CN112226538A - 用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents

用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法，引物探针组合包括用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因、E基因和N基因的引物及用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因、E基因和N基因的相应探针。该引物探针组合，以新型冠状病毒的ORF 1ab基因、E基因和N基因作为检测靶标；在ORF 1ab基因对新型冠状病毒保守性好的区段进行引物探针组合的设计，能够保证检测的特异性和准确性，同时也增加了E基因、N基因区段的引物探针设计，能够有效减少漏检的概率。本发明还通过加入人源内标的设计，能够对采样、提取和检测过程进行监测，防止因采样不合格、提取失败或者检测试剂失效而出现假阳性的结果。

Description

用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒检测技术领域，特别涉及一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因的肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，由新型冠状病毒引起的新型肺炎的潜伏期一般为3～7天，最长不超过14天，且在潜伏期的患者也会引起人传人现象，目前迫切需要一种灵敏、准确且快速的方法，用于快速检测2019新型冠状病毒感染所引起的肺炎。
目前，对新型冠状病毒的检测以核酸检测作为金标准，辅以血清学检测。测序法在疫情初期对病原体的鉴别起到了至关重要的作用，也为后续开展新型冠状病毒的基因扩增检测提供了基因组序列信息，但是测序法仪器昂贵、操作复杂、耗时长，且需要专业人员进行分析，无法在临床上大范围推广应用。与上述测序法相比，核酸检测具有灵敏度高、操作简单、耗时短的特点，能及早发现感染者，对大规模人群筛查具有重要意义。但现有2019-nCov实时荧光RT-PCR试剂盒并不稳定，特别是个别病例在不同时间经5次以上的检测后结果由阴性转为阳性，为临床诊断和疾病控制带来极大的困难。由此可见，实时荧光RT-PCR对有限的标本材料以及早期低病毒含量样本的检测仍存在一定的应用限制，如检测过程依赖于扩增曲线的阈值进行定量，受扩增效率的影响等。
发明内容
本发明提供一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法，以解决现有技术中核酸检测不稳定且低病毒含量样本存在应用限制的技术问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，所述引物探针组合包括用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物、用于扩增新型冠状病毒E基因的引物和用于扩增新型冠状病毒N基因的引物及用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针、用于检测新型冠状病毒E基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因的探针；
所述用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物包括正向引物ORF 1ab-F和反向引物ORF 1ab-R；所述正向引物ORF 1ab-F的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物ORF1ab-R的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物包括正向引物E-F和反向引物E-R；所述正向引物E-F的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物E-R的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物包括正向引物N-F和反向引物N-R；所述正向引物N-F的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物N-R的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列如SEQ ID NO:7所示；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列如SEQ ID NO:8所示；所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列如SEQ ID NO:9所示。
进一步地，所述用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；和/或
所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；和/或
所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
进一步地，所述引物探针组合还包括用于扩增内标IC基因的引物及用于检测内标IC基因的探针；所述用于扩增内标IC基因的引物包括正向引物IC-F和反向引物IC-R，所述正向引物IC-F的DNA序列如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物IC-R的DNA序列如SEQ ID NO:11所示；所述用于检测内标IC基因的探针序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步地，所述用于检测内标IC基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团CY5，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。
根据本发明的第二方面，还提供了上述引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。
根据本发明的第三方面，还提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测缓冲液、混合酶液、阳性质控品、阴性质控品以及上述的新型冠状病毒检测引物探针组合。
