WO2021212523A1 - 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对、探针、试剂盒，试剂盒包含针对可作为SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对和探针：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的试剂盒，以巢式RPA方法对SARS-CoV-2病毒进行核酸检测，最低可检测到1copy/ul的SARS-CoV-2核酸片段，具有超高灵敏度，为新冠病毒SARS-CoV-2的早期发现、早期隔离、早期治疗提供新的技术支撑，具有非常好的应用前景。
Description
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用。
从2020年1月底以来，在全球爆发了大规模的新型冠状病毒感染性肺炎(COVID-19)的疫情。COVID-19的特点是潜伏期长、传染性强及死亡率高。该流行病传播迅速，造成巨大的社会危害。新冠肺炎COVID-19是由一种新型的冠状病毒SARS-CoV-2感染所致。
冠状病毒(Coronavirus,CoV)是一种包膜的单链RNA病毒，在人类、及其它哺乳动物和鸟类中广泛传播，能引起呼吸系统、肠、肝及神经系统疾病。已知有7种冠状病毒使人类致病，其中4种如Cov-229E,Cov-OC43,Cov-NL63和Cov-HKU1在人群中流行，常引起普通感冒症状。另外3种冠状病毒SARS-CoV,MERS-CoV和SARS-CoV-2具有高度的危险性，会导致严重的肺炎甚至死亡。
到2020年4月1日为止，有超过80万的人被确诊为COVID-19。同时，每天还有许多疑似COVID-19患者需要确诊。新冠病毒的防控措施中，早诊断、早治疗是关键。病毒核酸检测是快速诊断COVID-19的重要手段，目前的核酸检测方法主要是荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，根据中国在线数据，中国115家公司已经开发了116种检测SARS-CoV-2核酸的试剂盒，其中98种(84.5％)试剂盒采用RT-qPCR技术。
但是，基于RT-qPCR的病毒核酸检测技术，在临床应用中遇到了一些疑难问题，在中国多个城市的诸多医院中均有“假阴性”结果的报道。而且，发现有些患者经过正规治疗后两次核酸检测阴性，然而在隔离和观察14天后，他们的核酸检测结果又重新阳性。这个假阴性结果大大增加COVID-19疫情防控的复杂性。
病毒核酸检测，从患者采集样本到完成检测报告，要经历许多步骤，包括样本采集、样本保存、样本传送至检测实验室、病毒灭活、细胞溶解、核酸提取、检测并出具检测报告。其中任何步骤出现一点问题都可能导致假阴性结果。其中，高灵敏度、高特异性和高重复性的检测技术，对于提高SARS-CoV-2核酸检测质量和减少实验假阴性率至关重要。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合(重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)对DNA模板进行特异性扩增，可在接近体温条件下实现快速特异性扩增(25℃-42℃，5-30min)，作为一种等温技术减少了对高精度昂贵仪器、稳定电力 供应设施及高级别实验室的依赖，只需要一个恒温装置就可完成，且可通过荧光分析装置判别是否存在扩增产物，具有对设施和操作要求均较为简单的特点，已应用于生命科学研究、医学检测、农业、食品安全、转基因检测等多个领域。
目前，由SARS-CoV-2引起的COVID-19疫情，在全球多个国家越来越严重。截至2020年4月21日，在中国(包括香港、澳门和台湾)之外的206个国家和地区，有超过242万人被确诊感染COVID-19，至少16.7万人死亡。因此，为防控COVID-19疫情蔓延，急需开发出具有高灵敏度和快速的新型检测技术。
发明内容
本发明要解决目前缺乏快速、准确检测SARS-CoV-2试剂盒的技术问题，提供一种基于巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒具有超高灵敏度，能快速、精准、特异地对SARS-CoV-2进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种以巢式RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对，所述引物对是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
优选的，所述引物对是扩增SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8中任一基因片段的引物对。
所述扩增SEQ ID NO：1所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，内引物对SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
所述扩增SEQ ID NO：2所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，内引物对SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
所述扩增SEQ ID NO：3所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21，内引物对SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
所述扩增SEQ ID NO：4所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，内引物对SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。
