CN117344043A - 用于检疫的引物组及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检疫的引物组及应用。引物组1、引物组2、引物组3中的一种或几种组合；引物组1包括正向引物1、反向引物1、探针1中的一种或几种的组合；引物组2包括正向引物2、反向引物2、探针2中的一种或几种的组合；引物组3包括正向引物3、反向引物3、探针3中的一种或几种的组合。上述引物组可以在大豆检疫性病原菌检测中的应用也可以用于制备大豆检疫性病原菌检测试剂盒。本发明具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。

Description

用于检疫的引物组及应用
技术领域
本发明属于检测技术领域，尤其涉及用于检疫的引物组及应用。
背景技术
随着我国大豆进口量的年年攀升，一些检疫性病害入侵存在极大可能性。据统计2009-2019年，我国检疫部门在各口岸大豆中截获的检疫性有害病原菌最多的为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe caulivora)、大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe aspalathi)、大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、大豆茎褐腐病菌(Cadophora gregata)。这些病原菌的寄主范围广泛，包括大豆、柑橘、花生、赤豆、绿豆等大量的经济作物。在北美洲，由多种间座壳属真菌引起的间座壳属综合征是大豆上的毁灭性病害之一，据报道2014年仅由该病造成的大豆产量损失达20万吨，市值约12亿美元，大豆茎褐腐病菌的侵染可造成种子数量减少、种子变小以及植株倒伏难以收获等，导致大豆产量损失10％-30％。这些病原菌不仅影响大豆产量，对大豆品质也造成严重影响。受病害复合体侵染的种子生产出的豆油、面粉和其它附加产品质量低下，同时产生的毒素可以引起鸡的肝脏损坏，也可能导致其它动物的肝脏损坏，不适合作为食物使用。目前这些病原菌中除了大豆疫霉病在我国局部地区已有发生和报道外，其他三种病害在国内没有报道，应该引起高度重视，加强检疫监管，防止随大豆进口传入我国。
一般检测技术针对分离纯化得到的纯菌进行检测鉴定，且不能定量。目前，我国针对大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌的检疫鉴定标准是传统方法与qPCR技术并存。传统方法主要以病菌形态学为鉴定依据，但病原菌有性态与近似种相似，难以区分，并且通过培养产生子实体的过程很漫长，因此传统法无法快速准确鉴定，实用性不足，且病原菌在群体中丰度较低时，难以分离。目前qPCR检测技术以其快速、灵敏、易于普及等优点，成为病原菌检测中应用最普遍的技术，但是许忠祥等的研究表明有些引物或探针特异性不强，PCR反应会出现假阳性，调整反应条件又会产生假阴性，存在结果难以判定等问题，同时对低带菌率种子样品的检测效果也不理想，易出现假阴性(许忠祥,杨静,刘晓宇,等.大豆南方茎溃疡病菌PCR检测方法的建立[J].植物检疫,2022,36(05):34-40)。
微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)是可以实现准确定量的一种新的核酸扩增技术，被称为第三代PCR技术。该技术将含有DNA或RNA的PCR体系分成数万个油包水的纳米级微滴，每个微滴里可能不含或含1个甚至多个核酸分子，每个微滴都作为一个独立的PCR体系，经PCR扩增后，对每个微滴反应进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶标分子的起始拷贝数。即利用有限稀释，PCR反应和泊松分布实现核酸浓度的绝对定量。但上述方法在大豆检疫性病原菌检测领域未见应用报道。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供用于检疫的引物组及应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
用于检疫的引物组，包括：引物组1、引物组2、引物组3中的一种或几种组合；
所述引物组1包括正向引物1、反向引物1、探针1中的一种或几种的组合；正向引物1包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，反向引物1包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针1包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
所述引物组2包括正向引物2、反向引物2、探针2中的一种或几种的组合；正向引物2包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反向引物2包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，探针2包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述引物组3包括正向引物3、反向引物3、探针3中的一种或几种的组合；正向引物3包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，反向引物3包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，探针3包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
采取上述技术方案的有益效果包括：
引物组1可以用于大豆南方茎溃疡病菌的检测，引物组2可以用于大豆北方茎溃疡病菌的检测，引物组3可以用于大豆茎褐腐病菌的检测。三组引物组中的两组或三组可以用于多重PCR体系，在同一反应过程同时检测多种致病菌，且不会产生交叉反应。
本发明可以针对大豆原始样品中携带的极其微量的病原菌开展检测，并且能精准的鉴定出其中的病原菌，并最终进行定量。
采用本发明提供的引物组进行检测，具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
进一步，探针1包括HEX基团；探针2包括FAM基团；探针3包括Cy5基团。具体的，探针1可以包括HEX基团和BHQ1基团；探针2可以包括FAM基团和BHQ1基团；探针3可以包括Cy5基团和BHQ1基团。
采取上述技术方案的有益效果包括：以满足微滴数字PCR检测的需求。