进一步地，所述阳性质控品包括含有新型冠状病毒ORF 1ab基因片段、E基因片段、N基因片段及内标IC基因片段的假病毒颗粒或质粒。
进一步地，所述阳性质控品包括从新型冠状病毒的ORF 1ab基因、E基因、N基因中各选取的长度为300bp～20000bp的基因片段。
进一步地，所述阳性质控品包括从新型冠状病毒的内标IC基因中选取的长度为200bp～20000bp的基因片段。
根据本发明的第四方面，还提供了一种新型冠状病毒的检测方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸作为模板，使用上述的新型冠状病毒检测试剂盒配制扩增反应体系后，进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；分析所述扩增曲线，作出新型冠状病毒阴阳性判断。
进一步地，实时荧光PCR扩增反应的程序为：S1、55℃，反应15min；S2、95℃，反应30s；S3、94℃反应10s，54℃反应15s，72℃反应20s，循环5次；S4、94℃反应10s，58℃反应1min，循环40次；并在58℃采集数据。
本发明提供的用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，以新型冠状病毒的ORF1ab基因、E基因和N基因作为检测靶标；其中，在ORF 1ab基因对新型冠状病毒保守性好的区段进行引物探针组合设计，能够保证检测的特异性和准确性，同时也增加了E基因、N基因区段的引物探针设计，能够有效减少漏检的概率。另外，本发明还通过加入人源内标的设计，能够对采样、提取和检测过程进行监测，防止因采样不合格、提取失败或者检测试剂失效而出现假阳性的结果。
附图说明
图1为本发明实施例临床待检测样本检测结果的指数扩增曲线示意图；其中，a为扩增曲线，图中分别示出了4个通道的扩增曲线，分别标记为ORF 1ab、E基因、N基因和内标；b为阈值线，为图中的水平线；a线与相应b线的交点所对应的X轴的值分别为4条扩增曲线的Ct值；
图2为本发明实施例临床待检测样本检测结果的线性扩增曲线示意图，分别标记为ORF 1ab、E基因、N基因和内标。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明再作进一步详细的说明。
实施例1
本申请实施例提供了一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，该引物探针组合包括用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物、用于扩增新型冠状病毒E基因的引物和用于扩增新型冠状病毒N基因的引物及用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针、用于检测新型冠状病毒E基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因的探针。
本申请实施例中，用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物包括正向引物ORF1ab-F和反向引物ORF 1ab-R；正向引物ORF 1ab-F的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物ORF 1ab-R的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。用于扩增新型冠状病毒E基因的引物包括正向引物E-F和反向引物E-R；正向引物E-F的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物E-R的DNA序列如SEQ ID NO:4所示。用于扩增新型冠状病毒N基因的引物包括正向引物N-F和反向引物N-R；正向引物N-F的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物N-R的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。本申请实施例用于新型冠状病毒检测的引物序列分别如表1所示：
表1 引物序列
序列号 引物名称 引物序列
SEQ ID NO:1 ORF 1ab-F 5’-GCCGCTATAACAATACTAGATGG-3’
SEQ ID NO:2 ORF 1ab-R 5’-AGTGCCAAAGATGTTAGTTAGC-3’
SEQ ID NO:3 E-F 5’-TGCTTTCGTGGTATTCTTGCTA-3’
SEQ ID NO:4 E-R 5’-AGAAGGTTTTACAAGACTCACGTT-3’
SEQ ID NO:5 N-F 5’-AAAACGTACTGCCACTAAAGC-3’
SEQ ID NO:6 N-R 5’-GGCCAATGTTTGTAATCAGTTCC-3’
本申请实施例中，用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列如SEQ ID NO:7所示；用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列如SEQ ID NO:8所示；用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列如SEQ ID NO:9所示。具体探针序列参照表2。
表2 探针序列
序列号 探针名称 探针序列
SEQ ID NO:7 ORF 1ab-P-FAM 5’-CTGCGAAGTCAACTGAACAAC-3’
SEQ ID NO:8 E-P-ROX 5’-ACAATATTGCAGCAGTACGCACAC-3’
SEQ ID NO:9 N-P-VIC 5’-TTGTTCTGGACCACGTCTGCCGAA-3’
其中，用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
本申请实施例中，引物探针组合还包括用于扩增内标IC基因的引物及用于检测内标IC基因的探针。用于扩增内标IC基因的引物包括正向引物IC-F和反向引物IC-R，正向引物IC-F的DNA序列如SEQ ID NO:10所示，反向引物IC-R的DNA序列如SEQ ID NO:11所示。上述内标IC基因的引物探针组合序列具体参见表3。
表3 内标IC基因的引物探针组合序列
序列号 引物探针名称 引物探针序列
SEQ ID NO:10 IC-F 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’
