CN105256049B - 一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用 - Google Patents

一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。所述的引物组合物由SEQ ID NO.2所示的正向外引物CYP51C‑F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物CYP51C‑B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物CYP51C‑FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物CYP51C‑BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物CYP51C‑LF，SEQ ID NO.7所示的环引物CYP51C‑LB组成。本发明解决了现有黄色镰孢菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性偏低的问题，所需检测时间短(仅需85min)、特异性强、灵敏度高、可肉眼观察检测结果。

Description

一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用。
背景技术
大豆根腐病是一种由多种病原菌引起的，造成大豆根部及茎基部腐烂的病害的通称。其分布广、危害重、病原物种类多达十几种且所致病害症状不易区别，防治困难，是大豆生产中最严重的病害之一。大豆镰孢根腐病是由镰孢属真菌引起的大豆根腐病，于1917年由美国的Crommell首次报道[1-3]，目前已经在中国[4-6]、美国[7]、印度、菲律宾及日本等国报道发生，是我国东北和黄淮海地区大豆产区的重要病害。大豆镰孢根腐病在大豆整个生育期均可发病，感病植株首先从根尖开始变色，初期呈水浸状，然后变成褐色，病株的根以及茎基部产生褐色椭圆形、长条形至不规则形凹陷斑，并逐渐扩展成环绕主根的大斑块，有时还会为害侧根。病菌主要为害表皮及皮层，使其变黑坏死，有时根和茎的中下部维管束变为淡褐色，在潮湿条件下，病部表皮会有白色或粉红色霉层，严重时主根下半部全部烂掉，造成整株死亡。幼苗期主根病斑呈红褐色、铁锈色或黑褐色，重病株的主根和须根腐烂，造成“秃根”；成株期病株根部形成褐色斑，病重时根系开裂，植株的地上部叶片由下而上逐渐发黄，感病植株有矮化现象；花期和荚期为发病高峰期，此时发病，根系腐烂，田间出现大量黄叶，病株矮化，结荚少，籽粒小并且产量严重降低[8-11]。近年来，该病的发生呈现扩大蔓延、加重危害的趋势，对大豆生产造成很大威胁。
迄今为止，我国已报道的可以引起大豆镰孢根腐病的病原菌有：尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、三线镰孢菌(F.tricinctum)、燕麦镰孢菌(F.avenaceum)、半裸镰孢菌(F.semitecteum)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)等[12-15]。魏巍等[16]结合DGGE条带克隆测序及系统发育分析从大豆根腐病样本中鉴定到黄色镰孢菌(F.culmorum)，我们也从发生根腐病的大豆植株上分离到了黄色镰孢菌。由于镰孢菌常在大豆植株上发生复合侵染，而且依据形态特征不易鉴别，因此针对黄色镰孢菌的快速分子检测，我们进行了一系列的研究。
黄色镰孢菌是非常重要的引起谷类根腐病和赤霉病的土传真菌[17]。黄色镰孢菌可以侵染小麦引起小麦赤霉病[18]、小麦根腐病，侵染玉米引起玉米穗腐病[19]，还能寄生于黄春菊、翠菊、甜椒、番茄、四季豆、矮荚菜豆等。该菌广泛分布于世界各地，许多欧洲国家、澳大利亚都有发生，我国的青海[18]、甘肃[19]、山西[20]以及黄淮海地区都有发生。黄色镰孢菌在25℃条件下，PDA培养基上培养3d后，菌落直径达90mm，气生菌丝絮状而茂盛，表面浅黄色，后期产生紫红色色素；用1％CMC培养基摇菌(25℃，120rpm)，5d后产生大量大型分生孢子[21]，长镰刀形，中上部膨大弯曲，顶细胞渐尖，足细胞不明显，3-5分隔，无小型分生孢子。黄色镰孢菌可产生T-2，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(DON)，雪腐镰孢菌烯醇(NIV)，玉米烯酮(ZEN)和玉米赤霉烯酮(ZOH)等毒素[22]，能引起人畜中毒。
传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特征、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰[23]，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效的控制。近年来，分子生物学技术如普通PCR的方法已逐步应用到各种病原菌的研究中。但如今，普通PCR已经是陈旧的技术且具有很多缺陷，例如检测耗时偏长，对靶基因区段识别位点较少，误检率偏高，检测特异性与灵敏度偏低，检测过程较繁琐等。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会于2000年发明的一种新的核酸扩增技术[24]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异性的引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下引起自循环链置换反应，经过60～65℃恒温扩增30～85min，就能大量合成目标DNA。