本发明提供上述引物组在大豆检疫性病原菌检测中的应用。
进一步，大豆检疫性病原菌包括大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种或几种。
本发明提供上述引物组在制备大豆检疫性病原菌检测试剂盒中的应用。
进一步，大豆检疫性病原菌包括大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种或几种。
采取上述技术方案的有益效果包括：本发明提供的引物组可以单独检测其中一种致病菌也可以同时检测2种或3种致病菌，具有结果准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
本发明提供一种用于检测大豆检疫性病原菌的方法，包括以下步骤：采用上述引物组对待检测的样品DNA进行PCR检测。
采取上述技术方案的有益效果包括：本发明提供的检测方法可以大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的1种也可以同时检测2种或3种致病菌，具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
进一步，所述PCR检测为ddPCR检测或荧光定量PCR。
采取上述技术方案的有益效果包括：ddPCR技术具有更高的灵敏度和特异性，可实现无需外部标准的绝对定量，简化了计算。ddPCR不依赖扩增曲线和标准曲线就可以实现绝对定量分析，且定量结果不受PCR扩增效率影响，准确度高、重现性好，具有极大的应用前景。
进一步，引物浓度为10μmol/L(即正向引物浓度10μmol/L，反向引物浓度为10μmol/L，正向引物包括引物1至引物3中的一种或几种，反向引物包括反向引物1至反向引物3中的一种或几种)，探针浓度为10μmol/L(探针包括探针1至探针3中的一种或几种)。
采取上述技术方案的有益效果包括：相比其他浓度，当引物和探针浓度为10μmol/L时，各阳性靶标微滴簇相对集中，且阴阳性微滴之间区分较明显，因此，10μmol/L可以作为最佳引物和探针浓度。
进一步，PCR扩增的条件包括：95℃预变性3min；95℃变性10s，57-58℃退火30s，45个循环。
采取上述技术方案的有益效果包括：扩增条件会对检测结果产生影响，以退火温度为例，当退火温度为57-58℃(优选地，57℃)时，FAM和HEX通道的阴、阳性微滴区分较明显，随着退火温度的降低和增加，各阳性靶标微滴簇呈现逐渐聚集的趋势，此时不利于微滴簇的区分及阴、阳性微滴计数。因此，可以选择57℃作为多重ddPCR体系的最优退火温度。
本发明提供一种检测试剂盒，包括引物组和预混液；所述引物组可以为上述引物组；所述预混液为PCR预混液，PCR预混液可以包括PCR扩增用酶、缓冲液等。
采取上述技术方案的有益效果包括：采用本发明提供的检测试剂盒进行检测，具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
上述检测试剂盒还可以包括荧光素钠盐、无菌水中、阴性对照、阳性对照中的一种或几种。
优选地，所述预混液为ddPCR扩增用预混液，ddPCR扩增用预混液可以包括ddPCR扩增用酶、缓冲液等。或所述预混液为荧光定量PCR扩增用预混液，荧光定量PCR扩增用预混液可以包括荧光定量PCR扩增用酶、缓冲液等。
采取上述技术方案的有益效果包括：可以使试剂盒用于微滴数字PCR检测或荧光定量PCR检测。
本发明提供一种上述检测试剂盒在大豆检疫性病原菌检测中的应用。
进一步，大豆检疫性病原菌包括大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种或几种。
采取上述技术方案的有益效果包括：本发明提供的试剂盒可以单独检测其中1种致病菌也可以同时检测2种或3种致病菌，具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
本发明提供一种利用上述试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：采用上述试剂盒对待检测的样品DNA进行PCR检测。
采取上述技术方案的有益效果包括：本发明提供的检测方法可以对大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种也可以同时检测2种或3种致病菌，具有快速、准确、特异性好、重复性好、灵敏度高、检测效率高等优点。
进一步，引物浓度为10μmol/L(即正向引物浓度和反向引物浓度均为10μmol/L，正向引物包括引物1至引物3中的一种或几种，反向引物包括反向引物1至反向引物3中的一种或几种)，探针浓度为10μmol/L(探针包括探针1至探针3中的一种或几种)。
采取上述技术方案的有益效果包括：相比其他浓度，当引物和探针浓度为10μmol/L时，各阳性靶标微滴簇相对集中，且阴阳性微滴之间区分较明显，因此，10μmol/L可以作为最佳引物和探针浓度。
进一步，PCR扩增的条件包括：95℃预变性3min；95℃变性10s，57-58℃退火30s，45个循环。
采取上述技术方案的有益效果包括：扩增条件会对检测结果产生影响，以退火温度为例，当退火温度为57-58℃(优选地，57℃)时，FAM和HEX通道的阴、阳性微滴区分较明显，随着退火温度的降低和增加，各阳性靶标微滴簇呈现逐渐聚集的趋势，此时不利于微滴簇的区分及阴、阳性微滴计数。因此，优选地，选择57℃可以作为多重ddPCR体系的最优退火温度。
进一步，所述PCR检测为ddPCR检测。具体的可以包括以下步骤：
(1)配制ddPCR反应体系，以25μL体系为例，每25μL体系，按以下比例配置：预混液5.0μL、荧光素钠盐1.0μL、模板DNA 2.0μL、正向引物2.5μL、反向引物2.5μL、探针0.625μL、ddH2O 11.375μL。(2)制备微滴；(3)ddPCR扩增，扩增条件包括95℃预变性3min；95℃变性10s，57-58℃退火30s，45个循环；(4)结果分析。
采取上述技术方案的有益效果包括：ddPCR技术具有更高的灵敏度和特异性，可实现无需外部标准的绝对定量，简化了计算。ddPCR不依赖扩增曲线和标准曲线就可以实现绝对定量分析，且定量结果不受PCR扩增效率影响，快速、准确、重现性好，具有极大的应用前景。
本发明通过对大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌等3种口岸高频截获的大豆检疫性病原菌DNA条形码进行生物信息学筛选，选择特异性靶标基因，分别构建3种目标菌株的单重ddPCR检测体系。在此基础上，通过引物和探针浓度和退火温度的优化，构建可在同一反应体系中快速定量检测3种目标菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系，从而提高检疫性病原菌的检测鉴定水平，提高病害预测的准确性，为口岸外来物种防控和保护我国生态安全提供技术服务和支持。
