CN115927705A

CN115927705A - 常见皮肤癣菌的快速多重检测方法

Info

Publication number: CN115927705A
Application number: CN202210895408.4A
Authority: CN
Inventors: 曹泽晖; 莫小辉; 宋佳; 谭蔚泓; 鞠强; 孙迪; 田瑞
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2022-07-27
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明公开了用于快速鉴定多种皮肤癣菌的引物组。基于k‑mer比对计数策略的序列设计新工具，设计筛选获得针对常见的皮肤癣菌红色毛癣菌，须癣毛癣菌，以及犬小孢子菌的扩增引物及探针序列，最终获得了一组能够特异性扩增多种皮肤癣菌的引物，建立了多重荧光定量PCR反应体系，并优化获得了合适的扩增条件。本发明因此建立了一套能够快速鉴定常见皮肤癣菌的检测体系，可以实现对多种真菌的同时快速鉴定，2小时左右即可获得检测结果，大大优于常规的真菌培养，显微检测的方法，且最低检测限能够达到0.025pg/μL，通过对实际临床样本的检测对比，与镜检方法的结果一致，具有极高的灵敏度、特异性和准确性。

Description

常见皮肤癣菌的快速多重检测方法

技术领域

本发明涉及分子检测领域，具体涉及用于快速鉴定红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)的引物组及其应用。

背景技术

皮肤癣菌病主要致病菌是皮肤癣菌，包括毛癣菌属、小孢子菌属和表皮癣菌属3个属，其共同特点是亲角质蛋白，侵犯人和动物的皮肤、毛发、甲板，引起感染。皮肤癣菌的种类有40多种，最常见的是毛癣菌属的红色毛癣菌和须癣毛癣菌，以及小孢子菌属的犬小孢子菌等。皮肤癣菌具有很强的传染性，可以在人与人,动物与人,污染物与人之间传播。足癣是最常见的皮肤真菌感染,从行病学调查数据来看,全球自然人群发病率在10％以上。可因混穿鞋袜,裸足在公共浴室、健身房、游泳池等场所行走,密切接触病原菌而被感染。此外，随着家庭饲养宠物的增多，感染动物源性的体癣患者也随之增加(以犬小孢子菌感染最为多见)。

皮肤癣菌对患者的健康、工作、社交及日常生活有明显的影响,如超过半数的患者因为瘙痒而影响睡眠甚或工作及生活。甲癣(俗称灰指甲)可以引起疼痛或引发甲沟炎，甚至会因甲的异常形态影响正常的社会交往。年老者及免疫力低下人群感染皮肤癣菌如果长期未获得有效治疗可能发展成癣菌疹，又因皮肤屏障的破坏继发细菌感染、形成丹毒、蜂窝织炎以及皮肤溃烂，造成严重的不良后果。因此，积极诊治皮肤癣菌病具有重要的临床价值和社会价值。

皮肤癣菌随着地理环境和社会经济条件而演变。一个世纪前，絮状表皮癣菌是浅表真菌病的最主要病原体，但自20世纪中期以来，它的发病率急剧下降，目前仅限于一些欠发达国家。同时，红色毛癣菌、须癣毛癣菌和小孢子菌的频率逐渐增加，这些真菌已成为全球的主要种类。目前，红色毛癣菌是皮肤和指甲真菌感染的主要病原体，而小孢子菌是头癣的主要皮肤真菌。此外，红色毛癣菌和须癣毛癣菌对特比萘芬和氟康唑等药物的耐药的报道越来越多。区分皮肤癣菌的种类对不同类型的皮肤癣菌病的治疗方案和药物的选择具有一定的指导作用。

另一方面，造成皮肤病的因素多种多样，皮肤癣菌只是其中常见的一种，部分患者临床表现与湿疹、神经性皮肤、汗疱疹等疾病的症状类似，无法仅凭临床表现来判断。部分医生对此病缺乏与其他皮肤病鉴别诊断的经验,误诊误治时有发生,以致临床上误用或滥用糖皮质类固醇激素制剂而导致皮肤真菌感染的扩散。针对皮肤癣菌的实验室检测是确诊该病必不可少的诊断手段。