所述扩增SEQ ID NO：5所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，内引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。
所述扩增SEQ ID NO：6所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，内引物对SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
所述扩增SEQ ID NO：7所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，内引物对SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
所述扩增SEQ ID NO：8所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46，内引物对SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48。
在本发明的另一方面，还提供了一种以巢式RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的探针，所述探针是特异性针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的探针：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
优选的，所述探针与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8中任一基因片段的部分序列特异性杂交。
更优选的，所述探针包括：
与SEQ ID NO：1基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：9所示序列的探针；
与SEQ ID NO：2基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：14所示序列的探针；
与SEQ ID NO：3基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：19所示序列的探针；
与SEQ ID NO：4基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：24所示序列的探针；
与SEQ ID NO：5基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：29所示序列的探针；
与SEQ ID NO：6基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：34所示序列的探针；
与SEQ ID NO：7基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：39所示序列的探针；
与SEQ ID NO：8基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：44所示序列的探针。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，包含上述引物对，和与该引物对相对应的探针以及其它必需的配套缓冲液和酶等。
优选的，所述试剂盒包含SEQ ID NO：29所示序列的探针，和扩增SEQ ID NO：5所示基因片段的引物对，该引物对包含：外引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，内引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。
优选的，所述试剂盒包含SEQ ID NO：39所示序列的探针，和扩增SEQ ID NO：7所示基因片段的引物对，该引物对包含：外引物对SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，内引物对SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种以巢式RPA检测病毒的方法，包括以下步骤：
用一对外引物以病毒核酸为模板进行第一次RPA反应，扩增目的基因第一片段；
用一对内引物以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在增加信号探针的条件下进行第二次RPA反应，扩增目的基因第二片段；
通过检测探针信号，获得病毒核酸的检测结果。
所述信号探针为带有信号标记的探针，通常为带有荧光素标记的探针，如FAM荧光素标记探针。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对，所述引物对是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
优选的，所述引物对是针对SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF7a、ORF7b、ORF8三个基因设计的引物对，用于扩增SEQ ID NO：5所示基因片段。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的探针，所述探针是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的探针：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
优选的，所述探针与SEQ ID NO：5所示基因片段的部分序列特异性杂交。