附图说明
图1为大豆病原真菌DNA条形码记录情况分析结果。图2为基于ITS、TEF1和TUB2基因序列构建的NJ树，A为ITS，B为TEF1，C为TUB2。图3为ITS、TEF1和TUB2基因的种内和种间序列差异比较分析结果，其中，左侧为参试种，白色柱条和黑色柱条分别表示种内差异和种间差异；黑色竖细线表示最小种间差异。图4为大豆南方茎溃疡病菌单重ddPCR检测一维图，其中，1-3：D.aspalathi、4：D.caulivora、5：C.gregata、6：D.phaseolorum、7：P.sojae、8：P.longicolla、9：M.phaseolina、10：S.sclerotiorum、11：无菌大豆、12：水。图5为大豆北方茎溃疡病菌单重ddPCR检测一维图，其中，1-3：D.caulivora、4：D.aspalathi、5：C.gregata、6：D.phaseolorum、7：P.sojae、8：P.longicolla、9：M.phaseolina、10：S.sclerotiorum、11：无菌大豆、12：水。图6为大豆茎褐腐病菌单重ddPCR检测一维图，其中，1-3：C.gregata、4：D.aspalathi、5：D.caulivora、6：P.malorum、7：P.sojae、8：P.longicolla、9：F.oxysporum、10：C.truncatum、11：无菌大豆、12：水。图7为二重荧光定量PCR探针法特异性检测结果，其中，A为FAM通道检测结果，B为HEX通道检测结果，1:D.caulivora1、2:D.caulivora2、3:D.aspalathi1、4:D.aspalathi2、5:C.gregata1、6:C.gregata2、7:D.phaseolorum、8:P.malorum、9:P.sojae、10:P.longicolla、11:无菌大豆、12:水。图8为二重数字PCR探针法特异性检测结果，其中，1:DC1、2:DC2、3:DC3、4:DA1、5:DA 2、6：DA3、7:D.phaseolorum、8:CG1、9:P.sojae、10:P.longicolla、11:无菌大豆、12:水。图9为三重ddPCR引物和探针优化一维图，其中，D.aspalathi、D.caulivora和C.gregata检测通道分别为FAM、HEX和Cy5，下同。1-2：5μmol/L、3-4：10μmol/L、5-6：15μmol/L、7-8：20μmol/L。图10为三重ddPCR温度优化一维图，其中，1-2：55℃、3-4：56℃、5-6：57℃、7-8：58℃、9-10：59℃、11-12：60℃、13-14：61℃。图11为三重ddPCR特异性检测一维图，其中，1-2：D.aspalathi、3-4：D.caulivora、5-6：C.gregata、7：D.phaseolorum、8：P.malorum、9：P.sojae、10：P.longicolla、11：11：无菌大豆、12：水。图12为三重ddPCR灵敏度检测一维图，其中，1-2：1.0ng/μL、3-4：0.1ng/μL、5-6：0.01ng/μL、7-8：10pg/μL、9-10：1.0pg/μL、11-12：0.1pg/μL、13-14：0.01pg/μL、15-16：水。图13为三重qPCR灵敏度扩增曲线图，其中，A为HEX通道检测结果，B为FAM通道检测结果，C为Cy5通道检测结果。1-2：1.0ng/μL、3-4：0.1ng/μL、5-6：0.01ng/μL。图14为单重与多重ddPCR检测的线性相关性检测结果，其中，A：D.aspalathi、B：D.caulivora、C：C.gregata。图15为三重微滴数字PCR检测20份样品一维图，其中，1-2：阳性对照、3-22：样品1-20、23：无菌大豆、24：水。图16为引物和探针组合A的筛选试验的结果。图17为引物和探针组合B的筛选试验的结果。图18为引物和探针组合C的筛选试验的结果。图19为引物和探针组合D的筛选试验的结果。图20为引物和探针组合E的筛选试验的结果。图21为引物和探针组合F的筛选试验的结果。图22为引物和探针组合G的筛选试验的结果。图23为引物和探针组合H的筛选试验的结果。图24为引物和探针组合I的筛选试验的结果。图25为引物和探针组合J的筛选试验的结果。图26为引物和探针组合K的筛选试验的结果。图27为引物和探针组合L的筛选试验的结果。
图16至图27中，左图为上、下游引物的扩增结果，右图为上游引物与探针的扩增结果；若图中数字未标出，表示该数字对应的样品无扩增曲线。图16至图18中，1:D.aspalathi1、2:D.aspalathi2、3:D.aspalathi3、4:D.caulivora3、5:C.gregata1、6:D.phaseolorum、7:P.sojae、8:P.longicolla、9:C.truncatum、10:M.phaseolina、11:无菌大豆、12:水。图19至图21中，1:D.caulivora1、2:D.caulivora2、3:D.caulivora3、4:D.aspalathi4、5:C.gregata2、6:D.phaseolorum、7:P.sojae、8:P.longicolla、9:S.sclerotiorum、10:F.oxysporum、11:无菌大豆、12:水。图22至图27中，1:C.gregata1、2:C.gregata2、3:D.aspalathi5、4:D.caulivora6、5:P.malorum、6:P.sojae、7:P.longicolla、8:C.truncatum、9:M.phaseolina、10:S.sclerotiorum、11:无菌大豆、12:水。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