目前，皮肤癣菌的常规实验室检测方法包括真菌镜检和真菌培养。真菌镜检指用显微镜直接观察临床样本寻找皮肤癣菌，检出率较低。而真菌培养是指提供合适的生长条件和生长介质帮助临床样本中的皮肤癣菌大量繁殖，从而能够在显微镜下更容易看到。整个过程耗时长(需要2-6周)，同时培养环境需要严格控制，容易造成致病皮肤癣菌难以繁殖或者环境真菌大量繁殖引起污染，从而严重影响结果的准确性。另外，两种方法都需要利用显微镜，凭借检测人员的经验对真菌的形态进行比较判断给出诊断结果，因此高度依赖于操作人员的临床经验和每次真菌培养的实际效果。由此可见，目前临床上的检测方法难以满足临床诊断时效性和可靠性要求。

近年来分子生物学诊断也不断应用于临床研究。这项技术是基于真菌的特异基因序列而不是形态差别，因此具有特异性高，无需人工解读的特点。同时由于使用PCR(聚合酶链式反应)技术对基因进行极高倍数扩增，使得未经培养的微量真菌也有可能被检测到，大大节省了检测时间。尽管如此，分子诊断用于真菌检测还存在一系列问题，影响了它的临床应用，包括临床标本中真菌核酸难以提取(皮肤癣菌为丝状真菌，细胞壁含有丰富的几丁质，细胞壁不易破裂)，不同种真菌序列存在相似性难以区分等。这些都使得目前市场上没有用于皮肤癣菌的分子诊断产品。

基于皮肤癣菌的高发病率和临床诊断的需求，以及日益增长的宠物市场，开发皮肤癣菌的分子诊断试剂具有可观的社会价值和经济价值。本专利主要针对人和宠物相关皮肤癣菌病中最重要的3种致病菌(包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌和小孢子菌)进行检测，能够对大多数皮肤癣菌病筛查出明确的病原体。本专利涉及的检测方法不仅有助于提高皮肤癣菌病的诊断水平、避免漏诊和误诊，同时还为医师的治疗方案提供依据、指导临床合理的用药。

实现皮肤癣菌多重分子检测的难点是多方面的。真菌的分子检测一般是基于真菌基因组里的位于几个核糖体RNA基因之间的ITS(Internal transcribed spacer)序列。这些序列在每个基因组里有多达成百上千个拷贝。相对于每个基因组一般只有两个拷贝的其它基因，检测ITS序列能大大提高信号以及灵敏度。另一方面，不同真菌物种的ITS序列之间存在一定差异。这也是利用ITS序列进行物种鉴定的分子基础。然而，真菌的ITS序列很短，一般只有400-700个碱基对的长度，而一个PCR检测反应就需要100个碱基对左右。再加上真菌的种类繁多，有记录的就有近15万种，并且彼此之间存在关联，使得ITS序列在不同真菌之间存在一定相似性。因此，要在700个碱基对以内设计出多个分子检测反应，来从十几万种可能性中特异性的检测出几种常见皮肤癣菌，而且彼此之间还不能互相干扰，难度非常大。也造成了目前没有针对皮肤癣菌的多重检测技术的局面。

PCR是一种常用分子生物学技术，可用于将微量目标核酸序列(例如待测基因序列)扩增至可检测的量。其原理是利用能识别目标序列的DNA引物与目标特异性结合，并在DNA聚合酶的作用下对目标序列进行指数级复制和扩增。在分子诊断中常用的荧光定量PCR则在普通PCR的基础上引入荧光标记的探针，利用在扩增过程中产生的荧光信号对目标序列进行实时检测和定量。在多重定量PCR技术中，针对不同的靶标采用各自特异的荧光探针并携带不同颜色的荧光标记，使得多个靶标可以被同时检测。

发明内容

现有技术中关于真菌的基因检测的报道大部分是针对单一菌种的检测，而临床上需要同时检测多种常见皮肤癣菌。使用单通量、一个反应检测一种真菌的方法需要的试剂，耗材，人工都成倍的增长。因此临床上急需多重检测技术实现一个反应检测多个常见皮肤癣菌。

为了解决这个问题，本发明人通过生物信息学手段建立了序列分析算法，利用高性能计算机分析海量现有真菌基因组序列，从中搜索在目标物种里普遍存在，而其它物种中不存在或者差异很大的ITS序列。利用这些序列设计出针对几种常见皮肤癣菌的分子检测方法，并在实际真菌样品上进行测试验证。经过多轮序列搜索和实验验证最终得到优化的多重检测方法，能在一个反应里高灵敏和高特异的同时检测出多种常见皮肤癣菌。