本发明检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的试剂盒，采用巢式RPA方法对SARS-CoV-2病毒进行核酸检测，最低可检测到1copy/ul的SARS-CoV-2核酸片段，具有超高灵敏度，为新冠病毒SARS-CoV-2的早期发现，早期隔离，早期治疗提供技术支撑，具有非常好的应用前景。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的引物设计示意图；
图2是本发明实施例1的16对引物的LOD柱状图；
图3是本发明实施例2的用Fragment 5和Fragment 7的引物对和探针进行巢式RPA检测的灵敏度结果图；
图4是本发明实施例3的复工人员体检样本的巢式RPA检测结果图；
图5是本发明实施例3的巢式RPA检测结果为阳性的扩增产物的高通量测序图。
由SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒感染肺炎(COVID-19)疫情的传播肆虐全球，形势 十分严峻。SARS-CoV-2核酸检测是COVID-19诊断的主要手段，本发明超高灵敏度的检测新技术为SARS-CoV-2的早期发现，早期隔离，早期治疗带来了新的希望。
本发明提出巢式RPA(Nest recombinase polymerase amplification，nestRPA)概念，并基于荧光检测分析仪研发出超高灵敏度的SARS-CoV-2核酸检测技术，实验室条件下可以检出1copy/ul的SARS-CoV-2核酸片段。临床样本验证发现：nestRPA技术可100％地检出qPCR检测结果为阳性的样本，其中1例qPCR检测结果为阳性的样本经过11次10倍系列稀释后，nestRPA检测结果仍是阳性，而该样本经过第三次稀释，qPCR检测结果已经是阴性。nestRPA扩增产物经高通量测序验证，100％地检测到靶序列。同时,101份qPCR检测结果为阴性的临床样本，用本发明巢式RPA检测出32.67％(33/101)的样本结果为阳性。另外,对来自多次住院的COVID-19患者的36份qPCR检测结果为阴性的样本进行检测，nestRPA检测到91.67％(33/36)的样本结果为阳性。用本发明nestRPA方法检测32份qPCR检测结果为阴性的复工体检人员咽拭子样本，显示12.5％(4/32)的样本结果为阳性。
实施例1 RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物和探针的设计及筛选
1.引物和探针的设计
针对SARS-CoV-2基因序列(GenBank:NC_045512.2)的保守区域ORF1ab,S基因,ORF6,ORF7a,ORF7b,ORF8,N基因,ORF10设计8组RPA检测的引物和探针(见下表1和图1)，8组引物和探针(Probe1～Probe8)分别对应SEQ ID NO：1～8所示的Fragment 1～Fragment 8八个扩增片段：Fragment 1(Frag.1，位于ORF1ab，SEQ ID NO：1)、Fragment 2(Frag.2，位于S基因，SEQ ID NO：2)、Fragment 3(Frag.3，横跨ORF6,ORF7a两个基因，SEQ ID NO：3)、Fragment 4(Frag.4，位于ORF7a，SEQ ID NO：4)、Fragment 5(Frag.5，横跨ORF7a,ORF7b,ORF8三个基因，SEQ ID NO：5)、Fragment 6(Frag.6，横跨ORF8,N两个基因，SEQ ID NO：6)、Fragment 7(Frag.7，位于N基因，SEQ ID NO：7)、Fragment 8(Frag.8，位于N基因，SEQ ID NO：8)。
表1RPA检测的引物和探针序列
| Probe 2 | 5‘-TGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTAC/i6FAMdT/C/idSp//iBHQ1dT/CCTTTACAATCATAT-3’ |
| F2-1 | 5‘-AATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTG-3’ |
| F2-2 | 5‘-ACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAA-3’ |
| F2-3 | 5‘-TTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCT-3’ |
| F2-4 | 5‘-AGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCA-3’ |
| F2-5 | 5‘-GAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGG-3’ |
| F2-6 | 5‘-CTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAG-3’ |
| F2-7 | 5’-CAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCT-3‘ |
| F2-8 | 5’-AATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGA-3‘ |
| F2-9 | 5’-AGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCA-3‘ |
| F2-10 | 5’-TAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATA-3‘ |
| R2-1 | 5'-GGTTGGTAACCAACACCATTAGTGGGTTGGAAACC-3' |
| R2-2 | 5'-TGTATGGTTGGTAACCAACACCATTAGTGGGTTGG-3' |