为精准、快速检测进口大豆中的检疫性病原菌，减少外来有害生物入侵风险。本发明以大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌3种常见检疫性病原菌为研究对象，通过生物信息学筛选DNA条形码，获得以翻译延长因子1α基因(TEF1)和β-微管蛋白基因(TUB2)为靶标的特异性引物与探针，分别构建3种目标菌株的单重ddPCR检测体系。在此基础上，通过引物和探针浓度和退火温度的优化，构建可在同一反应体系中快速、绝对定量检测大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系。研究结果表明，3种病原菌DNA样品等浓度混合时，多重ddPCR体系内各组引物探针对目标菌株均能扩增，未出现交叉反应，最低DNA浓度检测浓度为10.0pg/μL；大豆南方茎溃疡病菌的绝对定量检测低限为0.20copies/μL，大豆北方茎溃疡病菌的绝对定量检测低限为0.34copies/μL，大豆茎褐腐病菌的绝对定量检测低限为2.58copies/μL，在定量检测范围内的线性相关系数R2均大于0.999，且重复性好，3种病原菌的多重ddPCR检测体系与单种菌的单重ddPCR定量线性范围几乎一致。本发明建立的方法可实现对进口大豆中3种常见检疫性病原菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控，为口岸外来有害生物防控和保护我国生态安全提供技术服务和支持。
下面通过具体实施例进行介绍。各实施例中所使用的实验方法若未经特殊说明均为本领域的常规实验方法。所用材料、试剂、仪器，若未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂和仪器，均可通过商业渠道获得。
材料与试剂：植物病原真菌基因组提取试剂盒Fungal DNA Kit(omega，美国)；2*M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(聚合美，中国)；5*PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix(Quantabio，美国)；Fluorescein sodium salt(APEXBIO，中国)；Sapphire Chip(StillaTechnologies，法国)。
仪器与设备：全自动微滴芯片微滴数字PCR系统(Stilla Technologies，法国)、实时荧光PCR(Bio-Rad，美国，CFX96)、PCR仪(Bio-Rad，美国，PTC-200)、霉菌培养箱(上海一恒科技，中国，MJ-250F-I)、恒温震荡水浴箱(上海博讯实业，中国，SHZ-B)。
实验菌株：供试菌株共17株，其中大豆南方茎溃疡病菌3株，大豆北方茎溃疡病菌3株，大豆茎褐腐病菌3株，其他阴性对照菌株8株。菌株前期培养使用设备包括霉菌培养箱(上海一恒科技，中国，MJ-250F-I)、恒温震荡水浴箱(上海博讯实业，中国，SHZ-B)；在进行菌株初期鉴定时采用PCR仪(Bio-Rad，美国，PTC-200)。
供试菌株来源明细见表1。公众可以获得上述菌株，仅用于非商业目的重复本发明所记载的实施例。
表1 供试菌株明细表
实施例1筛选DNA条形码
1.1DNA条形码的统计分析
利用中国有害生物信息系统(http://www.pestchina.com/SitePages/Home.aspx)，选择寄主为大豆Glycine max，搜索大豆上的病原真菌，整理GOPHY网站(https://www.plantpathogen.org/)中的DNA条形码在GeneBank数据库中的记录情况，通过分子数据的统计分析，确定大豆病原真菌常用的DNA条形码。
经分析，在中国有害生物信息系统搜索大豆上寄生的病原真菌，共发现149种病原真菌，其中检疫性病原真菌为7种，分比为P.sojae、C.gregata、D.phaseolorum、D.phaseolorum、南美大豆猝死综合症病菌(Neocosmospora tucumaniae)和北美大豆猝死综合症病菌(Neocosmospora virguliformis)，一般性病原真菌共142种，涉及64个属。在GOPHY网站对149种大豆病原真菌所记录的DNA条形码进行统计分析后发现，共有23种在GeneBank中有序列记录(见表2)，占比为15.4％，涉及13种DNA条形码，分别为肌动蛋白基因(ACT)、钙调蛋白基因(CAL)、丁质合成酶-1基因(CHS-1)、钙调蛋白基因(CMDA)、细胞色素C氧化亚基III(COIII)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、基因间间隔区(IGS)、组蛋白H3基因(HIS3)、内转录间隔区(ITS)、核糖体大亚基基因(LSU)、RNA聚合酶II第二大亚基(RPB2)、翻译延长因子1α(TEF1)、β-微管蛋白基因(TUB2)，其中，95.6％的大豆病原菌(22种)在GeneBank中都有ITS序列记录，此外，TEF1、TUB2、HIS3和GAPDH基因序列记录相对较高(见图1)。
表2 GeneBank中有害生物DNA条形码记录信息表
1.2 DNA条形码的遗传距离分析
通过BLAST比对搜索，从GenBank下载与试验目标菌株同源性较高的相关种属的基因序列为补充。利用MEGA 7.0软件进行多序列比对，去掉两端不整齐的序列，计算相似性矩阵。将序列相似性矩阵文件导入软件，以K2P(Kimura’s two-parameter)模型计算种内不同个体间的遗传距离和属内不同种间的遗传距离，采用邻接法(Neighbor-joininganalysis，NJ)构建分子系统树，各分支置信度通过1000次自举法分析获得。分析每个候选DNA条形码基因亲缘关系最近菌株的种内和种间变异情况，通过柱形图呈现种间、种内的遗传距离的分布频度，比较候选基因的种内和种间变异是否存在间距(Barcoding Gap)。理想的DNA条形码序列，其种内最大变异和种间最小变异之间应该存在间隔区。
实验结果与分析：选择D.aspalathi、D.caulivora、C.gregata在NCBI网站上记录信息较多的ITS、TUB2和TEF1基因为研究对象，通过BLAST比对与供试菌株亲缘关系较近的菌株，搜索统计3个基因的Genebank编号用于亲缘关系分析(见表3)。
表3供试目标菌株ITS、TEF1和TUB2基因序列统计表
基于供试菌株及其近缘种ITS、TEF1和TUB2基因构建的NJ树显示，3个基因能够将同一个种的菌株聚在一起，不同的种则位于不同的分支，表明3个基因片段对D.aspalathi、D.caulivora、C.gregata及其近缘种具有较好的区分能力(见图2)。
应用MEGA 7.0软件对每个供试种的种内差异和与图2中亲缘关系最近菌株的种间差异分析，结果表明，与ITS和TUB2基因片段相比，TEF1基因具有比较合适的种内与种间差异(见图3)。如图3中的细黑线所示，TEF1基因的最大种内差异为0.118，最小种间差异为0.124。该基因片段所有的种内差异均小于其最小的种间差异，存在Barcoding Gap，而ITS和TUB2基因的种内与种间差异均存在重叠的情况(见表4)，所以以TEF1基因作为三种检疫性病原菌特异性引物设计的首选DNA条形码，ITS和TUB2基因作为辅助DNA条形码。
