CN111394519A - 基于数字pcr的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用 - Google Patents

基于数字pcr的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用，所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的反应总体系为20ul，包括2x One‑Step RT‑ddPCR Supermix 10ul、25mM乙酸锰溶液0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease‑Free Water 1.2ul，其中，在阴性对照和阳性对照反应体系中，分别用5ul阴性对照RNA提取液和5ul阳性对照RNA提取液替代待测样本的RNA。利用创新的RNA一步法逆转录微滴式数字PCR技术，针对新型冠状病毒(2019‑nCoV)基因组中高度保守的ORF1ab基因和N基因进行核酸绝对定量，提高检测准确性，可用于临床上对新型冠状病毒(2019‑nCoV)感染的辅助诊断和病毒载量分析，具有广泛的临床应用价值。

Description

基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种基于数字 PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用。
背景技术
新型冠状病毒被世卫组织命名为2019-nCoV，2020年2月12日被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。该病毒能引起严重急性呼吸感染(Severe acuterespiratory infection,SARI)，其早期症状同普通病毒感冒类似。随着病情发展，病人会出现呼吸困难、胸闷、甚至呼吸窘迫症状，通过医学影像学检查可见肺部有多发磨玻璃影，严重者可出现肺实变。针对新型冠状病毒强传染性及聚集性发病的特征，及时筛查出新型冠状病毒感染人群对于疫情防控至关重要。
2019-nCoV作为一种新型冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，该病毒采集自不同地区患者的病毒样本相关序列也已发布至 2019新型冠状病毒信息库(https://bigd.big.ac.cn/ncov)。由于新型冠状病毒为新发病原体，常规传统培养及血清学等临床常用方法很难在较短时间内去检测病原体。因此，针对新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸诊断开发尤为重要。国卫办于 2020年2月3日发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》，在此文件中明确指出：(1)新型冠状病毒感染的患者咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等标本中可检测出新型冠状病毒核酸；(2)疑似病例满足以下病原学证据中的任何一个就可以认定为新型冠状病毒确诊患者，分别为呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性、呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。
截止目前，国家已经紧急批准了6款核酸诊断试剂盒上市，用于临床诊断，这6款试剂盒都是采用RT-PCR的方法。多日的临床检测结果显示，该诊断方法存在高比例的假阴性问题，往往需要多次的核酸检测，才能被最终验证。同时此新型冠状病毒(2019-nCoV)可能存在变异，未涉及对ORF1ab基因序列、ORF1ab 基因序列和N基因序列的研究，ORF1ab基因是开放读码框1ab；N基因是核壳蛋白；RPP30基因是核糖核酸酶P蛋白30KD亚基。因此除RT-PCR外其他技术更先进的快速诊断产品的研发迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用，选取在新型冠状病毒(2019-nCoV)基因组中高度保守的ORF1ab 基因和N基因作为关键的数字PCR检测靶标，并且检测体系中包含内源性的内标有效降低假阴性，利用创新的RNA一步法逆转录微滴式数字PCR技术，可以进行高灵敏度、高特异性的新型冠状病毒(2019-nCoV)真正意义上的绝对核酸定量，可用于临床上对新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的辅助诊断和病毒载量分析。
为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的反应总体系为20ul，包括2x One-Step RT-ddPCR Supermix 10ul、 25mM乙酸锰溶液0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、 N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease-Free Water 1.2ul，其中，在阴性对照和阳性对照反应体系中，分别用5ul阴性对照RNA 提取液和5ul阳性对照RNA提取液替代待测样本的RNA；