SEQ ID NO:11 IC-R 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
SEQ ID NO:12 IC-P-CY5 5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’
其中，用于检测内标IC基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团CY5，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。
冠状病毒的分类主要以ORF 1ab基因的序列为依据，因此该基因区段对新型冠状病毒的特异性较高，而E基因、N基因的序列与SARS样冠状病毒及部分蝙蝠携带的冠状病毒基因具有较高的同源性，因此本申请实施例的引物探针组合选取新型冠状病毒的ORF1ab基因、E基因和N基因为检测靶标，既能保证检测的特异性，也能尽可能地避免假阴性结果的出现。同时也在引物探针组合中加入了人源基因的检测作为内参，能够提示采样及核酸提取过程是否正常，避免因采样不合格或者核酸提取操作失误而引入的假阴性结果。
上述引物探针组合能够应用于制备新型冠状病毒检测试剂盒。
实施例2
本申请实施例提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，其包括检测缓冲液、混合酶液、阳性质控品、阴性质控品以及实施例1的新型冠状病毒检测引物探针组合。
本申请实施例的检测试剂盒中，混合酶液包括DNA聚合酶、UNG酶和逆转录酶。UNG酶即尿嘧啶-N-糖基化酶。检测缓冲液包括脱氧三磷酸核苷(dUTP)、镁离子等。也就是说，本申请实施例中，检测试剂盒内的UNG酶与dUTP系统可以防止实验室的假阳性结果，提高检测试剂盒的可靠性。需要说明的是，检测缓冲液、混合酶液、阴性质控品均为市售。
本申请实施例的检测试剂盒中，阳性质控品包括含有新型冠状病毒ORF1ab基因片段、E基因片段、N基因片段及内标IC基因片段的假病毒颗粒或质粒。
本申请实施例中，阳性质控品包括从新型冠状病毒的ORF 1ab基因、E基因、N基因中各选取的长度为300bp～20000bp的基因片段。进一步地，阳性质控品包括从新型冠状病毒的内标IC基因中选取的长度为200bp～20000bp的基因片段。
本申请实施例对于靶基因长度的选取优势主要表现在以下两个方面：一方面是所设计的区域在所有的新型冠状病毒里面的保守性好，即序列一致性好；另一方面是所设计的区域对新型冠状病毒之外的其它冠状病毒如NL63、0C43、蝙蝠携带的冠状病毒的特异性好，即序列差异性好。本申请实施例的检测试剂盒对于靶基因长度的选取使其准确度高、灵敏度好。
本申请实施例中，检测试剂盒的组成如表4所示：
表4 检测试剂盒组成
Figure BDA0002734467810000071
其中，阳性质控品中从新型冠状病毒的ORF 1ab基因中选取的基因片段的序列如SEQ ID NO:13所示；具体为：
GGAACGTTCTGAAAAGAGCTATGAATTGCAGACACCTTTTGAAATTAAATTGGCAAAGAAATTTGACACCTTCAATGGGG
AATGTCCAAATTTTGTATTTCCCTTAAATTCCATAATCAAGACTATTCAACCAAGGGTTGAAAAGAAAAAGCTTGATGGC
TTTATGGGTAGAATTCGATCTGTCTATCCAGTTGCGTCACCAAATGAATGCAACCAAATGTGCCTTTCAACTCTCATGAA
GTGTGATCATTGTGGTGAAACTTCATGGCAGACGGGCGATTTTGTTAAAGCCACTTGCGAATTTTGTGGCACTGAGAATT
TGACTAAAGAAGGTGCCACTACTTGTGGTTACTTACCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATTTATTGTCCAGCATGTCACAAT
TCAGAAGTAGGACCTGAGCATAGTCTTGCCGAATACCATAATGAATCTGGCTTGAAAACCATTCTTCGTAAGGGTGGTCG
CACTATTGCCTTTGGAGGCTGTGTGTTCTCTTATGTTGGTTGCCATAACAAGTGTGCCTATTGGGTTCCACGTGCTAGCG
CTAACATAGGTTGTAACCATACAGGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCGAAGGTCTTAATGACAACCTTCTTGAAATACTCCAA
AAAGAGAAAGTCAACATCAATATTGTTGGTGACTTTAAACTTAATGAAGAGATCGCCATTATTTTGGCATCTTTTTCTGC
TTCCACAAGTGCTTTTGTGGAAACTGTGAAAGGTTTGGATTATAAAGCATTCAAACAAATTGTTGAATCCTGTGGTAATT
TTAAAGTTACAAAAGGAAAAGCTAAAAAAGGTGCCTGGAATATTGGTGAACAGAAATCAATACTGAGTCCTCTTTATGCA
TTTGCATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCAAAATTCTGTGCGTGTTTT
ACAGAAGGCCGCTATAACAATACTAGATGGAATTTCACAGTATTCACTGAGACTCATTGATGCTATGATGTTCACATCTG
ATTTGGCTACTAACAATCTAGTTGTAATGGCCTACATTACAGGTGGTGTTGTTCAGTTGACTTCGCAGTGGCTAACTAAC
ATCTTTGGCACTGTTTATGAAAAACTCAAACCCGTCCTTGATTGGCTTGAAGAGAAGTTTAAGGAAGGTGTAGAGTTTCT
TAGAGACGGTTGGGAAATTGTTAAATTTATCTCAACCTGTGCTTGTGAAATTGTCGGTGGACAAATTGTCACCTGTGCAA
AGGAAATTAAGGAGAGTGTTCAGACATTCTTTAAGCTTGTAAATAAATTTTTGGCTTTGTGTGCTGACTCTATCATTATT
GGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACGCACTCAAAGGGATTGTACAGAAAGTGTGTTAA