针对临床上皮肤癣菌的发生情况，选择了三种常见皮肤癣菌作为临床诊断的目标物种：红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)。这三种真菌涵盖了大约75％真菌引起的临床皮肤病病例。

为了寻找针对这三种真菌的特异性靶标序列，本发明开发了一套基于k-mer比对计数策略的序列设计新工具，该工具实现了高特异性序列的快速、准确、灵活搜寻，使得找到的序列在目标物种内普遍存在而在目标物种外存在的几率极低，可应用于不同的实验目的。

为实现本发明，特提供了如下技术方案。

本发明公开了用于快速鉴定多种皮肤癣菌的引物组，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)，其中，鉴定红色毛癣菌的引物如SEQ ID NO.13-14所示，鉴定须癣毛癣菌的引物如SEQ ID NO.22-23所示，鉴定犬小孢子菌的引物如SEQ ID NO.37-38所示。

优选的，还包括真菌通用扩增引物，所述真菌通用扩增引物如SEQ ID NO.46-47所示。

优选的，还包括探针，其中结合红色毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.15所示，结合须癣毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.24所示，结合犬小孢子菌的探针序列如SEQ ID NO.39所示，用于真菌通用的探针如SEQ ID NO.48所示。

优选的，所述探针采用荧光基团标记。

优选的，所述荧光标记基团选自FAM、HEX、BHQ、Texas Red以及Cy5。

本发明公开了所述引物组的扩增方法，所述方法的扩增条件为：1)95℃，1分钟；2)45个循环的“95℃，5秒钟；60℃，15秒钟”。

本发明公开了一组皮肤癣菌的ITS组合，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)，其中，红色毛癣菌的ITS序列如SEQ ID NO.40所示，须癣毛癣菌的ITS序列如SEQ ID NO.42所示，犬小孢子菌的ITS序列如SEQ ID NO.45所示。

本发明公开了引物组，所述引物组特异性的扩增所述的皮肤癣菌的ITS。

本发明公开了快速鉴定多种皮肤癣菌的检测试剂，所述试剂包括所述的引物组和/或所述的ITS组合。

优选的，所述试剂还包括裂解液。更优选的，所述裂解液为20mM Tris-HCl pH8.0，0.5％TritonX-100，1mM EDTA。

本发明公开了快速鉴定多种皮肤癣菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物组和/或所述的ITS组合和/或所述的试剂。

本发明基于k-mer比对计数策略的序列设计新工具，设计获得针对常见的皮肤癣菌红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)的扩增引物及探针序列，通过筛选和鉴定，获得了一组能够特异性扩增这种皮肤癣菌的引物组合物，建立了荧光定量PCR反应体系，并优化获得了合适的扩增条件。通过裂解液对皮肤或指甲样本处理，建立了一套能够快速鉴定常见皮肤癣菌的检测体系，利用该体系可以实现对样本的快速鉴定，2小时左右即可获得检测结果，大大优于常规的真菌培养，显微检测的方法，且最低检测限能够达到0.025pg/μL，通过对实际临床样本的检测对照，与镜检方法的结果完全一致，具有极高的灵敏度、特异性和准确性。

附图说明

图1为红毛2引物扩增曲线图。

图2为红毛3引物扩增曲线图。

图3为红毛5引物扩增曲线图。

图4为须毛1引物扩增曲线图。

图5为须毛3引物扩增曲线图。

图6为犬小2引物扩增曲线图。

图7为犬小5引物扩增曲线图。

图8为三种真菌在多重检测反应体系的扩增曲线。

图9为显微镜检几种皮肤癣菌的培养结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1基于k-mer比对计数策略的序列设计

1.建立数据库：本比对计数策略可以应用于任何来源、不限制大小的序列数据。因此，我们通过文献调研和数据库(NCBI、Silva，尤其是UNITE)搜索，构建了物种分类全面、注释清晰、完整且具有一定冗余度的真菌ITS序列数据库。UNITE(https://unite.ut.ee)是一个基于网络的真菌分子鉴定数据库和序列管理环境。它的目标是形成正式的真菌条形码—核糖体内部转录间隔区(ITS)区域，并提供所有～1,000,000公共真菌ITS参考序列。这些被归类为～459,000个假定物种，并分配数字对象标识符(DOIs)。