所述ORF1ab基因引物探针包括2019-nCoV-ORF1ab-F引物探针、 2019-nCoV-ORF1ab-R引物探针和2019-nCoV-ORF1ab-P引物探针；
所述2019-nCoV-ORF1ab-F引物探针的引物序列为：
GTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGT；
所述2019-nCoV-ORF1ab-R引物探针的引物序列为：
TGCATCAGCTGACTGAAGCAT；
所述2019-nCoV-ORF1ab-P引物探针的引物序列为：
FAM-ATCAACTCCGCGAACC-MGB；
所述N基因引物探针包括2019-nCoV-N-F引物探针、2019-nCoV-N-R引物探针和2019-nCoV-N-P引物探针；
所述2019-nCoV-N-F引物探针的引物序列为：
TGGCAATGGCGGTGATG；
所述2019-nCoV-N-R引物探针的引物序列为：
AGCTGGTTCAATCTGTCAAGCA；
所述2019-nCoV-N-P引物探针的引物序列为：
VIC-TGCTCTTGCTTTGCTG-MGB；
所述RPP30基因引物探针包括2019-nCoV-RPP30-F引物探针、 2019-nCoV-RPP30-R引物探针和2019-nCoV-RPP30-P引物探针；
所述2019-nCoV-RPP30-F引物探针的引物序列为：
GCCTGGCTTTTGAACTTGTCTATAG；
所述2019-nCoV-RPP30-R引物探针的引物序列为：
GGGCACTGGAAATTGTATACCTTCT；
所述2019-nCoV-RPP30-P引物探针的引物序列为：
ROX-CCTGCTATCAAAGACTC-MGB。
其中，所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的工作液浓度为500-900nM，MGB探针的工作液浓度为250nM。
其中，所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的引物长度为17-25bp，GC含量30-80％，退火温度为58-60℃。
其中，所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的探针长度大于或等于13bp，GC含量 30-80％；退火温度为65-70℃。
第二方面，本发明提供一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用，包括：
对检测试剂盒进行微滴式数字PCR反应，得到PCR反应结果；
根据PCR反应结果，得出感染结果。
在一实施方式中，对检测试剂盒进行微滴式数字PCR反应，得到PCR反应结果，具体包括：
对检测试剂盒进行60℃30min的第一逆转录反应；
对检测试剂盒进行95℃5min的第二逆转录反应；
对检测试剂盒进行94℃30sec，60℃1min，共40个循环的第三逆转录反应；
对检测试剂盒进行98℃10min的第四逆转录反应，得到PCR反应结果。
在一实施方式中，根据PCR反应结果，得出感染结果，具体包括：
在阴性对照和阳性对照同时满足质控时，获取待测样本中2019-nCoV的 ORF1ab基因、N基因的拷贝数；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因同时具有拷贝数，则判断为感染结果；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因任意一个不具有拷贝数，则判断为未感染结果。
本发明的一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用，通过所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的反应总体系为20ul，包括2xOne-Step RT-ddPCR Supermix 10ul、25mM乙酸锰溶液 0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease-Free Water 1.2ul。选取在新型冠状病毒(2019-nCoV)基因组中高度保守的ORF1ab基因和N基因作为关键的数字PCR检测靶标，并且检测体系中包含内源性的内标有效降低假阴性。利用创新的RNA一步法逆转录微滴式数字PCR技术，可以进行高灵敏度、高特异性的新型冠状病毒(2019-nCoV)真正意义上的绝对核酸定量，可用于临床上对新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的辅助诊断和病毒载量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用的流程示意图；
图2是本发明的ORF1ab基因和N基因特异性引物和MGB探针的结构示意图；
