CN112266980A - 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112266980A
CN112266980A CN202011210357.4A CN202011210357A CN112266980A CN 112266980 A CN112266980 A CN 112266980A CN 202011210357 A CN202011210357 A CN 202011210357A CN 112266980 A CN112266980 A CN 112266980A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ncov
novel coronavirus
real
probe
pcr detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011210357.4A
Other languages
English (en)
Inventor
刘剑波
史健翔
田莹涛
冯帅升
薛夏
许红恩
靳水玲
张旗
汤文学
郭建成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Second Affiliated Hospital of Zhengzhou Unviersity
Original Assignee
Zhengzhou University
Second Affiliated Hospital of Zhengzhou Unviersity
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou Unviersity filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN202011210357.4A priority Critical patent/CN112266980A/zh
Publication of CN112266980A publication Critical patent/CN112266980A/zh
Priority to LU500740A priority patent/LU500740B1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种新型冠状病毒2019‑nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法。本发明选择2019‑nCoV复制后核酸的两个位点进行检测，其中包括一个2019‑nCoV特异性位点，特异性高，与其感染部位相同或感染症状相似且常见的其它病原体及人类白细胞的总核酸无交叉反应。本发明采用单管三荧光通道同时检测新型冠状病毒2019‑nCoV和内参基因Rnase P的存在，能检测肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子等标本中新型冠状病毒2019‑nCoV RNA的存在。本发明检测时间周期短，可低至1.5h，适用于临床和床旁的快速检测诊断；检测病毒特异性高，重复性、灵敏度与准确率高。