2.K-mer提取和聚类：通常探针设计需要的长度在25-30bp，而为了能设计完整的荧光定量PCR反应，本发明所需要的真菌靶标序列需要100个碱基甚至更长。本比对计数策略的优势之一是可搜索最长至135bp的序列。根据注释信息，将数据库分为目标库(由目标物种对应ITS序列组成的序列库)和背景库(非目标物种对应ITS序列组成的序列库)。在生物信息学中,k-mers是包含在生物序列中的长度为k的连续子序列。根据实际所需长度分别提取k bp的k-mer序列，并筛选特异性存在于目标库的k-mer序列，进一步利用一种贪婪的增量聚类方法将高度相似的序列进行聚类以获得代表性序列。

3.比对和计数：本比对计数策略的另一优势是可灵活调整比对标准，通过设置比对软件所允许的编辑距离数目(允许存在碱基的错配、插入或缺失)，实现不同应用场景的调试；并设计了多线程并行计算，提高比对速度。利用适合短序列的比对工具将代表性序列分别比对至目标库和背景库，并计算其成功比对数和整体比对率，最终对每条序列进行打分，即：特异性分数＝背景库比对率-目标库比对率。

4.序列评估：由于自然界生物物种及其遗传变异和生态系统的复杂性，不同的目标物种具有不同程度的特异性和保守性，使得序列筛选没有统一标准。通常，选择特异性分数最高的序列用于后续实验，但仍需结合物种的生物学背景、用途或其他结构信息进行综合评估和分析。

通过上述全面的生物信息学分析得到针对三种皮肤癣菌的候选特异ITS序列，这些序列在目标物种内普遍存在而在目标物种外存在的几率极低。尽管如此，这些通过数据库找出的序列是否真正对目标物种特异还需要在真实世界的样品中进行验证。本发明人针对这些序列设计了引物探针组合并应用荧光定量PCR进行了验证。在验证结果不理想，找到的ITS序列不够特异灵敏的情况下，再对生物信息学分析的参数做调整，放松或收紧搜索条件从而找到新的候选序列并进行新的验证。这个过程被不断重复直至找到对三种皮肤癣菌各自高度特异的ITS序列。表1列出了本发明针对各皮肤癣菌设计和测试过的引物探针组合。

表1：基于k-mer比对计数策略设计的皮肤癣菌的引物及探针序列

实施例2临床样本的处理及PCR反应体系的建立

临床样品的检测主要由两个部分组成：

样品处理与核酸提取：从病人皮肤或指甲收集的组织样本存放于小离心管中，向其加入50微升的裂解液(20mM Tris-HCl pH 8.0，0.5％TritonX-100，1mM EDTA)并在80摄氏度孵育30分钟。溶液冷却后加入2微升20mg/mL的蛋白酶K，于55摄氏度孵育30分钟然后80摄氏度2分钟。溶液冷却后静置或者离心，取一定量上清液作为下一步多重定量PCR检测的模板。

多重PCR:

12.5uL的2倍qPCR反应混合液(NEB Luna Universal Probe One-Step ReactionMix)，0.3μL的10μM浓度的各真菌靶标的引物(包括上游和下游引物)，0.3μL的10μM浓度的各真菌靶标的探针，2μL待测RNA样品，加适量纯水到总反应体积20μL。

qPCR运行于罗氏LightCycler 480II荧光定量PCR仪器，反应条件如下：1)95℃，1分钟；2)45个循环的(95℃，5秒钟；60℃，15秒钟)。

在每个PCR循环，荧光定量PCR仪会对每个荧光通道的荧光信号进行读取，并以此绘制每个通道的扩增曲线。在反应结束后利用扩增曲线，仪器自动计算出每个通道对应基因的Ct值(循环数阈值，越小代表浓度越高)。