图3是本发明的ORF1ab基因、N基因的阴性对照和阳性对照数字PCR结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
第一方面，本发明提供一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的反应总体系为20ul，包括2xOne-Step RT-ddPCR Supermix 10ul、25mM乙酸锰溶液 0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease-Free Water 1.2ul，其中，在阴性对照和阳性对照反应体系中，分别用5ul阴性对照RNA提取液和5ul阳性对照RNA提取液替代待测样本的RNA。ORF1ab基因是开放读码框1ab；N 基因是核壳蛋白；RPP30基因是核糖核酸酶P蛋白30KD亚基。
本发明根据已公布的多个新型冠状病毒(2019-nCoV)病毒株全基因组序列，通过与已知的SARS和SARS相关冠状病毒(研究和文献来源的蝙蝠病毒)进行序列比对，选择2019-nCoV基因组的ORF1ab基因和N基因作为检测靶标，设计特异性的多重数字PCR引物和MGB探针。同时对选择的内源性内标RPP30 基因也进行特异性的数字PCR引物和MGB探针设计。
本发明专利中2019-nCoV参考的基因组主要由MN908947.3、MN996527.1、MN996528.1、MN996529.1、MN996530.1、MN996531.1，RPP30基因参考的转录本号为NM_001104546。数字PCR引物和MGB探针设计过程中严格遵循引物及探针设计原则。请参阅图2，图2是本发明的ORF1ab基因和N基因特异性引物和MGB探针的结构示意图。引物设计原则：所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的引物长度为17-25bp，GC含量30-80％，退火温度(Tm值)为58-60℃；避免稳定的引物二聚体(特别是多联检测)及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；序列中不能出现连续的碱基G，3’端避免碱基G或碱基C，最后5个碱基内避免多个连续的G或C。探针设计原则：所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的探针长度大于或等于13bp， GC含量30-80％；退火温度(Tm值)为65-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物。
基于以上设计原则，本发明设计的ORF1ab基因、N基因及RPP30基因特异性引物和MGB探针，具体核苷酸序列如表1所示：
表1 ORF1ab基因、N基因及RPP30基因特异性引物和MGB探针核苷酸序列
Figure RE-GDA0002508773080000061
本发明中2019-nCoV的ORF1ab基因的探针5’端连接荧光报告基团FAM, 3’端连接MGB基团；2019-nCoV的N基因的探针5’端连接荧光报告基团VIC, 3’端连接MGB基团；内源性内标RPP30基因的探针5’端连接荧光报告基团 ROX,3’端连接MGB基团。通过检测实验过程中加入的内源性内标RPP30基因来排除样本RNA质量原因导致的假阴性结果。
本发明中所用到的特异性MGB探针和引物均为商业定制版。所述ORF1ab 基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的工作液浓度为500-900nM，MGB探针的工作液浓度为250nM，每个反应总体系保证在20ul。
本发明提供了进行操作简便、高灵敏度和高特异性的数字PCR检测反应体系试剂盒。整个数字PCR反应经过多次试验并优化调整反应条件，实现了由RNA 一步法逆转录的数字PCR检测。基于数字PCR技术引物和MGB探针的“双保险”，避免检测的假阴性，上机操作全封闭反应，防止受到环境及其他因素的污染，保证实验结果的准确可靠。
本发明同时提供了数字PCR数据分析流程。检测试剂盒数字PCR反应运行结束后，进行微滴读取和数据分析。阴阳性微滴的判定是由荧光阈值大小决定的，软件会自动计算阈值，有时需要进行手工调整。通过“2D Amplitude”查看 Ch1 vs Ch2的聚类散点图，横坐标及纵坐标分别代表两个通道的荧光强度值，可以通过点击“Auto Analyze”进行自动阈值计算或者通过十字分类工具等方式进行阴阳性微滴的计算。
本发明中数据结果最终会以拷贝数的形式体现，检测结果判定的标准如表2 所述：
表2 2019-nCoV数字PCR结果判断标准
Figure RE-GDA0002508773080000071
反应中扩增效率降低的影响因素：(1)反应试剂中MGB探针荧光染料是否降解；(2)加样过程移液器体积是否准确；(3)反应条件是否经过优化；(4)反应体系中应避免有PCR反应抑制物。
第二方面，本发明提供一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用，包括：