ATCCAGAGAAGAAACTGGCCTACTCATGCCTCTAAAAGCCCCAAAAGAAATTATCTTCTTAGAGGGAGAAACACTTCCCA
CAGAAGTGTTAACAGAGGAAGTTGTCTTGAAAACTGGTGATTTACAACCATTAGAACAACCTACTAGTGAAGCTGTTGAA
GCTCCATTGGTTGGTACACCAGTTTGTATTAACGGGCTTATGTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAAAAGTACTGTGCCCT
TGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCTTCACACTCAAAGGCGGTGCACCAACAAAGGTTACTTTTGGTGATGACA
CTGTGATAGAAGTGCAAGGTTACAAGAGTGTGAATATCACTTTTGAACTTGATGAAAGGATTGATAAAGTACTTAATGAG
AAGTGCTCTGCCTATACAGTTGAACTCGGTACAGAAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAAC
TTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTG
ATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTG
从新型冠状病毒的E基因中选取的基因片段的序列如SEQ ID NO:14所示；具体为：
ACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTT
AATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGAT
TGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTG
AATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATATTATATTAGTTTTTCTGTTTGGAACTTTAATTTTA
GCCATGGCAGATT
从新型冠状病毒的N基因中选取的基因片段的序列如SEQ ID NO:15所示；具体为：
ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAA
CCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCA
CCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCA
GATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAG
ATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTG
CAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAA
CTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTC
ATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATG
GCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAA
CAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGC
ATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGAC
AAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATT
GGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAA
AGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGA
AGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTG
GATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAAACTCATGCAGACCACACAAG
GCAGATGGGCTATATAAACGTTTTCGCTTTTCCGTTTACGATATATAGTCTACTCTTGTGCAGAATGAATTCTCGTAACT
ACATAGCACAAGTAGATGTAGTTAACTTTAATCTCACATAGCAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAA
AGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAG
从新型冠状病毒的内标IC基因中选取的基因片段的序列如SEQ ID NO:16所示；具体为：
GAAGGTGAAGGTCGGAGTcaacggatttggtcgtattaggcgcctggtca
gcagggttgcgtttaactctgttaaagtggatattgttgccatcaatgac
cccttcattgacctcaactacatggtctacatgttccagtatgattccac
ccatggcaaattccatggcaccatcaaggctgagaacgggaaatttgtca
tcaaatgGAAATCCCATCACCATCTTt
本申请实施例的新型冠状病毒检测试剂盒采用实时荧光PCR扩增技术，以ORF 1ab基因、E基因和N基因作为检测靶标，ORF 1ab区段对新型冠状病毒的保守性设计能保证试剂盒检测的特异性和准确性，再对E基因、N基因进行引物探针设计，能有效减少漏检的概率。另外上述检测试剂盒加入了人源内标的设计，能够对采样、提取和检测过程进行监测，以防止因采样不合格、提取失败或者检测试剂失效而出现假阳性的结果。
实施例3
本申请实施例提供了一种新型冠状病毒的检测方法，包括以下步骤：提取待测样本的核酸作为模板，使用实施例2的新型冠状病毒检测试剂盒配制扩增反应体系后，进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；分析扩增曲线，作出新型冠状病毒阴阳性判断。本申请实施例新型冠状病毒的检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。