LAMP的反应产物可通过浊度仪观测，反应后加入SYBR Green I或反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)等方法，来判断结果。HNB是金属离子Mg2+的滴定剂，其颜色随着反应液的pH变化而变化，因此可以通过检测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。阳性样品溶液颜色由紫色变为天蓝色，阴性样品溶液颜色保持紫色不变。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通的水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，因此检测成本大大降低。
靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。普通PCR常用的靶标基因，如核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed space，ITS)[25]不能在种的水平上准确的区分镰孢菌属真菌。通过查找相关文献，选取多种在种内保守、种间存在丰富变化的潜在的靶标基因。本发明最终将黄色镰孢菌的CYP51C特异区段作为靶标基因序列，设计筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物，并在此基础上建立了基于颜色判定的简便、快速和灵敏的黄色镰孢菌的LAMP检测体系。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种检测黄色镰孢菌的环介导等温扩增引物组合物。
本发明的另一目的是提供该引物组合物的应用。
本发明的又一目的是提供一种检测黄色镰孢菌的LAMP试剂盒。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于LAMP检测黄色镰孢菌的引物组合物，由SEQ ID NO.2所示的正向外引物CYP51C-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物CYP51C-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物CYP51C-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物CYP51C-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物CYP51C-LF，SEQ ID NO.7所示的环引物CYP51C-LB组成。
本发明所述的引物组合物在检测黄色镰孢菌中的应用。
本发明所述的引物组合物在制备黄色镰孢菌检测试剂中的应用。
一种用于检测黄色镰孢菌的LAMP试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。
所述的LAMP试剂盒优选包含：2.5μL 10×ThermoPol Buffer，8mM MgSO4，1.2mMdNTPs，内引物FIP和BIP各1.6μM，外引物F3和B3各0.4μM，环引物LF和LB各0.8μM，0.8M甜菜碱，0.1％Trion-X，20mM Tris-HCl(PH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)SO4，8U·μL-1Bst DNA聚合酶，180mM HNB组成的检测溶液。
一种LAMP检测黄色镰孢菌的方法，包括取24μL所述的检测溶液，加入2μL待检DNA溶液，总体积为26μL进行LAMP反应；反应程序为：62℃，85min；反应后观察溶液颜色变化，如果反应管变为天蓝色，则表示存在黄色镰孢菌，为紫色则表示不存在黄色镰孢菌，或所含黄色镰孢菌未达到检测限。
本申请文件中所述的“阳性”表示存在黄色镰孢菌，“阴性”表示不存在黄色镰孢菌或所含黄色镰孢菌未达到检测限。
本发明详述：
1.引物的设计
靶标基因的选取和引物的筛选是LAMP检测的关键因素。首先查找相关文献选取潜在靶标，如TEF-1α(translation elongation factor 1 alpha gene)、RPB1(RNApolymerase II subunit 1)、TUB2(tubulin beta-2 chain gene)、TRI5(trichodienesynthase 5 gene)、TOP2(topoisomerase II gene)、Hyd5(hydrophobin 5 precursorgene)、CYP51C(甾醇14α脱甲基酶基因的第3种拷贝)等。在NCBI网站查找并下载黄色镰孢菌及其相近种的靶标序列，然后使用BioEdit软件进行序列比对，依次比对筛选各个靶标，我们在序列比对分析时发现CYP51C基因在种内不同菌株间高度保守，种间有明显差异，因此将CYP51C基因作为检测黄色镰孢菌的备选靶标之一。在黄色镰孢菌的CYP51C序列(SEQ IDNO.1)中选取一段特异序列作为目标序列(200～400bp)，用Primer Explore V4软件在线设计引物。根据引物长度、引物自由能及GC含量等，从软件设计的多组引物中选取部分进行筛选。我们需要对种内不同来源的菌株进行通用性试验，与属内相近种以及属间多种病原菌进行特异性试验等大量工作，最终才能筛选出一组通用性好、特异性强、灵敏度高，能快速准确地检测出黄色镰孢菌的引物。