Description

一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、 试剂盒和方法
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法。
背景技术
2019-nCoV(novel coronavirus)属于一种新发现的冠状病毒，与SARS属于同一家族，这种病毒呈圆形或椭圆形、颗粒状，直径大概在60-140nm左右，这种病毒的传染力比较强，目前没有特异性的检测方法，而且这种病毒导致人呼吸道重症感染的情况比较常见，确诊患者需要隔离治疗，故急切需要开发一种能够快速且准确对这种新型冠状病毒2019-nCoV进行鉴定的分子方法，从而达到有效控制疫情流行传播，患者快速诊断隔离治疗的目的。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明针对新型冠状病毒2019-nCoV的全基因组序列信息，提供一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法，以实现快速、灵敏和准确对此病毒进行诊断，以满足需求。
本发明的技术方案为：
本发明的目的之一为：一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针，其包括新型冠状病毒2019-nCoV特异性引物和探针，所述特异性引物序列选自SEQ IDNO.1-2和SEQ ID NO.4-5,所述探针序列选自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6。
本发明的目的之二为：一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测试剂盒，其包括上述的实时荧光PCR检测引物和探针外；还包括内标基因Rnase P特异性引物及其探针，所述内标基因Rnase P特异性引物及其探针分别选自SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.9。
进一步地，上述的试剂盒还包括：
阳性对照品：新型冠状病毒2019-nCovORF1ab和N基因扩增序列质粒标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的质粒溶液；
阴性对照品:Rnase Free H2O。
本发明的目的之三为：一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测方法，所述方法为：以样品RNA 为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括上述的新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物对和探针。
进一步地，所述扩增反应体系包括:样品模板、上述的新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物和探针、2×One Step PCR Buffer和Enzyme Mix；所述扩增程序为:55℃15min；95℃2min；95℃ 10sec、60℃35sec，45个循环。
进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值≤35，判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值35＜Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性，否则判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道中Ct≤45时，判断样品为新型冠状病毒 2019-CoV阴性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
本发明的目的之四为：上述的新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物及其探针、检测试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒中的应用。
采取上述技术，本发明实现的有益效果为：
1.本发明提供的新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物、探针试剂盒及检测方法，其选择了2019-nCoV复制后核酸的两个位点进行检测,其中包括一个2019-nCoV特异性位点,能够更够快速、准确且灵敏地检测出新型冠状病毒2019-nCoV，特异性强、灵散度高，高达20拷贝/mL；检测结果重复性高，精确度高。
2.本发明能够大大的缩短检测周期，能够在1.5-2h内即可完成检测，其适用于临床和床旁的快速检测诊断，能极大的节约诊断时间。
3.本发明解决了用两个位点的引物和探针一管就检测出新型冠状病毒2019-nCoV的技术难点，且特异性强，灵敏度高。
4.本发明采用单管三荧光通道同时检测新型冠状病毒2019-nCoV和内参基因Rnase P的存在，其能够实现对肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、尿液和大便等标本中新型冠状病毒2019-nCoV RNA的存在进行检测，检测样本多样。
而针对当肺泡灌洗液、鼻拭子咽拭子、尿液和大便中存在反转录或者PCR抑制时，容易造成病毒核酸定量结果不准确甚至出现“假阴性”的难点与技术问题，本发明设计了内参基因，可对标本提取和扩增整个过程进行质量监测，能监控RNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。
而针对实时荧光PCR产物容易形成气溶胶，造成下一次检测结果被污染，产生“假阳性”结果的难点与技术问题，本发明加入了UNG酶和dUTP，能在新的扩增反应前通过50℃加热将可能存在以前的PCR产物降解消除掉，从而极大的杜绝污染的可能性。
5.本发明采用了高效逆转录酶，能在10-15分钟完成逆转录，同时采用了快速taq酶，能在45分钟内完成PCR，从而保证能在1.5-2h内完成检测，满足了快速和准确检测诊断的需求。
6.本发明提供了新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，不仅缩短了操作时间，减少污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例中的新型冠状病毒2019-nCoV的ORFlab基因目标区扩增曲线；
图2为实施例中的新型冠状病毒2019-nCoV的N基因目标区域扩增曲线；
图3为实施例中内参基因Rnase P目标区域扩增曲线。
具体实施方式
为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合其实施例，对本发明进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：实时荧光PCR检测试剂盒的开发。
1、本实施例中选取新型冠状病毒2019-nCoV特异性的编码ORF1ab和N基因序列设计出两对特异性引物和两条特异性的荧光探针，选用内标基因Rnase P设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，通过实时荧光PCR技术可对新型冠状病毒2019-nCoV进行检测。ORF1ab和N基因是新型冠状病毒的重要结构基因，本发明设计的引物和探针仅与新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab和N基因100％相似，而与其他冠状病毒包括SARS、MERS、229E、OC43、NL63和HKU1不匹配，故能特异性结合新型冠状病毒2019-nCoV的 ORF1ab和N基因并起始扩增，而不扩增其他型的冠状病毒。本发明本实施例中设计的引物序列及探针序列见表1所示。
表1：引物及探针序列
SEQ ID NO. 引物名称 引物序列
1 2019-nCoV-ORF1ab-F 5’-TGGTTGTTAATGCAGCCAAT-3’
2 2019-nCoV-ORF1ab-R 5’-TTCAACTTGCATGGCATTGT-3’
3 2019-nCoV-ORF1ab-P FAM-TTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGG-BHQ1
4 2019-nCoV-N-F 5’-CATTGGCATGGAAGTCACAC-3’
5 2019-nCoV-N-R 5’-GCTCTGTTGGTGGGAATGTT-3’
6 2019-nCoV-N-P HEX-TACACAGGTGCCATCAAATTGGATG-BHQ1
7 RnaseP-F 5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
8 RnaseP-R 5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
9 RnaseP-P TAMRA-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2
试剂盒内还包括阳性对照:
新型冠状病毒2019-nCoV标准品；
阴性对照:RNase Free H2O；内标溶液:
含Rnase P序列的质粒溶液；
2×One Step PCR Buffer和Enzyme Mix。
2、新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测方法。
(1)病毒核酸的提取
a向1.5mL离心管中依次加入400μL裂解液、20μL蛋白酶K、20μL磁珠(用前充分混匀)，加入 200μL核酸待提液体，室温颠倒混匀10min。
b瞬时离心后将离心管置于磁力架上30s，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
c取下离心管，加入500μL清洗液I，颠倒混匀。
d短暂离心后将离心管置于磁力架上30s，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
e取下离心管，加入500μL清洗液II，颠倒混匀。
f短暂离心后将离心管置于磁力架上30s，待磁珠完全吸附后，用移液器吸尽管内液体。
g重复步骤e、f。
h将离心管置于磁力架上，室温晾干10-15min。(注意：确保管内液体挥发干净)
i取下离心管，加入50μL洗脱液，振荡混匀，使磁珠重新悬浮，置于56℃，孵育5min，期间颠倒混匀2-3次。
j短暂离心后将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附后，将洗脱液转移至新对应编号的离心管中，进行下一步操作，如暂不使用-20℃保存。
(2)实时荧光定量PCR扩增(每份30μL体系)
取5μL RNA作为模板，同时加入25u1PCR反应液(实时荧光PCR反应液的配制体系如表2所示)至八联管中进行实时荧光PCR扩增。
表2：实时荧光定量PCR反应液的配制体系
序列 反应液组分 试剂体积
1 2×One Step PCR Buffer 15μL
2 Enzyme Mix 1.5μL
3 50×ROX Reference Dye 1 0.6μL
4 2019-nCoV-ORF1ab-F(10umol/L) 0.72μL
5 2019-nCoV-ORF1ab-R(10umol/L) 0.72μL
6 2019-nCoV-ORF1ab-P(10umol/L) 0.36μL
7 2019-nCoV-N-F(10umol/L) 1μL
8 2019-nCoV-N-R(10umol/L) 1μL
9 2019-nCoV-N-P(10umol/L) 0.5μL
10 RnaseP-F(10umol/L) 0.4μL
11 RnaseP-R(10umol/L) 0.4μL
12 RnaseP-P(10umol/L) 0.2μL
13 RNase-free ddH<sub>2</sub>O 2.6μL
14 模板(RNA) 5μL
(3)实时荧光定量PCR反应程序为:55℃15min:95℃2min:95℃10sec、60℃35sec，45个循环。从 60℃步骤开始收集荧光信号。本发明使用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行检测。
(4)得到实时荧光定量PCR扩增结果，对扩增曲线进行分析，并作出判断。判断规则为：
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值≤35，判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性。
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值35＜Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性，否则判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性。
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道中Ct≤45时，判断样品为新型冠状病毒 2019-CoV阴性。
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
(5)本实施例通过上述试验得到了图1、图2、图3所示的新型冠状病毒2019-nCoV的ORFlab基因、 N基因、内参基因Rnase P目标区域扩增曲线，其中图1、图2中的阳性对照为本发明的引物扩增区域的阳性质粒的扩增曲线，图3的阳性对照为包含RnaseP基因的阳性质粒扩增曲线；其中图中的阴性对照则为纯水的扩增曲线。从图中的扩增曲线可以明显看出，本发明的新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测试剂盒的检测的准确性非常高，且具有非常好的重复性，且图3的结果还可以判断反应体系中是否加入了RNA样本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州大学，郑州大学第二附属医院
<120> 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
<130> 2020
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堝紩鐗〤OV-ORF1ab-F锛?Artificial Sequence)()
<400> 1
tggttgttaa tgcagccaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堝紩鐗〤OV-ORF1ab-R锛?Artificial Sequence)()
<400> 2
ttcaacttgc atggcattgt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堟帰閽圕OV-ORF1ab-FAM锛?Artificial Sequence)()
<400> 3
ttaaacatgg aggaggtgtt gcagg 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堝紩鐗〤OV-N-F锛?Artificial Sequence)()
<400> 4
cattggcatg gaagtcacac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堝紩鐗〤OV-N-R锛?Artificial Sequence)()
<400> 5
gctctgttgg tgggaatgtt 20
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛堟帰閽圕OV-N-HEX锛?Artificial Sequence)()
<400> 6
hextacacag gtgccatcaa attggatgbh q 31
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛圧naseP-F锛?Artificial Sequence)()
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛圧naseP-R锛?Artificial Sequence)()
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 浜哄伐搴忓垪锛圧naseP-P-TAMRA锛?Artificial Sequence)()
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims (7)