对检测试剂盒进行微滴式数字PCR反应，得到PCR反应结果；
具体的，对检测试剂盒进行60℃ 30min的第一逆转录反应；
对检测试剂盒进行95℃ 5min的第二逆转录反应；
对检测试剂盒进行94℃ 30sec，60℃ 1min，共40个循环的第三逆转录反应；
对检测试剂盒进行98℃ 10min的第四逆转录反应，得到PCR反应结果。
根据PCR反应结果，得出感染结果。
具体的，在阴性对照和阳性对照同时满足质控时，获取待测样本中 2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因的拷贝数；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因同时具有拷贝数，则判断为感染结果；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因任意一个不具有拷贝数，则判断为未感染结果。
请参阅图1，图1是本发明实施例提供的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用的流程示意图；具体的，所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用可以包括以下步骤：
S101、对检测试剂盒进行60℃ 30min的第一逆转录反应；
S102、对检测试剂盒进行95℃ 5min的第二逆转录反应；
S103、对检测试剂盒进行94℃ 30sec，60℃ 1min，共40个循环的第三逆转录反应；
S104、对检测试剂盒进行98℃ 10min的第四逆转录反应，得到PCR反应结果。
S105、在阴性对照和阳性对照同时满足质控时，获取待测样本中2019-nCoV 的ORF1ab基因、N基因的拷贝数；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因同时具有拷贝数，则判断为感染结果；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因任意一个不具有拷贝数，则判断为未感染结果。
具体内容为检测试剂盒通过定制引物及MGB探针来特异性检测2019-nCoV 基因组上的ORF1ab基因和N基因的拷贝数，通过拷贝数对样本进行精准定量，从而筛查新型冠状病毒感染人群。
本发明的RNA一步法逆转录微滴式数字PCR实验流程具体如下：
2019-nCoV RNA核酸的提取：使用经过验证的商品化提取试剂盒(比如 Qiagen的QIAamp Viral RNA Mini Kit)，核酸提取按照厂家说明书进行操作。每次提取时，均同时提取一份阳性对照品(5μL，用无菌生理盐水稀释至需要体积) 和一份阴性对照品(5μL，用无菌生理盐水稀释至需要体积)。提取好的RNA进行浓度、纯度和完整度的质控，质控合格的进行后续微滴式数字PCR的操作。
RNA一步法逆转录微滴式数字PCR体系配制：对上述所提取的RNA样本、阳性对照进行适当的浓度稀释。待测样本的多重数字PCR反应体系总共20ul，其中2x One-Step RT-ddPCR Supermix加入10ul、25mM乙酸锰溶液0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease-FreeWater加入1.2ul。在阴性对照和阳性对照反应体系中，分别用5ul阴性对照RNA提取液和5ul阳性对照RNA 提取液替代待测样本的RNA。
微滴式数字PCR反应：配制好的反应体系进行微滴式数字PCR反应，使用 BIO-RAD公司的QX200数字PCR仪，运行程序依次为：先经过60℃ 30min的逆转录反应，然后95℃5min；再然后经过94℃ 30sec，60℃ 1min，共40个循环；最后98℃ 10min。
请参阅图3，图3是本发明的ORF1ab基因、N基因的阴性对照和阳性对照数字PCR结果图。2019-nCoV微滴式数字PCR结果判读：在阴性对照和阳性对照同时满足质控的前提下，只有待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因同时具有拷贝数，此时可以判定待测样本是新型冠状病毒2019-nCoV感染。
实施案例一：利用假病毒的阳性对照来检测本微滴式数字PCR体系灵敏度
本实施案例用2019-nCoV的阳性对照(假病毒)进行一系列的梯度稀释，稀释后的一系列假病毒溶液提取相应的病毒RNA，而后进行相应的微滴式数字PCR 检测。在满足数字PCR最少3个微滴的情况下，2019-nCoV假病毒的ORF1ab 基因最低可以检测的灵敏度是5copies/反应，N基因最低可以检测的灵敏度是 3copies/反应，因此本发明将检测的灵敏度界定为5copies/反应，远远高于国家药监局批准的荧光PCR产品(最低的灵敏度是100copies/反应)。
实施案例二：临床样本检测
由于新型冠状病毒肺炎的特殊性，本发明所述的试剂盒只对复工后的10名员工采集咽拭子进行2019-nCoV的荧光RT-PCR检测和微滴式数字PCR检测， 2019-nCoV荧光RT-PCR检测使用已经获得国家药监局审批的产品，2019-nCoV 微滴式数字PCR检测使用本发明所述的方法。