| R2-3 | 5'-TACTCTGTATGGTTGGTAACCAACACCATTAGTGG-3' |
| R2-4 | 5'-ACTACTACTCTGTATGGTTGGTAACCAACACCATT-3' |
| R2-5 | 5'-AAAGTACTACTACTCTGTATGGTTGGTAACCAACA-3' |
| R2-6 | 5'-AAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATGGTTGGTAAC-3' |
| R2-7 | 5'-AGTTCAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTATGGTTG-3' |
| R2-8 | 5'-GTAGAAGTTCAAAAGAAAGTACTACTACTCTGTAT-3' |
| R2-9 | 5'-TGCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAGTACTACTACTC-3' |
| R2-10 | 5'-GCTGGTGCATGTAGAAGTTCAAAAGAAAGTACTAC-3' |
| Probe 4 | 5'-AAATTTGCACTGACTTGCTTTAGCACTCAA/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCTTTTGCTTGTCCT-3' |
| F4-1 | 5'-ACCATTTCATCCTCTAGCTGATAACAAATTTGCAC-3' |
| F4-2 | 5'-AATTCACCATTTCATCCTCTAGCTGATAACAAATT-3' |
| F4-3 | 5'-AGGGCAATTCACCATTTCATCCTCTAGCTGATAAC-3' |
| F4-4 | 5'-ATACGAGGGCAATTCACCATTTCATCCTCTAGCTG-3' |
| F4-5 | 5'-GGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCATCCTCT-3' |
| F4-6 | 5'-CTTCTGGAACATACGAGGGCAATTCACCATTTCAT-3' |
| F4-7 | 5'-TTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGCAATTCACCAT-3' |
| F4-8 | 5'-GAACCTTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGCAATTC-3' |
| F4-9 | 5'-TAAAAGAACCTTGCTCTTCTGGAACATACGAGGGC-3' |
| F4-10 | 5'-ACTTTTAAAAGAACCTTGCTCTTCTGGAACATACG-3' |
| R4-1 | 5'-CTGGCACGTAACTGATAGACGTGTTTTACGCCGTC-3' |
| R4-2 | 5'-CTGATCTGGCACGTAACTGATAGACGTGTTTTACG-3' |
| R4-3 | 5'-TGAAACTGATCTGGCACGTAACTGATAGACGTGTT-3' |
| R4-4 | 5'-TTAGGTGAAACTGATCTGGCACGTAACTGATAGAC-3' |
| R4-5 | 5'-ACAGTTTAGGTGAAACTGATCTGGCACGTAACTGA-3' |
| R4-6 | 5'-GATGAACAGTTTAGGTGAAACTGATCTGGCACGTA-3' |
| R4-7 | 5'-TGTCTGATGAACAGTTTAGGTGAAACTGATCTGGC-3' |
| R4-8 | 5'-CCTCTTGTCTGATGAACAGTTTAGGTGAAACTGAT-3' |
| R4-9 | 5'-AACTTCCTCTTGTCTGATGAACAGTTTAGGTGAAA-3' |
| R4-10 | 5'-TCTTGAACTTCCTCTTGTCTGATGAACAGTTTAGG-3' |
| Probe 5 | 5'-TTGACTTCTATTTGTGCTTTTTAGCCTTTC/i6FAMdT//idSp/C/iBHQ1dT/ATTCCTTGTTTTAAT-3' |
| F5-1 | 5'-GACAGAATGATTGAACTTTCATTAATTGACTTCTA-3' |
| F5-2 | 5'-AGAAAGACAGAATGATTGAACTTTCATTAATTGAC-3' |
| F5-3 | 5'-TCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAACTTTCATTAA-3' |
| F5-4 | 5'-CACACTCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAACTTTC-3' |
| F5-5 | 5'-TGCTTCACACTCAAAAGAAAGACAGAATGATTGAA-3' |
| F5-6 | 5'-CACTTTGCTTCACACTCAAAAGAAAGACAGAATGA-3' |
| F5-7 | 5'-TATAACACTTTGCTTCACACTCAAAAGAAAGACAG-3' |
| F5-8 | 5'-GTGTTTATAACACTTTGCTTCACACTCAAAAGAAA-3' |
| F5-9 | 5'-CAATAGTGTTTATAACACTTTGCTTCACACTCAAA-3' |
| F5-10 | 5'-TGCGGCAATAGTGTTTATAACACTTTGCTTCACAC-3' |
| R5-1 | 5'-GCAGTTCAAGTGAGAACCAAAAGATAATAAGCATA-3' |
| R5-2 | 5'-ATCTTGCAGTTCAAGTGAGAACCAAAAGATAATAA-3' |