2.引物筛选及验证过程
(1)通过通用性试验筛选检测黄色镰孢菌的LAMP引物
以筛选能检测黄色镰孢菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择黄色镰孢菌标准菌株，以及来自不同地区的黄色镰孢菌(表2)的DNA作为模板，取2μL DNA溶液，加入24μL不同靶标设计出的LAMP引物所配制的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，含有黄色镰孢菌的样品应变为天蓝色，阴性对照为紫色。若反应结束后能使所有含有黄色镰孢菌的样品变为天蓝色，则该引物符合通用性实验要求，可继续进行下一步筛选实验；若不能使所有含有黄色镰孢菌的样品变为天蓝色，则该引物不符合实验要求，废弃。
(2)通过特异性试验筛选检测黄色镰孢菌的LAMP引物
以筛选能特异地检测黄色镰孢菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择黄色镰孢菌标准菌株，与其属内相近种禾谷镰孢菌、尖镰孢菌、层出镰孢菌、木贼镰孢菌、茄腐镰孢菌、燕麦镰孢菌、厚垣镰孢菌、三线镰刀菌、长足镰孢菌、甘蔗镰孢菌、变红镰孢菌、短肥镰孢菌、锐顶镰孢菌、轮枝镰孢菌和团镰孢菌(表2)，以及其他属病原菌(平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、多主棒孢菌、大豆紫斑病菌、大豆炭腐病菌、立枯丝核菌、冬青丽赤壳菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、米曲霉菌、稻瘟病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌、大豆拟茎点种腐病菌、大豆疫霉病菌)(表2)的DNA作为模板，取2μL DNA溶液，加入24μL经(1)筛选出的LAMP引物所配制的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，含有黄色镰孢菌的样品应变为天蓝色，而含其他种的样品和阴性对照为紫色。若反应结束后，除黄色镰孢菌为天蓝色，其他样本为紫色，则该引物符合特异性的实验要求，可进行下一步筛选实验；否则，该引物不符合实验要求，废弃。
(3)通过灵敏度试验筛选检测黄色镰孢菌的LAMP引物
以筛选能灵敏地检测出黄色镰孢菌的LAMP引物为目的，进行以下实验：选择黄色镰孢菌标准菌株，将标准黄色镰孢菌菌株DNA用分光光度计测定浓度(100ng·μL-1)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液2μL作为模板，加入24μL经(2)筛选出的LAMP引物所配制的检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，阴性对照为紫色，记录变为天蓝色的样品的浓度，检测灵敏度要求至少达到皮克级水平。
经过一系列实验，本发明最终采用以CYP51C为靶标基因设计的引物中的一套通用性好、特异性强、灵敏度高，能快速准确地检测出黄色镰孢菌的引物，由invitrogen(上海)公司合成，其序列信息如下：
表1
3.参试菌株
本研究所使用的参试菌株如表2所示：
表2
有益效果
发明人在黄色镰孢菌的CYP51C基因序列比对时发现其基因序列在种内不同菌株间高度保守，在镰孢菌属的种间存在丰富的变化，可作为黄色镰孢菌分子检测的候选靶标。本发明通过分析黄色镰孢菌的CYP51C基因与其他镰孢菌在序列上的差异，设计并筛选了四条特异性的LAMP引物和两条环引物，并在此基础上建立了黄色镰孢菌的LAMP检测体系。本发明解决了现有黄色镰孢菌的检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性偏低的问题，所需检测时间短(仅需85min)、特异性强、灵敏度高、可肉眼直接观察检测结果。
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
(1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳并用溴化乙锭染色后紫外光下观察才可判别结果，这不仅增加检测所需时间和检测操作环节，还容易造成产物扩散，成为实验室污染的一个重要来源；而且溴化乙锭(EB)有剧毒，可累积致癌；此外，紫外光也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应之前加入HNB，反应后通过颜色变化可用肉眼直接观察判断结果。本发明操作简单，所需时间短(完成一次检测仅需2h)，污染小，具有更强的实用性。
(2)恒温扩增。不像PCR技术必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源如恒温水浴锅，LAMP反应就可以完成，不需要昂贵的仪器设备，故而便于基层农业生产单位应用。LAMP能在恒定的热源下发生反应，是因为LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，从而在链置换DNA聚合酶的作用下实现扩增。
(3)准确度高。传统的检测技术耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰；而本发明选取黄色镰孢菌CYP51C一段特有的序列，设计出特异性的LAMP引物，通过四条引物特异性识别靶序列的6个独立区域，相对于PCR引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性更强，灵敏度更高。