按照本发明数字PCR检测流程和商业化RT-PCR试剂盒检测方法流程，10 名员工咽拭子的检测结果如表3所示。
表3 2019-nCoV数字PCR和荧光RT-PCR检测结果汇总
样本编号 微滴式数字PCR检测结果 荧光RT-PCR检测结果
A01 阴性 阴性
A02 阴性 阴性
A03 阴性 阴性
A04 阴性 阴性
A05 阴性 阴性
A06 阴性 阴性
A07 阴性 阴性
A08 阴性 阴性
A09 阴性 阴性
A10 阴性 阴性
运用两种检测技术对复工后的10名员工咽拭子进行2019-nCoV核酸检测，检测结果都是阴性，与复工后的10名员工临床表症相符。
通过两种检测技术结果比较发现，本发明利用微滴式数字PCR技术，复杂背景样本中的ORF1ab基因和N基因灵敏度可以高达5copies/反应。荧光PCR 检测只能给出ORF1ab基因和N基因的阴阳性，无法给出精确的拷贝数，而数字PCR在不依赖标准品和标准曲线的情况下可以检测低病毒载量的样本。利用一步法多重的方法，可以保证在一次单管反应中同时检测ORF1ab基因、N基因和内源性内标RPP30基因。全封闭体系进行检测，防止气溶胶和样本污染，预防假阳性。
综上所述并结合临床上检测技术的应用，采用微滴式数字PCR技术可以进行高灵敏度、高特异性的新型冠状病毒(2019-nCoV)真正意义上的绝对核酸定量，可用于临床上对新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的辅助诊断和病毒载量分析，具有广泛的临床应用价值，可以助力新冠疫情的防控。
本发明提供的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用，利用创新的RNA一步法逆转录微滴式数字PCR技术，针对新型冠状病毒 (2019-nCoV)基因组中高度保守的ORF1ab基因和N基因进行核酸绝对定量，能从疑似患者的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液样本中检出新型冠状病毒 (2019-nCoV)，灵敏度高达5copies/反应，远高于传统的RT-PCR灵敏度。本发明的技术性优势主要体现在以下四方面：
本发明利用微滴式数字PCR技术，灵敏度更高：检测复杂背景样本中的 ORF1ab基因和N基因灵敏度可以高达5copies/反应；
本发明利用微滴式数字PCR技术，精准绝对定量：不依赖标准品和标准曲线的情况下通过真正意义上的绝对定量，可以检测低病毒载量的样本。并且利用一步法多重的方法，可以保证在一次单管反应中同时检测ORF1ab基因、N基因和内源性内标RPP30基因。全封闭体系进行检测，防止气溶胶和样本污染，预防假阳性；
本发明检测体系中加入内源性内标RPP30基因，通过检测内标可监测样本采集、提取以及数字PCR全流程，避免假阴性结果；
本发明试剂盒中应用2019-nCoV的假病毒标准品作为阳性对照，区别于以往体外合成的RNA、临床阳性活病毒，完美克服两者的缺点，非常适合用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCoV。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
序列表
<110> 南京实践医学检验有限公司
<120> 基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒及应用
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
gtggaaaggt tatggctgta gttgt 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
tgcatcagct gactgaagca t 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
atcaactccg cgaacc 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
tggcaatggc ggtgatg 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
agctggttca atctgtcaag ca 22
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
tgctcttgct ttgctg 16
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
gcctggcttt tgaacttgtc tatag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
gggcactgga aattgtatac cttct 25
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
cctgctatca aagactc 17

Claims (7)