| R5-3 | 5'-TTATGATCTTGCAGTTCAAGTGAGAACCAAAAGAT-3' |
| R5-4 | 5'-TTTCATTATGATCTTGCAGTTCAAGTGAGAACCAA-3' |
| R5-5 | 5'-ACAAGTTTCATTATGATCTTGCAGTTCAAGTGAGA-3' |
| R5-6 | 5'-GCGTGACAAGTTTCATTATGATCTTGCAGTTCAAG-3' |
| R5-7 | 5'-TTTAGGCGTGACAAGTTTCATTATGATCTTGCAGT-3' |
| R5-8 | 5'-GTTCGTTTAGGCGTGACAAGTTTCATTATGATCTT-3' |
| R5-9 | 5'-TTCATGTTCGTTTAGGCGTGACAAGTTTCATTATG-3' |
| R5-10 | 5'-GAAATTTCATGTTCGTTTAGGCGTGACAAGTTTCA-3' |
| Probe 7 | 5'-TAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTA/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CTACTACCTAGGAAC-3' |
| F7-1 | 5'-CCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAA-3' |
| F7-2 | 5'-AGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAA-3' |
| F7-3 | 5'-CGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGG-3' |
| F7-4 | 5'-ACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGT-3' |
| F7-5 | 5'-TGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTG-3' |
| F7-6 | 5'-CAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAAT-3' |
| F7-7 | 5'-ATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGA-3' |
| F7-8 | 5'-TCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTA-3' |
| F7-9 | 5'-AGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAG-3' |
| F7-10 | 5'-CCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTAC-3' |
| R7-1 | 5'-TGTTAGCACCATAGGGAAGTCCAGCTTCTGGCCCA-3' |
| R7-2 | 5'-GTCTTTGTTAGCACCATAGGGAAGTCCAGCTTCTG-3' |
| R7-3 | 5'-ATGCCGTCTTTGTTAGCACCATAGGGAAGTCCAGC-3' |
| R7-4 | 5'-ATATGATGCCGTCTTTGTTAGCACCATAGGGAAGT-3' |
| R7-5 | 5'-AACCCATATGATGCCGTCTTTGTTAGCACCATAGG-3' |
| R7-6 | 5'-GTTGCAACCCATATGATGCCGTCTTTGTTAGCACC-3' |
| R7-7 | 5'-CCTCAGTTGCAACCCATATGATGCCGTCTTTGTTA-3' |
| R7-8 | 5'-GGCTCCCTCAGTTGCAACCCATATGATGCCGTCTT-3' |
| R7-9 | 5'-TTCAAGGCTCCCTCAGTTGCAACCCATATGATGCC-3' |
| R7-10 | 5'-GTGTATTCAAGGCTCCCTCAGTTGCAACCCATATG-3' |
2.引物的筛选
考虑到引物在RPA扩增中的重要性，在一条探针的两端设计10对引物，以筛选出最高效的引物和探针。在引物对筛选时，将第一条正向引物(F)分别与第一至第十条反向引物(R)配对。接着再筛选反向引物，将第一条反向引物(R)分别与第一至第十条正向引物(F)配对。通过两轮引物筛选，找到具有最高斜率和最短反应时间的最佳引物对。并用含有SARS-CoV-2部分基因序列的纯化质粒DNA在1×10
5拷贝下筛查引物和探针的特异性和敏感性。最后共筛选到16对引物，每个基因片段有两对引物，一对外引物和一对内引物(见下表2)。
表2针对SARS-CoV-2的8个基因片段(Frag.1-Frag.8)筛选出的高效探针和引物序列
将含有SARS-CoV-2部分序列的质粒DNA(1×10
10copies/ul)用10倍系列稀释法依次稀释为1×10
9copies/ul,1×10
8copies/ul,1×10
7copies/ul,1×10
6copies/ul,1×10
5copies/ul,1×10
5copies/ul,1×10
5copies/ul,1×10
4copies/ul,1×10
3copies/ul,5×10
2copies/ul,3×10
2copie/ul s,2×10
2copies/ul,1×10
2copies/ul,1×10
1copies/ul。用RPA方法，在30分钟反应终点，看检测样本与空白对照之间的荧光度差异是否有统计学意义，判断标准是p<0.05为阳性，p>0.05为阴性。结果显示，16对引物和8条探针的最低检测限(LOD)差异较大(见图2)，说明同一病毒序列不同基因区域的引物和探针具有不同的扩增效率。因此，选择LOD最小的Fragment 5和Fragment 7的引物对和探针，用于巢式RPA检测试验。