表4遗传距离及Barcoding Gap分析
实施例2设计引物和探针
根据已知的核酸序列查找并排除内部二级结构、相互之间形成二聚体等因素后，使用Beacon Designer 8软件进行引物和探针设计15组引物及探针，进一步经实验验证后，最终发现仅有3组适用于多重ddPCR，具体序列信息见表5。其中，引物组1包括正向引物1(DA-F)、反向引物1(DA-R)、探针1(DA-P)；正向引物1包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，反向引物1包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针1包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；引物组2包括正向引物2(DC-F)、反向引物2(DC-R)和探针2(DC-P)；正向引物2包括SEQID NO:4所示的核苷酸序列，反向引物2包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，探针2包括SEQID NO:6所示的核苷酸序列；引物组3包括正向引物3(CG-F)、反向引物3(CG-R)和探针3(CG-P)；正向引物3包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，反向引物3包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，探针3包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。大豆南方茎溃疡病菌检测探针(DA-P)连接有六氯-6-甲基荧光素(hexachloro fluorescein,HEX)基团，大豆北方茎溃疡病菌检测探针(DC-P)连接有6-羧基荧光素(6-carboxy-fluores-cein,FAM)报告基团，大豆茎褐腐病菌检测探针(CG-P)连接有磺基菁5荧光素(Cyanine5，Cy5)基团，引物和探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
表5 多重ddPCR检测体系引物和探针信息
实施例3单重ddPCR体系构建及特异性验证
构建单重ddPCR体系包括以下步骤：(1)配制ddPCR反应体系；(2)制备微滴；(3)ddPCR扩增(4)结果分析。
分别构建大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌的单重ddPCR体系，25μL体系如下：5*PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix 5.0μL，荧光素钠盐(Fluorescein sodium salt，浓度1ng/μL)1.0μL，Template DNA 2.0μL，正向引物ForwardPrimer(10μM)2.5μL，反向引物Reverse Primer(10μM)2.5μL，探针Probes(10μM)0.625μL，ddH2O 11.375μL。配置反应体系后进行微滴制备(Sapphire Chip(Stilla Technologies，法国)，采用全自动微滴芯片微滴数字PCR系统进行微滴PCR(dd PCR)扩增反应，ddPCR扩增标准程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。扩增结果采用系统自带软件进行分析。如果有效微滴数不低于理论微滴数的60％，阴性对照和空白对照均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，则判定结果为阳性检出。
经生物信息学软件DNAStar分析多对引物和探针中的二聚体及发夹结构以及实验验证，筛选伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌检测引物和探针，分别使用筛选获得的3组引物和探针(表5)对上述3种病原菌及Diaporthe phaseolorum菜豆间座壳菌、Phialophora malorum苹果边腐病菌、Phytophthora sojae大豆疫霉、Phomopsislongicolla大豆拟茎点种腐病菌、Colletotrichum truncatum平头炭疽菌、Macrophominaphaseolina大豆炭腐病菌、Sclerotinia sclerotiorum大豆菌核病菌、Fusariumoxysporum尖孢镰刀菌基因组DNA、无菌大豆基因组DNA、水(空白)分别进行TaqMan探针法ddPCR扩增。供试菌株的信息如表1所示。
结果显示，3组引物和探针均只对各自的阳性菌株DNA产生特异性扩增微滴，空白及其他阴性菌株均无扩增微滴(图4、图5、图6)，说明本发明选择的3对病原菌检测引物和探针具有特异性好的优点，可用于后续多重ddPCR检测体系的构建。
实施例4多重ddPCR体系的特异性验证及优化
根据ddPCR三通道检测方式，3种病原菌检测探针分别用HEX、FAM和Cy5基团进行荧光标记(表5)。在构建的单重ddPCR体系基础上使用不同引物和探针组合构建两两不同的病原菌二重ddPCR体系，然后在构建的二重体系中加入第三种病原菌检测引物和探针组合构建三重ddPCR体系，以一维空间图谱相应靶标微滴是否有效区分及其微滴数目的多少来判定构建的检测体系是否具备特异性。
在单重ddPCR(实施例3)的基础上，加入第二个目标菌株的检测引物和探针构建二重体系，保持25μL体系不变，同一反应体系中，对于二重ddPCR，两种正向引物的体积比为1:1，两种反向引物的体积比为1:1，两种探针的体积比为1:1；相比单重ddPCR的反应体系，二重ddPCR反应体系的模板量不增加，均为2.0μL。
二重ddPCR体系(每25μL体系)的配制方法：5*PerfeCTa Multiplex qPCRToughMix5.0μL，Fluorescein sodium salt(2.5μM)1.0μL，Template DNA 2.0μL，正向引物(10μM)各2.5μL，反向引物(10μM)各2.5μL，探针(10μM)各0.625μL，ddH2O 5.75μL。