1.一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，其特征在于，
所述基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的反应总体系为20ul，包括2x One-Step RT-ddPCR Supermix 10ul、25mM乙酸锰溶液0.8ul、待测样本RNA 5ul、ORF1ab基因引物探针工作液1ul、N基因引物探针工作液1ul、RPP30基因引物探针工作液1ul、Nuclease-Free Water 1.2ul，其中，在阴性对照和阳性对照反应体系中，分别用5ul阴性对照RNA提取液和5ul阳性对照RNA提取液替代待测样本的RNA；
所述ORF1ab基因引物探针包括2019-nCoV-ORF1ab-F引物探针、2019-nCoV-ORF1ab-R引物探针和2019-nCoV-ORF1ab-P引物探针；
所述2019-nCoV-ORF1ab-F引物探针的引物序列为：
GTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGT；
所述2019-nCoV-ORF1ab-R引物探针的引物序列为：
TGCATCAGCTGACTGAAGCAT；
所述2019-nCoV-ORF1ab-P引物探针的引物序列为：
FAM-ATCAACTCCGCGAACC-MGB；
所述N基因引物探针包括2019-nCoV-N-F引物探针、2019-nCoV-N-R引物探针和2019-nCoV-N-P引物探针；
所述2019-nCoV-N-F引物探针的引物序列为：
TGGCAATGGCGGTGATG；
所述2019-nCoV-N-R引物探针的引物序列为：
AGCTGGTTCAATCTGTCAAGCA；
所述2019-nCoV-N-P引物探针的引物序列为：
VIC-TGCTCTTGCTTTGCTG-MGB；
所述RPP30基因引物探针包括2019-nCoV-RPP30-F引物探针、2019-nCoV-RPP30-R引物探针和2019-nCoV-RPP30-P引物探针；
所述2019-nCoV-RPP30-F引物探针的引物序列为：
GCCTGGCTTTTGAACTTGTCTATAG；
所述2019-nCoV-RPP30-R引物探针的引物序列为：
GGGCACTGGAAATTGTATACCTTCT；
所述2019-nCoV-RPP30-P引物探针的引物序列为：
ROX-CCTGCTATCAAAGACTC-MGB。
2.如权利要求1所述的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，其特征在于，
所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的工作液浓度为500-900nM，MGB探针的工作液浓度为250nM。
3.如权利要求2所述的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，其特征在于，
所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的引物长度为17-25bp，GC含量30-80％，退火温度为58-60℃。
4.如权利要求3所述的基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒，其特征在于，
所述ORF1ab基因引物探针工作液、所述N基因引物探针工作液、所述RPP30基因引物探针工作液中的探针长度大于或等于13bp，GC含量30-80％；退火温度为65-70℃。
5.一种基于数字PCR的新型冠状病毒的核酸定量检测试剂盒的应用，其特征在于，包括：
对检测试剂盒进行微滴式数字PCR反应，得到PCR反应结果；
根据PCR反应结果，得出感染结果。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，对检测试剂盒进行微滴式数字PCR反应，得到PCR反应结果，具体包括：
对检测试剂盒进行60℃30min的第一逆转录反应；
对检测试剂盒进行95℃5min的第二逆转录反应；
对检测试剂盒进行94℃30sec，60℃1min，共40个循环的第三逆转录反应；
对检测试剂盒进行98℃10min的第四逆转录反应，得到PCR反应结果。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，根据PCR反应结果，得出感染结果，具体包括：
在阴性对照和阳性对照同时满足质控时，获取待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因的拷贝数；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因同时具有拷贝数，则判断为感染结果；
当待测样本中2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因任意一个不具有拷贝数，则判断为未感染结果。
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