(4)显著提升技术水平。基于靶标基因CYP51C设计与筛选的高特异性引物与LAMP技术相结合建立的黄色镰孢菌快速分子检测体系，克服了过去相关技术所存在的缺陷，缩短了检测所需时间，简化了操作过程，提高了检测的特异性和灵敏度，使技术水平得以升级。
附图说明
图1肉眼观测结果
左侧EP管呈天蓝色，表示为黄色镰孢菌检测阳性(+)，右侧EP管呈紫色，表示为黄色镰孢菌检测阴性(-)。
图2基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测黄色镰孢菌的通用性
其中，1号为黄色镰孢菌标准菌株(阳性对照)，2～8号为不同地区来源的黄色镰孢菌菌株，9号为水(阴性对照)。2～8号寄主及地区见本说明书表2提供的参试菌株信息。来自江苏南京江浦农场和徐州、山东济宁、安徽宿州、北京等地的大豆上分离到的黄色镰孢菌参与了验证，结果显示都为阳性反应(天蓝色)，说明该技术对来自不同寄主和地区的黄色镰孢菌的检测均适用。
图3基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测黄色镰孢菌的特异性
其中，1号为黄色镰孢菌标准菌株(阳性对照)，2～7号为禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)不同菌株，8～13号为尖镰孢菌(F.oxysporum)不同菌株，14～19号为层出镰孢菌(F.proliferatum)不同菌株，20～24号为木贼镰孢菌(F.equiseti)不同菌株，25～29号为茄腐镰孢菌(F.solani)不同菌株，30号为燕麦镰孢菌(F.avenaceum)，31号为厚垣镰孢菌(F.chlamydosporum)，32号为三线镰刀菌(F.tricinctum)，33号为长足镰孢菌(F.longipes)，34号为甘蔗镰孢菌(F.sacchari)，35号为变红镰孢菌(F.incarnatum)，36号为短肥镰孢菌(F.brachygibbosum)，37号为锐顶镰孢菌(F.acuminatum)，38号为轮枝镰孢菌(F.verticillioides)，39号为团镰孢菌(F.commune)，40号为平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)，41号为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioide)，42号为多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)，43号为大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)，44号为大豆紫斑病菌(Cercospora kikuchii)，45号为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，46号为冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)，47号为玉蜀黍平脐蠕孢菌(Bipolaris maydis)，48号为米曲霉菌(Aspergillus oryzae)，49号为稻瘟病菌
(Magnaporthe oryzae)，50号为大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorumvar.caulivora)，51号为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorumvar.meridionalis)，52号为大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata f.sp.sojae)，53号为大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)，54号为大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)，55号为水(阴性对照)。所用病原菌的寄主及地区见本说明书表2提供的参试菌株信息。结果显示，所有供试的禾谷镰孢菌等镰孢菌和其他病原菌均呈紫色的阴性反应，仅1号黄色镰孢菌标准菌株呈天蓝色的阳性反应。表明本发明建立的技术可以区分目标病原菌(黄色镰孢菌)和非目标病原菌(其他镰孢菌与其他属病原菌)。
图4基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测黄色镰孢菌的灵敏度
LAMP扩增不同浓度的黄色镰孢菌基因组DNA；其中，1号为黄色镰孢菌标准菌株基因组(阳性对照)，2～9号分别为100ng·μL-1、10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1、10fg·μL-1浓度的黄色镰孢菌DNA的LAMP扩增结果，10号为阴性对照。LAMP扩增反应能特异性地识别黄色镰孢菌，图片表示灵敏度能够达到100pg·μL-1。
图5基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测发病大豆植株中的黄色镰孢菌