1.一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针，其特征在于，其包括新型冠状病毒2019-nCoV特异性引物和探针，所述特异性引物序列选自SEQ ID NO.1-2和SEQID NO.4-5,所述探针序列选自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6。
2.一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的实时荧光PCR检测引物和探针外；还包括内标基因Rnase P特异性引物及其探针，所述内标基因Rnase P特异性引物及其探针分别选自SEQ ID NO.7-8和SEQ ID NO.9。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，其还包括：
阳性对照品：新型冠状病毒2019-nCovORF1ab和N基因扩增序列质粒标准品；
内标溶液：含Rnase P序列的质粒溶液；
阴性对照品:Rnase Free H2O。
4.一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测方法，其特征在于，
所述方法包括：以样品RNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1或权利要求2所述的新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物对和探针。
5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述扩增反应体系包括:样品模板、权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV的实时荧光PCR检测引物和探针、2×One Step PCR Buffer和Enzyme Mix；所述扩增程序为:55℃15min；95℃2min；95℃10sec、60℃35sec，45个循环。
6.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测方法，其特征在于，
对扩增曲线进行分析判断原则为：
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值≤35，判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均Ct值35＜Ct≤45时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性，否则判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道中Ct≤45时，判断样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性；
当FAM通道和VIC/HEX通道均无扩増曲线时，且TAMRA通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需要重新提取标本RNA和重新扩增。
7.权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物及其探针、权利要求2-3所述的检测试剂盒在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒中的应用。
CN202011210357.4A 2020-11-03 2020-11-03 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法 Pending CN112266980A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011210357.4A CN112266980A (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
LU500740A LU500740B1 (en) 2020-11-03 2021-10-18 REAL-TIME FLUORESCENT PCR DETECTION PRIMERS AND PROBES, KIT AND METHOD FOR NOVEL CORONAVIRUS 2019-nCoV