实施例2巢式RPA(nestRPA)检测SARS-CoV-2核酸具有超高灵敏度
1.方法
1.1 SARS-CoV-2阳性质粒的构建
合成3个目的片段(SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51)，在其两端末端添加BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点。将每个目的片段分别与T4DNA连接酶、pUC57质粒混合并在16℃下连接反应12小时。将含目的片段的重组质粒转化到受体菌TOP10中，用Luria Broth培养基筛选阳性克隆。再用Sanger测序技术证明阳性克隆正确。
1.2 RPA反应
使用RAA核酸扩增试剂盒(QITIAN Bio Co.,Wuxi,China)，在50μl的RPA反应体系中进行反应。反应混合物包含以下成分：25μl水化缓冲液、2.1μl正向引物(10μM)、2.1μl反向引物(10μM)、0.6μl探针(10μM)、1μl DNA模板,16.7ul纯水和2.5μl 280nM醋酸 镁溶液(MgAc)。将反应混合物加入到含冻干试剂粉(冻干试剂粉包含重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)的反应管中。将反应管在荧光等温扩增仪(QITIAN Bio Co.,Wuxi,China)中，39℃孵育扩增30分钟。扩增完成后，将RPA扩增产物进行纯化。
1.3巢式RPA检测
为了研发超高灵敏度的检测技术，本发明提出基于RPA技术的巢式RPA检测方法(nestRPA)，并将其应用于SARS-CoV-2核酸检测。nestRPA的基本原理是：先用外引物扩增目的基因第一片段，然后用内引物扩增完全位于第一扩增片段内的目的基因第二片段。为了消除酶的荧光信号影响，在第一次的RPA反应体系中不包含荧光探针。在第二次RPA反应中，加入荧光探针。采用Fragment 5和Fragment 7的引物对和探针(见表3)进行巢式RPA的具体步骤如下。
巢式RPA检测包含两轮反应。第一轮反应，反应混合物包括以下成分：25μl水化缓冲液,2.1μl外正向引物(10μM)，2.1μl外反向引物(10μM)，17.7μl DNA模板(质粒DNA或临床样本的核酸提取物),2.5μl醋酸镁溶液(MgAc，280nM)。将RPA反应混合物加入到含冻干试剂粉的反应管中。第一轮RPA反应在恒温扩增仪中39℃孵育扩增20分钟。接着把第一轮反应的所有产物作为第二轮反应的模板。第二轮反应，将第一轮反应产物与25.2μl水化缓冲液,2.1μl内正向引物(10μM)，2.1μl内反向引物(10μM)及0.6μL探针(10μM)混合，然后将混合物加入一个新的含冻干试剂粉的反应管中，混合，离心。第二次的RPA反应体系在荧光-等温扩增仪(QITIAN Bio Co.,Wuxi,China)中39℃孵育扩增30分钟，nestRPA荧光信号结果记录在FAM观察通道，阳性结果的荧光值超过背景荧光信号指数倍(p<0.05)。
1.4统计分析
用SPSS 19.0软件(Chicago,IL,USA)进行统计分析。同时运用独立样本t检验和卡方检验评价实验结果。所有的数据分析，p<0.05代表具有显著差别。
2.结果
使用筛选出的Fragment 5和Fragment 7的引物对和探针进行巢式RPA检测，可检测出1copy/ul的含SARS-CoV-2DNA的阳性质粒(见表3和图3)，说明本发明巢式RPA检测SARS-CoV-2核酸具有超高灵敏度。
表3低浓度样本的巢式RPA检测结果统计
实施例3比较nestRPA和qPCR方法检测临床样本的结果
1.方法
1.1临床样本
所有病例都通过实时定量PCR(qPCR)检测，判断是否感染SARS-CoV-2。2020年2月1日至2020年3月24日期间，在深圳第三人民医院共收集到来自139位患者的189份样本(鼻咽拭子或痰液)。包括来自17位患者qPCR检测结果为阳性的样本20例(6例qPCR检测结果为阳性样本来自复阳患者样本)，来自73位患者qPCR检测结果为阴性的样本101例，来自20位多次住院的复阳患者的样本42例(其中6例qPCR检测结果为阳性，36例qPCR检测结果为阴性)，以及来自32位复工体检者的样本32例。
1.2样本的总核酸提取
根据核酸提取试剂盒的操作步骤(Huayin Biotech Co.,Shenzhen,China)，配制反应液，并使用自动核酸提取仪，提取临床样本的总核酸包含DNA和RNA。
1.3荧光定量PCR(qPCR)试验
利用一步法qRT-PCR试剂盒，在同一反应管中进行逆转录和qPCR反应(
U+One Step qRT-PCR Probe kit,Vazyme Biotech Co.,Ltd)。反应体系为20μl，含有2×One Step Q Probe Mix,One Step Q Probe Enzyme Mix,50×ROX Reference Dye 1,正向和反向基因特异引物(GSP)(10μM),TaqMan探针(10μM)和RNA模板。检测ORF1a/b基因,需用ORF1ab-F,ORF1ab-R和ORF1ab-P。检测N基因,需用N-F,N-R和N-P。引物和探针序列公布在CDC网站(http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html)。将反应混合物置qPCR检测仪中进行一步法RT-qPCR反应。热循环反应参数参见文献描述[Corman VM,Landt O,Kaiser M,Molenkamp R,Meijer A,Chu DKW,Bleicker T,Brünink S,Schneider J,Schmidt ML,Mulders DGJC,Haagmans BL,van der Veer B,van den Brink S,Wijsman L,Goderski G,Romette JL,Ellis J,Zambon M,Peiris M,Goossens H,Reusken C,Koopmans MPG,Drosten C.Detection of 2019novel coronavirus s(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.Euro Surveill.2020Jan；25(3).]。