具体实验步骤如下：
1、准备扩增试剂(PCR前准备期)
采用核酸提取或者纯化试剂(备案号：苏泰械备20180181号)提取新型冠状病毒的核酸。需要处理的样本种类包括：待检测的临床样本、试剂盒内阳性质控品(nCoV3)、试剂盒内阴性质控品(nCoV3)。
2、PCR检测
(1)扩增试剂准备(PCRⅠ室)
从试剂盒中取出检测缓冲液和引物探针组合，在冰上或4℃融化后，从试剂盒中取出混合酶液，将所有组分轻微摇晃混匀并低速简短离心。每一反应按照以下比例配制反应体系：检测缓冲液(nCoV3)15μL、引物探针(nCoV3)8.0μL、混合酶液(nCoV3)2.0μL。计算好各试剂使用量，加入适当体积的离心管中，充分混匀，简短离心。PCR反应液的总量应满足的人份数包括：临床样本的个数、1管阳性质控品、1个阴性质控品和1个PCR阴性对照。
PCR反应液配置完毕，进行PCR反应液的分装，在每一个PCR反应孔加入25.0μL PCR反应液，分装完毕，转移至PCRⅡ室。
(2)加样(PCRⅡ室)
在装有PCR反应液的PCR反应孔中加入步骤1制备的核酸。每一份核酸的添加量为5.0μL/孔。PCR阴性对照孔中不添加任何样本或者核酸。
(3)PCR反应(检测区)
将反应管放入荧光PCR检测仪中，并将循环参数设定如表4所示：
表4PCR扩增反应的程序
Figure BDA0002734467810000121
荧光信号的收集定为FAM(ORF 1ab基因)、HEX/VIC(N基因)、ROX(E基因)和CY5(内标IC基因)，数据的采集定在58℃。采用ABI7500型号仪器时，将“Quencher”一栏设置为“none”，“passive reference”一栏选为“none”，将每孔反应体积设置为30μL。
PCR反应后得到的扩增序列如下：
ORF 1ab的基因片段扩增后的序列如SEQ ID NO:17所示；具体为(其中双下划线标注的为引物)：
Figure BDA0002734467810000131
E基因的基因片段扩增后的序列如SEQ ID NO:18所示；具体为(其中双下划线标注的为引物)：
Figure BDA0002734467810000132
N基因的基因片段扩增后的序列如SEQ ID NO:19所示；具体为(其中双下划线标注的为引物)：
Figure BDA0002734467810000133
内标IC基因的基因片段扩增后的序列如SEQ ID NO:20所示；具体为(其中双下划线标注的为引物)：
Figure BDA0002734467810000134
(4)检验结果的解释
步骤(3)中的PCR反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节仪器Baseline的Start值、End值和Threshold值(可自行调节，Start值可以在3～15之间，End值位于5～20之间)，调整PCR阴性对照的扩增曲线，使其平直或低于阈值线。
PCR阴性对照应为阴性；阴性质控品应为阴性；阳性质控品的FAM、HEX/VIC、ROX和CY5的荧光Ct值均≤31.00。以上条件需要在同一次试验中同时满足，否则认为此次PCR反应无效，需要重新进行检测。具体如下：
A、待检样本FAM(ORF 1ab基因)荧光Ct值≤32.64，且呈典型S型扩增曲线时，判为ORF 1ab基因阳性样本。待检样本HEX/VIC(N基因)荧光Ct值≤32.11，且呈典型S型扩增曲线时，判为N基因阳性样本。待检样本ROX(E基因)荧光Ct值≤31.08，且呈典型S型扩增曲线时，判为E基因阳性样本。待检样本CY5(内标IC基因)荧光Ct值≤35.00，且呈典型S型扩增曲线时，内标阳性。
B、待检样本FAM(ORF 1ab基因)荧光Ct值＞32.64、不显示Ct值或无典型S型扩增曲线时，判为ORF 1ab基因阴性样本。待检样本HEX/VIC(N基因)荧光Ct值＞32.11、不显示Ct值或无典型S型扩增曲线时，判为N基因阴性样本。待检样本ROX(E基因)荧光Ct值＞31.08、不显示Ct值或无典型S型扩增曲线时，判为E基因阴性样本。待检样本CY5(内标IC基因)荧光Ct值＞35.00、不显示Ct值或无典型S型扩增曲线时，内标阴性。
C、待检样本中内标阳性的情况下，结果解读示例如表5所示。
当同一待检样本的ORF 1ab基因阳性、E和/或N基因为阴性时，判为新型冠状病毒阳性样本。
当同一待检样本的ORF 1ab基因、E基因、N基因同时为阳性时，判为新型冠状病毒阳性样本。
当同一待检样本的ORF 1ab基因阴性，但E或N基因为阳性时，判为新型冠状病毒阴性样本。
当同一待检样本的ORF 1ab基因阴性，但E和N基因为阳性时，需要进行复测。复测结果显示ORF 1ab基因阴性，判为新型冠状病毒阴性样本。复测结果为ORF 1ab基因阳性，判为新型冠状病毒阳性样本。
D、待检测样本中3种靶基因均为阳性，内标阴性时，可直接报告为靶基因阳性，也可重新取样进行检测。待检测样本中3种靶基因均为阴性，内标也阴性时，需要重新取样或重新提取核酸后进行检测。参见表5。
表5 新型冠状病毒阴阳性判断
Figure BDA0002734467810000151
采用上述新型冠状病毒的检测方法对656例待检测样本进行了临床试验，试验结果阳性符合率为98.81％，阴性符合率为99.50％，总符合率为99.24％。本申请实施例采用实时荧光PCR扩增的方法对新型冠状病毒进行检测，能在100分钟之内完成，且临床试验检测的灵敏度达500copies/mL，具有方便快捷、高灵敏的优势。
本申请实施例的检测试剂盒中检院注册检验结果：检测灵敏度为412copies/mL。
本申请实施例的新型冠状病毒检测方法，采用单管检测新型冠状病毒的ORF 1ab基因、E基因、N基因和内标IC基因，针对新型冠状病毒和人源内标设计特异的引物探针组合，在经过优化后的检测缓冲液和混合酶液的作用下，保证检测试剂盒的准确度和灵敏度。同时，本申请实施例的检测试剂盒利用UNG酶与dUTP系统防止实验室的气溶胶产物引起的假阳性，提高了检测试剂盒的可靠性。另外，本申请实施例的检测试剂盒，靶基因的长度选取300bp～20000bp优选450bp～20000bp作为设计区域，使检测试剂盒的准确度高、灵敏度好。
