管辖无荧光。

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的大豆禾谷镰孢菌CYP51c基因序列作为靶标在LAMP检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。

2.用于检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP、SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.6所示的环引物LB组成。

3.权利要求2所述的引物组合物在检测大豆禾谷镰孢菌中的应用。

4.权利要求2所述的引物组合物在制备大豆禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。

5.一种检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述的引物组合物。

6.根据权利要求5所述的检测大豆禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含检测溶液以及染料SYBR Green I；其中所述的检测溶液由：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris‐HCl(pH 8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)₂SO₄、0.24mM MgSO₄、4％Triton X‐100、Bst DNA polymerase 320单位/mL，加入超纯水制备得到。

7.一种检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于取待检微生物DNA，以该DNA为模板，利用权力要求2所述的引物组合物进行LAMP；扩增反应结束后，加入染料SYBR Green I，日光下目测或在245nm波长紫外光照射观察荧光；以SYBRGreen I的颜色变化和荧光强弱做为结果判定标准：日光下目测呈黄绿色表示检测结果为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，日光下目测呈黄色表示检测结果为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌；紫外光下，发强烈的绿色荧光表示检测为阳性，存在大豆禾谷镰孢菌，没有荧光表示检测为阴性，不存在大豆禾谷镰孢菌。

8.根据权利要求7所述的检测大豆禾谷镰孢菌的方法，其特征在于LAMP反应程序为：62℃，60min。