1.4用实施例2所述的巢式RPA检测方法(nestRPA)对临床样本提取的RNA进行检测反应。将qPCR检测结果为阳性的样本用本发明nestRPA方法检测，并将其中1例qPCR检 测阳性样本经过连续11次10倍比稀释后，再用nestRPA方法检测。对qPCR检测结果为阴性的样本也用本发明nestRPA方法进行检测。
2.结果
2.1采集来自17位COVID-19患者的20份鼻拭子或痰样本(6份样本来自复阳患者)，所有这些样本用qPCR方法检测SARS-CoV-2核酸为阳性。用本发明nestRPA方法检测，表明本发明nestRPA方法与qPCR方法对核酸阳性样本的检测结果一致率为100％(20/20)。
2.2选取其中一个阳性样本，用10倍系列稀释法检测本发明nestRPA方法的灵敏度。结果显示，将SARS-CoV-2核酸阳性样本10倍连续稀释11次后，用本发明巢式RPA方法(nestRPA)仍能检测到阳性结果，而qPCR方法对第3次稀释的样本的检测结果已经为阴性(表4)。
表4巢式RPA和qPCR对一个阳性样本经10倍系列稀释后的检测结果比较
ND指没做检测。
2.3采集来自73位COVID-19患者或其它疾病患者的101份鼻拭子或痰样本，所有这些样本用qPCR方法检测SARS-CoV-2核酸为阴性，用本发明巢式RPA方法检测得到32.67％(33/101)的阳性结果(表5)，表明用qPCR方法检测临床COVID-19患者的SARS-CoV-2核酸，检测结果存在假阴性。
表5巢式RPA对qPCR检测为阴性样本的检测结果
ND表示因样本量不足而未进行检测。
2.4为了动态观察反复住院COVID-19患者的SARS-CoV-2核酸变化，采集来自20位COVID-19复阳患者的42份样本进行SARS-CoV-2核酸检测。其中，qPCR检测为阳性的样本6份(包括在本实施例2.1的20份qPCR检测的阳性样本中)，用本发明巢式RPA检测结果同样为阳性；qPCR检测结果为阴性的样本36份，用本发明巢式RPA检测有91.67％(33/36)的核酸检测结果为阳性(表6)，该检测结果与临床诊断结果基本一致，说明本发明超高灵敏度的检测方法能用于临床疑似新冠肺炎患者的诊断。
表6巢式RPA和qPCR对COVID-19复阳患者的检测结果比较
2.5为了探究在健康人群中是否存在SARS-CoV-2核酸阳性的无症状患者，采集复工人员的咽拭子样本32份，所有这些样本用qPCR方法检测SARS-CoV-2核酸都为阴性，然而，用本发明巢式RPA方法检测得到12.5％(4/32)的样本为阳性结果(见图4和表7)，表明本发明超高灵敏度的核酸检测方法对于早期发现携带SARS-CoV-2的无症状患者具有重要意义。
表7复工人员体检样本的巢式RPA检测结果
2.6为了避免本发明巢式RPA检测结果的假阳性，对本实施例2.1-2.5中所有巢式RPA检测为阳性样本的扩增产物进行高通量测序，结果显示检测到的片段100％为靶序列(图5)。
总之，如下表8所示，本发明共检测了来自139位患者(107位为COVID-19确诊患者)的189份临床样本，其中qPCR检测结果为阳性样本20份、阴性样本为169份。用本发明的巢式RPA共检测出90份阳性样本、99份阴性样本，其中119份样本的检测结果与qPCR检测结果一致(包括20份阳性样本和99份阴性样本)，qPCR检测结果为阳性的20份样本，由本发明巢式RPA检测结果也全为阳性，而在qPCR检测结果为阴性的169份样本中，由本发明巢式RPA检测却得到37.04％(70/169)的阳性结果，统计分析表明本发明超高灵敏度的巢式RPA检测结果与qPCR检测结果具有显著的差异(P＝0.0000)。
表8分别用巢式RPA和qPCR检测SARS-CoV-2核酸的结果数据统计表
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (22)
- 一种以巢式RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对，所述引物对是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
- 根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对是扩增SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8中任一基因片段的引物对。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：1所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，内引物对SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：2所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，内引物对SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：3所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21，内引物对SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：4所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，内引物对SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：5所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31，内引物对SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：6所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36，内引物对SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：7所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，内引物对SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43。
- 根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述扩增SEQ ID NO：8所示基因片段的引物对包含：外引物对SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46，内引物对SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48。
- 一种以巢式RPA检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的探针，所述探针是特异性针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的探针：ORF1ab、 S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
- 根据权利要求11所述的探针，其特征在于，所述探针与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8中任一基因片段的部分序列特异性杂交。
- 根据权利要求12所述的探针，其特征在于，所述探针包括：与SEQ ID NO：1基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：9所示序列的探针；与SEQ ID NO：2基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：14所示序列的探针；与SEQ ID NO：3基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：19所示序列的探针；与SEQ ID NO：4基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：24所示序列的探针；与SEQ ID NO：5基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：29所示序列的探针；与SEQ ID NO：6基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：34所示序列的探针；与SEQ ID NO：7基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：39所示序列的探针；与SEQ ID NO：8基因片段的部分序列特异性杂交的具有SEQ ID NO：44所示序列的探针。
- 一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1至10任一项所述的引物对，和与该引物对相对应的权利要求11至13任一项所述的探针。
- 根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求7所述的引物对，和SEQ ID NO：29所示序列的探针。
- 根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求9所述的引物对，和SEQ ID NO：39所示序列的探针。
- 权利要求14至16任一项所述试剂盒在制备检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的产品中的应用。
- 一种以巢式RPA检测病毒的方法，包括以下步骤：用一对外引物以病毒核酸为模板进行第一次RPA反应，扩增目的基因第一片段；用一对内引物以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在增加信号探针的条件下进行第二次RPA反应，扩增目的基因第二片段；通过检测探针信号，获得病毒核酸的检测结果。
- 一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的引物对，所述引物对是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的引物对：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
- 根据权利要求19所述的引物对，其特征在于，所述引物对是针对SARS-CoV-2新型冠状病毒ORF7a、ORF7b、ORF8三个基因设计的引物对，用于扩增SEQ ID NO：5所示基因片段。
- 一种检测SARS-CoV-2新型冠状病毒的探针，所述探针是针对下述SARS-CoV-2新型冠状病毒全基因序列中的任意一个或两个以上基因设计的探针：ORF1ab、S基因、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、N基因、ORF10。
- 根据权利要求21所述的探针，其特征在于，所述探针与SEQ ID NO：5所示基因片段的部分序列特异性杂交。
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