实施例3红色毛癣菌引物探针组合的筛选和验证

为了验证实施例1中这些引物探针组合，本发明人收集了一系列实验室培养并且显微镜证实的真菌物种，包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌各两个样品，以及作为对照的其它真菌：黄曲霉菌、暗色孢科真菌和念珠菌。每一组引物探针组合都会在所有这些真菌样品的核酸提取物中分别进行荧光定量PCR检测。检测反应得到的扩增曲线的Ct值列于表2中(“/”表示没有扩增)。在目标物种以外的样品中产生了扩增表明该引物探针组合在实际样品检测中会检测到非目标物种，其结果是不够特异的，会造成临床诊断的错误。从表2结果可以看出，不是所有生物信息学分析得到的序列都能做到高度特异，例如红毛1和红毛2引物探针组能检测到大多数真菌样品。另一方面，在提高了特异性搜索要求的情况下又可能造成目标物种都难以检测到，如红毛3和红毛4引物探针组未能检测到任何真菌样品。只有在不断优化生物信息学分析方法和参数后才能逐渐寻找到兼顾高度特异性和检测灵敏度的ITS序列。表2显示引物探针组合红毛5、须毛2、须毛3、犬小3、犬小4、犬小5能做到只检测出相应的目标物种而对其它物种没有反应，表现出了高度的特异性；犬小5在三组犬小引物探针组合里产生了最小的Ct值，从而能够提供最灵敏的检测。

表2：皮肤癣菌各引物组合PCR扩增的Ct值

其中，以上特异的引物探针组合相对应的ITS序列如下：

红毛5：

须毛2：

须毛3：

犬小3：

犬小4：

犬小5：

从表2中选取了几组引物探针组合，用它们的扩增曲线图来演示它们对各自靶标物种不同的特异性,其中，红毛2，3，5；须毛1，3；犬小2，5的扩增曲线参见图1-图7。

由图1-图7可见，尽管同样经过了生物信息学分析，不同的引物探针设计在进行实际样品的验证当中会表现出不同的特异性。当使用从不同种类真菌中提取的核酸作为PCR模板时，红毛2引物探针组合能够将所有真菌的核酸扩增出来，意味着几乎没有针对红色毛癣菌的特异性。同样的测试中，红毛3这组引物探针组合未能扩增出任何样品，显示了这组引物探针特异性过强或者针对的真菌序列非常罕见。当红毛5引物探针组被用来测试多种真菌时，只有红色毛癣菌样品被正确的扩增出来，而其它5种物种都未能产生任何扩增，显示了对红色毛癣菌优异的特异性。同样的，须毛1和犬小2组合都扩增出多个物种，特异性低；而须毛3组合仅扩增出须癣毛癣菌，犬小5仅扩增出犬小孢子菌，显示出很高的特异性。

通过上述实验，从实施例中设计的特异ITS序列及相应的引物探针组中通过筛选，获得相关应的引物对和探针组合，再联合真菌通用引物探针组，构建了全新的针对皮肤癣菌的多重定量PCR检测方法用于后续实验。其中，真菌通用引物探针组合是通过文献搜索和自主设计得到的针对所有真菌物种一组引物探针，它的目的是在致病真菌不属于以上三种主要皮肤癣菌的情况下揭示皮肤病是否由真菌引起。构建的多重定量PCR检测方法所用的引物和探针如下(按从5’端到3’端顺序；探针的5’端带有不同荧光基团，而3’端带有荧光淬灭基团)：

红色毛癣菌：

引物F：5’-CAGACTGACAGCTCTTCAGA-3’(SEQ ID NO:13)

引物R：5’-CTTCTGGGAGCCTCGAG-3’(SEQ ID NO:14)

探针：5’-/FAM/-TGGTGTCTGTCCTCCGGCGG-/BHQ-1/-3’(SEQ ID NO:15)

须癣毛癣菌：

引物F：5’-GCGTTTAGCCACTAAAGAGAG-3’(SEQ ID NO:22)

引物R：5’-TGTCTACCTTACTCGGTTGC-3’(SEQ ID NO:23)

探针：5’-/HEX/-TCTCCTGAGAGAGCGCGGCC-/BHQ-1/-3’(SEQ ID NO:24)

犬小孢子菌：

引物F：5’-GGATCACTCTGGAAAACACAC-3’(SEQ ID NO:37)

引物R：5’-CAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’(SEQ ID NO:38)

探针：5’-/Texas Red/-ACATACCGTCTGAGCGAGCAACGC-/BHQ-2/-3’(SEQ ID NO:39)

真菌通用：

引物F：5’-TCGATAACGAACGAGACCT-3’(SEQ ID NO:46)

引物R：5’-CAGCCATTCAATCGGTAGT-3’(SEQ ID NO:47)