其中，1号为黄色镰孢菌标准菌株基因组(阳性对照)，2～4号为接种黄色镰孢菌菌株6天后的大豆植株基因组，5～7号为接种空白PDA培养基6天后的大豆植株基因组，8号为灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。结果显示，接种黄色镰孢菌的大豆植株(2～4号管)呈天蓝色的阳性反应，效果和直接检测黄色镰孢菌DNA(1号管)没有差别，而接种空白PDA培养基6天后的大豆植株(5～7号管)和阴性对照灭菌水(8号管)则呈紫色的阴性反应，说明本发明建立的技术能够从接种发病的大豆植株中检测出黄色镰孢菌，可以用于田间快速检测。
图6基于靶基因CYP51C的LAMP技术在实际应用中的灵敏度
其中，1号为黄色镰孢菌标准菌株基因组(阳性对照)，2～7号为每0.25g土壤样本中添加不同孢子量的土壤样本提取的DNA，2～7号孢子添加量依次为10000、1000、100、50、10、0个。8号为灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。结果显示，本发明建立的LAMP技术检测黄色镰孢菌的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。
具体实施方式
以下实施例使用的主要试剂及仪器：Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)、Betaine、MgS04(Sigma)、dNTPs、eppendorf普通PCR扩增仪、eppendorf Biophotometer分光光度计、上海精宏实验仪器厂DK-8D型电加热恒温水浴锅。
实施例1一种用于检测黄色镰孢菌的LAMP检测试剂盒
试剂盒反应体系：检测溶液。
检测溶液制备方法如下：
2.5μL 10×ThermoPol Buffer、8mM MgSO4、1.2mM dNTPs、1.6μM正向内引物CYP51C-FIP、1.6μM反向内引物CYP51C-BIP、0.4μM正向外引物CYP51C-F3、0.4μM反向外引物CYP51C-B3、0.8μM环引物CYP51C-LF、0.8μM环引物CYP51C-LB、0.8M甜菜碱、20mM Tris-HCl(PH 8.8)、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、0.1％Trion-X、8U·μL-1Bst DNA polymerase、180mMHNB，保存期限为1年。
实施例2本发明试剂盒通用性考察
选择表2所示的黄色镰孢菌标准菌株，以及来自不同地区的黄色镰孢菌的DNA作为模板，取2μL DNA溶液，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，来自不同地区的黄色镰孢菌的样品都变为天蓝色，阴性对照保持紫色。说明该技术对来自不同地区的黄色镰孢菌的检测均适用。图2选取了7株具代表性菌株列出。
实施例3本发明试剂盒特异性考察
选择黄色镰孢菌标准菌株，与表2所示的其相近种禾谷镰孢菌等镰孢菌，以及其他属病原菌(平头炭疽菌、胶孢炭疽菌、多主棒孢菌、大豆紫斑病菌、大豆炭腐病菌、立枯丝核菌、冬青丽赤壳菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、米曲霉菌、稻瘟病菌、大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌、大豆拟茎点种腐病菌、大豆疫霉病菌)的DNA作为模板，取2μL DNA溶液，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，含有黄色镰孢菌的样品应变为天蓝色，而含其他种的样品和阴性对照为紫色。结果显示(图3)，所有供试的禾谷镰孢菌等镰孢菌和其他属病原菌均呈紫色的阴性反应，仅1号黄色镰孢菌标准菌株呈天蓝色的阳性反应。表明本发明建立的技术可以区分目标病原菌(黄色镰孢菌)和非目标病原菌(其他镰孢菌与其他属病原菌)。
实施例4本发明试剂盒灵敏度考察
选择黄色镰孢菌标准菌株，将标准黄色镰孢菌菌株DNA用分光光度计测定浓度(1μg·μL-1)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液2μL作为模板，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化。结果如图4，表示本发明灵敏度能够达到100pg·μL-1。
实施例5基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测人工接种发病大豆植株病组织中的黄色镰孢菌
用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取3株接种黄色镰孢菌和3株接种空白PDA培养基6天后的大豆植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增，将黄色镰孢菌标准菌株DNA作为阳性对照，健康植株DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取2μL DNA溶液，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，结果如图5所示，显示接种黄色镰孢菌的大豆植株的EP管(2～4号管)变成天蓝色，能够特异性地检测出黄色镰孢菌，效果和直接检测黄色镰孢菌DNA(1号管)没有差别，而接种空白PDA培养基6天后的大豆植株EP管(5～7号管)、阴性对照灭菌水(8号管)则为紫色，可见本方法可以用于田间检测。