以引物组1、引物组2为例，二重ddPCR体系(每25μL体系)的配制方法：5*PerfeCTaMultiplex qPCR ToughMix 5.0μL，Fluorescein sodium salt(2.5μM)1.0μL，TemplateDNA 2.0μL，Forward Primer 1(10μM)2.5μL，Forward Primer 2(10μM)2.5μL，ReversePrimer 1(10μM)2.5μL，Reverse Primer 2(10μM)2.5μL，Probes 1(10μM)0.625μL，Probes2(10μM)0.625μL，ddH2O 5.75μL。二重ddPCR的反应条件：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。
在相同反应条件和体系下，进行二重qPCR检测，5*PerfeCTa Multiplex qPCRToughMix 5.0μL，Template DNA 2.0μL，Forward Primer(10μM)各2.5μL，Reverse Primer(10μM)各2.5μL，Probes(10μM)各0.625μL，ddH2O补足至25μL。扩增标准程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。
采用上述方法分别进行了二重荧光定量PCR探针法和二重ddPCR探针法特异性检测，检测结果见图7和图8，结果表明设计的引物和探针组合可以用于DA和DC的双重特异性检测。
三重ddPCR体系(每25μL体系)的配制方法：5*PerfeCTa Multiplex qPCRToughMix5.0μL，Fluorescein sodium salt(2.5μM)1.0μL，Template DNA 2.0μL，正向引物(10μM)各2.5μL，反向引物(10μM)各2.5μL，探针(10μM)各0.625μL，ddH2O 0.125μL。
以引物组1、引物组2、引物组3为例，三重ddPCR体系(每25μL体系)的配制方法：5*PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix 5.0μL，Fluorescein sodium salt(2.5μM)1.0μL，Template DNA 2.0μL，Forward Primer 1(10μM)2.5μL，Forward Primer 2(10μM)2.5μL，Forward Primer 3(10μM)2.5μL，Reverse Primer 1(10μM)2.5μL，Reverse Primer 2(10μM)2.5μL，Reverse Primer 3(10μM)2.5μL，Probes 1(10μM)0.625μL，Probes 2(10μM)0.625μL，Probes 3(10μM)0.625μL，ddH2O 0.125μL。扩增标准程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火30s，45个循环。
对构建的三重ddPCR体系进行优化时，首先优化引物和探针浓度，分别使用5、10、15、20μmol/L的引物和探针进行ddPCR扩增。确定体系的最佳引物和探针浓度；其次，在最佳引物和探针浓度的基础上，通过设置不同退火温度对多重ddPCR体系进行退火温度优化，退火温度分别设置55-61℃，梯度进行PCR扩增，根据一维空间图谱靶标微滴区分效果选择最佳退火温度。
经过多种引物和探针组合验证，最终确认上述3种目的病原菌的引物和探针可用于构建三重ddPCR检测体系。结合多重检测体系的配制过程，分别使用5、10、15、20μmol/L的引物和探针进行体系优化，确定体系的最佳引物和探针浓度，结果如图9所示，当引物和探针浓度均为10μmol/L时，各阳性靶标微滴簇相对集中，且阴阳性微滴之间区分较明显，为最佳引物和探针浓度。
设置55-61℃梯度进行多重ddPCR体系扩增的退火温度优化，根据一维空间图谱靶标微滴区分效果选择最佳退火温度，结果如图10所示，退火温度的变化对FAM和HEX通道检测的影响较明显，当退火温度为57℃时，FAM和HEX通道的阴、阳性微滴区分较明显，随着退火温度的降低和增加，各阳性靶标微滴簇呈现逐渐聚集的趋势，此时不利于微滴簇的区分及阴、阳性微滴计数。因此，最终选择57℃作为多重ddPCR体系的优选退火温度。
通过多重ddPCR体系优化，最终确定其反应体系与单重ddPCR类似，反应程序优化后为：95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火30s，45个循环。使用该程序进行特异性验证，结果如图11所示，通过多重ddPCR证实3种目标菌均有相应阳性微滴，同时，设置了阴性菌株和空白作为对照，结果显示均无扩增，说明引物、探针的特异性较好即非目标菌均无特异性扩增，3组引物探针具有良好的特异性，且不会产生交叉反应。
实施例5多重ddPCR体系的定量线性相关性及重复性分析
将3种阳性病原菌基因组DNA混合液从起始浓度1.06ng/μL进行10倍梯度稀释(100-106共7个梯度)，以无菌dd H2O作为空白对照，在相同反应条件和体系下，与多重qPCR进行灵敏度比较，每个样品设置2个重复。
多重qPCR的检测方法包括以下步骤：在相同反应条件和体系下，进行多重qPCR检测，三重qPCR 25μL体系如下：5*PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix 5.0μL，TemplateDNA 2.0μL，Forward Primer 1(10μM)2.5μL，Forward Primer 2(10μM)2.5μL，ForwardPrimer 3(10μM)2.5μL，Reverse Primer 1(10μM)2.5μL，Reverse Primer 2(10μM)2.5μL，Reverse Primer 3(10μM)2.5μL，Probes 1(10μM)0.625μL，Probes 2(10μM)0.625μL，Probes 3(10μM)0.625μL，ddH2O 1.125μL。扩增标准程序：95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火30s，45个循环。
同时进行单重ddPCR(实施例3中的方法)和优化后的多重ddPCR扩增(实施例4中的方法)，分析多重ddPCR检测的重复性和灵敏度，以及3种病原菌单重ddPCR与多重ddPCR检测的线性相关性，每个样品设置3个重复。根据反应获得的微滴数及拷贝数，分别计算每个样品相应稀释度的3个重复拷贝数的平均值及相对偏差(relative standard deviation,RSD)，以RSD<25％作为良好重复性的判断依据。
通过上述方法验证本发明提供的多重ddPCR体系的灵敏性、线性相关性和重复性比较及最低检出限。