探针：5’-/Cy5/-CGTCCCTGCCCTTTGTACACACCG-/BHQ-3/-3’(SEQ ID NO:48)。

实施例4三种真菌在多重检测反应体系里的特异性和检测限

为了确定使用实施例3确定的多重检测反应时三种真菌的特异性和检测限，从培养的三种真菌样品中使用商业的真菌核酸提取试剂盒(Quick-DNA Fungal/BacterialMicroprep Kit，货号：D6007，Zymo Research)进行了核酸提取，并使用Qubit荧光定量仪(赛默飞)进行了DNA浓度测定，得到了红色毛癣菌，须癣毛癣菌，和犬小毛癣菌样品的起始总DNA浓度分别为：0.532，4.28，和0.132ng/μL。对这些样品进行连续稀释后作为模板加入多重检测反应体系中进行扩增反应，得到如下四个荧光通道的扩增曲线，参见图8。

由图8可见，在FAM，HEX，和Texas Red荧光通道中，只有各通道相对应的真菌物种的连续稀释样品能被检测到，显示了即使将不同真菌的引物探针组混合在一起构建成多重检测反应，各引物探针组针对靶标真菌的高度特异性依然得到了很好的保留，并且没有交叉反应。另一方面，Cy5通道监测的是真菌通用引物探针反应，因此所有真菌种类的稀释样品都产生了扩增信号。

根据最低能检测到的样品的稀释倍数，计算出红色毛癣菌，须癣毛癣菌和犬小孢子菌在多重检测反应中的检测限分别是：0.025，2.1，和0.14pg/μL总DNA。

实施例5临床皮肤病样品的分子检测

从皮肤病人患处刮取下来的皮肤或指甲碎屑样本一部分经过真菌培养和显微镜检(2-6周)确定致病菌种类，显微镜检的几种皮肤癣菌的培养结果参见图9。另一部分被收集在离心管里并经过样品处理、核酸提取和多重PCR检测步骤得到分子检测结果(2小时左右)。两者的结果列于下表3中进行比较：

表3：临床皮肤样本的检测结果

由表3可见，2小时左右得到的分子检测结果与花费数周得到的培养结果基本上一致。不同样品组织，皮肤或指甲，对分子检测没有影响，同样能得到可靠的检测结果。在培养失败未获得结果或者结果不明朗的情况下，分子检测依然能鉴定出真菌种类或者确定样品中含有真菌。有少量样品培养得到一种真菌而分子检测测得多种真菌，其原因可能是分子检测灵敏度更高，可将样品中含量较少的真菌一同检测出来，而真菌培养中往往只有数量占优的真菌能够得到充分繁殖并在显微镜下显现出来。由此可见，分子检测因其高灵敏度高特异性，能够提供比现有诊断手段更多的关于皮肤病患者病因的信息。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.用于快速鉴定多种皮肤癣菌的引物组，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)，其特征在于，鉴定红色毛癣菌的引物如SEQ ID NO.13-14所示，鉴定须癣毛癣菌的引物如SEQ ID NO.22-23所示，鉴定犬小孢子菌的引物如SEQ ID NO.37-38所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括真菌通用扩增引物，其特征在于，所述真菌通用扩增引物如SEQ ID NO.46-47所示。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括探针，其中结合红色毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.15所示，结合须癣毛癣菌的探针序列如SEQ ID NO.24所示，结合犬小孢子菌的探针序列如SEQ ID NO.39所示，用于真菌通用的探针如SEQ ID NO.48所示。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述探针采用荧光基团标记。

5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述荧光标记基团选自FAM、HEX、BHQ、Texas Red以及Cy5。

6.权利要求1-5任一权利要求所述引物组的扩增方法，其特征在于，所述方法的扩增条件为：1)95℃，1分钟；2)45个循环的“95℃，5秒钟；60℃，15秒钟”。

7.一组皮肤癣菌的ITS组合，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)，其特征在于，红色毛癣菌的ITS序列如SEQ ID NO.40所示，须癣毛癣菌的ITS序列如SEQ ID NO.42所示，犬小孢子菌的ITS序列如SEQ ID NO.45所示。

8.引物组，其特征在于，所述引物组特异性的扩增权利要求7所述的皮肤癣菌的ITS。

9.快速鉴定多种皮肤癣菌的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-5任一所述的引物组和/或权利要求7所述的ITS组合。

10.快速鉴定多种皮肤癣菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的引物组和/或权利要求7所述的ITS组合和/或权利要求8-9任一所述的试剂。

11.权利要求1-5任一所述的引物组和/或权利要求7所述的ITS组合在制备检测多种皮肤癣菌的试剂中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，所述皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，以及犬小孢子菌(Microsporumcanis)。