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011210357.4A CN112266980A (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112266980A true CN112266980A (zh) 2021-01-26

Family

ID=74346115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011210357.4A Pending CN112266980A (zh) 2020-11-03 2020-11-03 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112266980A (zh)
LU (1) LU500740B1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337642A (zh) * 2021-06-22 2021-09-03 中国人民解放军陆军军医大学 一种检测新型冠状病毒的rt-pcr试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057797A (zh) * 2020-01-19 2020-04-24 华中科技大学同济医学院附属同济医院 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111118228A (zh) * 2020-03-31 2020-05-08 上海邦先医疗科技有限公司 一种用于新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其使用方法
CN111270013A (zh) * 2020-03-12 2020-06-12 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111334609A (zh) * 2020-03-04 2020-06-26 河南省儿童医院郑州儿童医院 用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因对应mRNA的引物组及试剂盒
CN111394511A (zh) * 2020-03-09 2020-07-10 深圳市梓健生物科技有限公司 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒
CN111500776A (zh) * 2020-04-29 2020-08-07 湖南润美基因科技有限公司 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
US10815539B1 (en) * 2020-03-31 2020-10-27 Diasorin S.P.A. Assays for the detection of SARS-CoV-2

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057797A (zh) * 2020-01-19 2020-04-24 华中科技大学同济医学院附属同济医院 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111334609A (zh) * 2020-03-04 2020-06-26 河南省儿童医院郑州儿童医院 用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因对应mRNA的引物组及试剂盒
CN111394511A (zh) * 2020-03-09 2020-07-10 深圳市梓健生物科技有限公司 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒
CN111270013A (zh) * 2020-03-12 2020-06-12 宁波海尔施基因科技有限公司 一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量pcr试剂盒、方法及引物探针组合物
CN111118228A (zh) * 2020-03-31 2020-05-08 上海邦先医疗科技有限公司 一种用于新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其使用方法
US10815539B1 (en) * 2020-03-31 2020-10-27 Diasorin S.P.A. Assays for the detection of SARS-CoV-2
CN111500776A (zh) * 2020-04-29 2020-08-07 湖南润美基因科技有限公司 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周云英,等: "2019新型冠状病毒核酸检测试剂优化、验证及分析", 《山东大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337642A (zh) * 2021-06-22 2021-09-03 中国人民解放军陆军军医大学 一种检测新型冠状病毒的rt-pcr试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
LU500740B1 (en) 2022-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111057797B (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN111020064B (zh) 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒
CN110982943B (zh) 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒
US20230287524A1 (en) Composition, kit and method for detecting and classifying pathogens causing respiratory tract infection, and application
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN110273027B (zh) 诺如病毒gⅰ、gⅱ和gⅳ型核酸分型检测试剂盒及检测方法
WO2021212523A1 (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
US20230374615A1 (en) Compositions, kits, methods for detecting and identifying pathogens that cause respiratory tract infections and use thereof
CN113005226A (zh) 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒
CN112094944A (zh) 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
WO2024077963A1 (zh) 一种用于检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的引物探针组合及其应用
Wang et al. An overview of nucleic acid testing for the novel coronavirus SARS-CoV-2
CN111808995A (zh) 一种呼吸道病原体核酸检测试剂盒
CN112501358B (zh) 一种用于检测9种儿童消化道病原体的引物探针组合及试剂盒
CN113151582B (zh) 一种检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的引物探针和试剂盒
CN111471800B (zh) 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物
CN108753768B (zh) 用于检测肠道病毒的核酸及其应用
CN112593011A (zh) 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针
CN112266980A (zh) 一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光PCR检测引物和探针、试剂盒和方法
CN112662808A (zh) 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其检测方法
CN112695134A (zh) 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法
CN112662809A (zh) 一种用于新型冠状病毒covid-19检测的核酸组合物及其应用
CN105936945A (zh) 一种联检四种呼吸道病毒的多重逆转录定量pcr试剂盒
CN115323073A (zh) 一种检测人巨细胞病毒核酸的引物探针组合物、试剂盒及其使用方法
CN113549709A (zh) 利用巢式RPA技术检测SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210126