将3种病原菌的基因组DNA混合后，进行10梯度稀释、7个梯度样本和2次技术重复，以检测多重ddPCR和多重qPCR体系的灵敏度。结果如图12、图13所示。从图中可以看到，多重ddPCR和多重qPCR的灵敏度相同，均能达到最低检测浓度10.0pg/μL，但多重qPCR无法实现直接进行拷贝数的绝对定量，与多重qPCR相比，多重ddPCR的优势为可以直接进行拷贝数的绝对定量。
为验证构建的多重ddPCR检测体系对于3种病原菌基因组DNA及其混合物拷贝数绝对定量的准确性，将DNA(大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌的基因组DNA初始浓度分别为187.3,102.5和86.7ng/μL)进行100-10-2稀释，分别以各自DNA和混合稀释液(混合液中，三种目标菌株的混合基因组DNA的体积比和质量比均为1:1:1)作为模板，进行单重ddPCR及优化后的多重ddPCR扩增。单重ddPCR与多重ddPCR检测的线性相关性结果如图14所示，ddPCR的定量检测线性范围分别如表6所示。
从表6中可知，当将样品100-10-2稀释时，大豆南方茎溃疡病菌多重ddPCR扩增拷贝数均值分别为22.10、1.84、0.20copies/μL，RSD均小于25％，说明多重ddPCR体系对于大豆南方茎溃疡病菌检测重复性较好。同时，大豆南方茎溃疡病菌多重ddPCR检测在100-10-2范围内线性相关系数R2为0.9991，且与单重ddPCR检测线呈无限接近(图14A)，说明大豆南方茎溃疡病菌单重与多重ddPCR体系检测线性相关性较好，多重ddPCR体系对于大豆南方茎溃疡病菌定量检测的最低检测限为0.20copies/μL。
从表6中可知，当将样品100-10-2稀释时，大豆北方茎溃疡病菌多重ddPCR扩增拷贝数均值分别为37.53、3.76、0.34copies/μL，RSD均小于25％，说明多重ddPCR体系对于大豆北方茎溃疡病菌检测重复性较好。同时，大豆北方茎溃疡病菌多重ddPCR检测在100-10-2范围内线性相关系数R2为0.9998，且与单重ddPCR检测线呈无限接近(图14B)，说明大豆北方茎溃疡病菌单重ddPCR与多重ddPCR体系的检测线性相关性较好，多重ddPCR体系对于大豆北方茎溃疡病菌定量检测的最低检测限为0.34copies/μL。
从表6中可知，当将样品100-10-2稀释时，大豆茎褐腐病菌多重ddPCR扩增拷贝数均值分别为290.97、25.67、2.58copies/μL，RSD均小于25％，说明多重ddPCR体系对于大豆茎褐腐病菌检测重复性较好。同时，大豆茎褐腐病菌多重ddPCR检测在100-10-2范围内线性相关系数R2为0.9998，且与单重ddPCR检测线呈无限接近(图14C)，说明大豆茎褐腐病菌单重与多重ddPCR体系检测线性相关性较好，多重ddPCR体系对于大豆茎褐腐病菌定量检测的最低检测限为2.58copies/μL。
表6单重ddPCR与多重ddPCR的定量检测线性范围
实施例6大豆样品中3种致病菌的检测
收集2021-2023年我国进口的大豆样本，共20份，样品信息见表6。按照植物病原真菌基因组提取试剂盒说明书提取DNA，测定A260/A280、A260/A230、DNA浓度。随后采用本发明所建立的多重ddPCP检测方法对大豆中3种检疫性病原菌进行定量检测，并与多重qPCR的检测结果相比较，保证检测结果的有效性。
表7大豆样品信息明细表
使用大豆基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)(omega Fungal DNA Kit，D3390-02)提取20份样本。提取后检测DNA浓度，检测结果见表8。
表8 20份样品DNA浓度检测结果
将上述样本DNA样本进行三重ddPCR检测，确认样本中是否含有相关病原菌。三重ddPCR检测方法同实施例4，三重ddPCR一维图结果如图15，检测结果如表9。检测结果表明，在20份样本中，仅样品3检出大豆南方茎溃疡病菌，仅样品5、14和17检测到大豆茎褐腐病菌，以上4份样品均来源于巴西；样品4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、17、18和20中都检测到大豆北方茎溃疡病菌，1份样品来源于阿根廷，3份样品来源于美国，10份样品来源于巴西。检测结果与qPCR一致，将测序结果进行Blast比对，与NCBI中记录的大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌相应序列的相似度均在98％以上，说明本发明提供的方法的准确性。
表9 20份样本三重微滴数字PCR拷贝数检测结果
对比例
本发明在进行特异性引物探针筛选试验过程中，通过序列比对，设计了15组引物和探针，经验证发明，存在12组理论上可行但试验效果不理想的引物及探针，详见下表。
表10理论上可行但试验效果不理想的12组引物及探针组合
初步筛选中，使用Sybrgreen嵌合荧光法进行引物和探针筛选，探针未添加荧光基团，以免影响扩增结果的读取。
采用Sybrgreen嵌合荧光法进行引物和探针的初步筛选，试剂采用2*M5 HiPerSYBR Premix EsTaq试剂，仪器采用实时荧光PCR(Bio-Rad，美国，CFX96)。
1、实验方法
(1)采用上、下游引物扩增：25μL体系如下：Template DNA 2.0μL，2*M5 HiPerSYBR Premix EsTaq 12.5μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，ddH2O 9.5μL。两步法PCR扩增标准程序：Step1：95℃30S；Step2：PCR反应；GOTO：39(40Cycles)，95℃5s，60℃30s；Step3：Melt Curve。
(2)采用上游引物与探针扩增：25μL体系如下：Template DNA 2.0μL，2*M5 HiPerSYBR Premix EsTaq 12.5μL，上游引物(10μM)0.5μL，探针(10μM)0.5μL，ddH2O 9.5μL。两步法PCR扩增标准程序：Step1：95℃30S；Step2：PCR反应；GOTO：39(40Cycles)，95℃5s，60℃30s；Step3：Melt Curve。
2、实验结果：
(1)DA特异性引物和探针初步筛选
菌株设置为：阳性对照：DA1、2、3，阴性对照：DC3、CG1、Diaporthe phaseolorum菜豆间座壳菌、Phytophthora sojae大豆疫霉、Phomopsis longicolla大豆拟茎点种腐病菌、Colletotrichum truncatum平头炭疽菌、Macrophomina phaseolina大豆炭腐病菌、无菌大豆、水。分别进行引物和探针组合A、B、C的筛选，筛选结果见图16、图17、图18，结果表明引物和探针组合A、B、C均不能用于DA的特异性检测。