实施例6基于靶基因CYP51C的LAMP技术检测田间发病大豆植株病组织中的黄色镰孢菌
从江苏南京江浦农场、江苏徐州、山东济宁、安徽宿州、北京采集的大豆样本中选取典型的发病组织，清洗晾干，用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组。将其作为模板用于LAMP扩增，将黄色镰孢菌标准菌株DNA作为阳性对照，灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取2μL DNA溶液，加入24μL检测溶液进行LAMP反应，反应程序为：62℃，85min；反应后观察反应管颜色变化，若反应液颜色变为天蓝色表示检测为阳性，供试大豆植物组织中含有黄色镰孢菌；若颜色保持紫色不变表示检测为阴性，供试大豆植物组织中不含黄色镰孢菌。
1.检测结果如下：
江苏南京：8份样本，检测出4个阳性
江苏徐州：26份样本，检测出6个阳性；
山东济宁：36份样本，检测出10个阳性；
安徽宿州：23份样本，检测出7个阳性；
北京：26份样本，检测出15个阳性。
2.对检测为阳性的大豆病组织材料进行病原菌分离，分离出的病原菌经形态学观察和ITS测序比对，为黄色镰孢菌，进一步证明检测阳性结果正确可靠。
实施例7基于靶基因CYP51C的LAMP技术在实际应用中的灵敏度
选取土壤样本，按以下步骤进行：
1)取土
土壤样本在盘子内摇晃混匀取样，提取基因组，检测若无黄色镰孢菌，留待下一步备用。
2)加孢子
称取6份0.25g土壤，倒入2mL EP管中，然后分别加入10000、1000、100、50、10、0个黄色镰孢菌的分生孢子。
3)土壤总基因组的提取
实验采用美国MOBIO公司的土壤微生物DNA强力提取试剂盒DNAIsolation Kit进行提取，方法如下：
将加入孢子的土壤倒到PowerBead管中，加入60μL C1，漩涡震荡10min；室温10000g，30s离心。吸取上清液400～500μL至2mL Collection Tube中，向离心管中加入250μL C2，漩涡震荡5s，置于4℃，5min；室温离心10000g，1min；吸取上清600μL至新的2mLCollection Tube中；向离心管中加入200μL C3，漩涡震荡5s后，置于4℃，5min；室温离心10000g，1min；吸取上清750μL至新的2mL Collection Tube中；向管中加入1.2mL C4，漩涡震荡5s；将混合液转移至Spin Fittle中，10000g、1min离心，弃滤液；向滤柱中加入500μLC5，10000g，30s，弃滤液；滤柱空转离心，10000g，1min；将滤柱放置于新的2mL CollectionTube中，37℃恒温晾干；滤柱中加入100μL C6，放置2min，10000g，1min离心。所得滤液即为提取的基因组，放置备用。
4)提取基因组中黄色镰孢菌LAMP检测
黄色镰孢菌LAMP检测：取2μL DNA溶液，加入24μL上述试剂盒溶液进行LAMP反应。
反应条件：62℃，85min。
扩增产物检测：扩增反应结束后观察反应管颜色变化，若反应液颜色变为天蓝色表示检测为阳性，供试土壤中含有黄色镰孢菌；若颜色保持紫色不变表示检测为阴性，供试土壤中不含黄色镰孢菌。结果显示，本发明建立的技术对于土壤样本中黄色镰孢菌的检测灵敏度为10个孢子/0.25g土壤(图6)。
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Claims (6)

1.一种用于LAMP检测黄色镰孢菌的引物组合物，其特征在于由SEQ ID NO.2所示的正向外引物CYP51C-F3，SEQ ID NO.3所示的反向外引物CYP51C-B3，SEQ ID NO.4所示的正向内引物CYP51C-FIP，SEQ ID NO.5所示的反向内引物CYP51C-BIP，SEQ ID NO.6所示的环引物CYP51C-LF，SEQ ID NO.7所示的环引物CYP51C-LB组成。
2.权利要求1所述的引物组合物在检测黄色镰孢菌中的应用。
3.权利要求1所述的引物组合物在制备检测黄色镰孢菌的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测黄色镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物组合物。
5.根据权利要求4所述的用于检测黄色镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于包含：2.5μL10 × ThermoPol Buffer，8mM MgSO4，1.2mM dNTPs，正向内引物CYP51C-FIP和反向内引物CYP51C-BIP各1.6μM，正向外引物CYP51C-F3和反向外引物CYP51C-B3各0.4μM，环引物CYP51C-LF和CYP51C-LB各0.8μM，0.8M甜菜碱，0.1%Trion-X，20mM pH8.8的Tris-HCl，10mMKCl，10 mM (NH4)SO4，8U·μL-1 Bst DNA聚合酶，180mM HNB组成的检测溶液。
6.一种LAMP检测黄色镰孢菌的方法，其特征在于包括取24μL权利要求5所述的检测溶液，加入2μL待检DNA溶液，总体积为26μL进行LAMP反应；反应程序为：62℃，85min；反应后观察溶液颜色变化，如果反应管变为天蓝色，则表示存在黄色镰孢菌，为紫色则表示不存在黄色镰孢菌，或所含黄色镰孢菌未达到检测限。
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