(2)DC特异性引物和探针初步筛选
菌株设置为阳性对照：DC1、2、3，阴性对照：DA4、CG2、Diaporthe phaseolorum菜豆间座壳菌、Phytophthora sojae大豆疫霉、Phomopsis longicolla大豆拟茎点种腐病菌、Sclerotinia sclerotiorum大豆菌核病菌、Fusarium oxysporum尖孢镰刀菌、无菌大豆、水。分别进行引物和探针组合D、E、F的筛选，筛选结果见图19、图20、图21，结果表明引物和探针组合D、E、F均不能用于DC的特异性检测。
(3)CG特异性引物初步筛选
菌株设置为阳性对照：CG1、2，阴性对照：DA5、DC6、Phialophora malorum苹果边腐病菌、Phytophthora sojae大豆疫霉、Phomopsis longicolla大豆拟茎点种腐病菌、Colletotrichum truncatum平头炭疽菌、Macrophomina phaseolina大豆炭腐病菌、Sclerotinia sclerotiorum大豆菌核病菌、无菌大豆、水。分别进行引物和探针组合G、H、I、J、K、L的筛选，筛选结果见图22、图23、图24、图25、图26、图27，结果表明上述组合G至组合L存在非特异性扩增，不能用于CG的特异性检测。
本发明建立了精准、可靠的植物病原菌定量检测方法，准确估计病原菌的种群数量，对于深入研究植物病害的流行规律，提高病害预测的准确性具有重要意义。本发明以大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌3种常见检疫性病原菌为研究对象，通过生物信息学筛选DNA条形码，获得以翻译延长因子1α基因(TEF1)和β-微管蛋白基因(TUB2)为靶标的特异性引物与探针，分别构建3种目标菌株的单重ddPCR检测体系。在此基础上，通过引物和探针浓度和退火温度的优化，构建可在同一反应体系中快速、绝对定量检测大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌和大豆茎褐腐病菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系。研究结果表明，3种病原菌DNA样品等浓度混合时，多重ddPCR体系内各组引物探针对目标菌株均能扩增，未出现交叉反应，最低DNA浓度检测浓度为10.0pg/μL；大豆南方茎溃疡病菌的绝对定量检测低限为0.20copies/μL，大豆北方茎溃疡病菌的绝对定量检测低限为0.34copies/μL，大豆茎褐腐病菌的绝对定量检测低限为2.58copies/μL，在定量检测范围内的线性相关系数R2均大于0.999，且重复性较好，3种病原菌的多重ddPCR检测体系与单种菌的单重ddPCR定量线性范围几乎一致。本发明建立的方法可实现对进口大豆中3种常见检疫性病原菌的高效率、高精度的检疫鉴定和疫情监控，为外来有害生物防控和保护我国生态安全提供技术服务和支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检疫的引物组，其特征在于，包括：引物组1、引物组2、引物组3中的一种或几种组合；
所述引物组1包括正向引物1、反向引物1、探针1中的一种或几种的组合；正向引物1包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，反向引物1包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，探针1包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
所述引物组2包括正向引物2、反向引物2、探针2中的一种或几种的组合；正向引物2包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，反向引物2包括SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，探针2包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述引物组3包括正向引物3、反向引物3、探针3中的一种或几种的组合；正向引物3包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，反向引物3包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，探针3包括SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述引物组，其特征在于，探针1包括HEX基团；探针2包括FAM基团；探针3包括Cy5基团。
3.权利要求1或2所述引物组在大豆检疫性病原菌检测中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，大豆检疫性病原菌包括大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种或几种。
5.权利要求1或2所述引物组在制备大豆检疫性病原菌检测试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，大豆检疫性病原菌包括大豆南方茎溃疡病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆茎褐腐病菌中的一种或几种。
7.一种用于检测大豆检疫性病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1或2所述引物组对待检测的样品DNA进行PCR检测。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述PCR检测为ddPCR检测。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，引物浓度为10μmol/L，探针浓度为10μmol/L。
10.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，PCR扩增的条件包括：95℃预变性3min；95℃变性10s，57-58℃退火30s，45个循环。
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