采用实时荧光PCR检测方法对新型冠状病毒进行检测时，对采样和实验操作的要求较高，本申请实施例中人源内标的设计能够监控采样、提取和PCR扩增整个过程，能够有效地避免因采样或者实验操作可能造成的假阴性。同时，本申请实施例采用3个靶标的设计方案，能够对新型冠状病毒的3个基因进行检测，有利于避免漏检造成的假阴性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不同限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 江苏默乐生物科技股份有限公司
<120> 用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgctataa caatactaga tgg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgccaaag atgttagtta gc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctttcgtg gtattcttgc ta 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaaggtttt acaagactca cgtt 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaacgtact gccactaaag c 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggccaatgtt tgtaatcagt tcc 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgcgaagtc aactgaacaa c 21
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acaatattgc agcagtacgc acac 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttgttctgga ccacgtctgc cgaa 24
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtgaag gtcggagt 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagcttccc gttctcagcc 20
<210> 13
<211> 2023
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(covid-19)
<400> 13
ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa 60
atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa 120
gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc 180
tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa 240
gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga 300
attttgtggc actgagaatt tgactaaaga aggtgccact acttgtggtt acttacccca 360
aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca 420
tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg 480
cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta 540
ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg 600
ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa 660
tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga gatcgccatt attttggcat ctttttctgc 720
ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat 780
tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa 840
tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg 900
tgttgtacga tcaattttct cccgcactct tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt 960
acagaaggcc gctataacaa tactagatgg aatttcacag tattcactga gactcattga 1020
tgctatgatg ttcacatctg atttggctac taacaatcta gttgtaatgg cctacattac 1080
aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg gctaactaac atctttggca ctgtttatga 1140
aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct 1200
tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg 1260
acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt 1320
aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc 1380
cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa 1440
atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt 1500
agagggagaa acacttccca cagaagtgtt aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga 1560
tttacaacca ttagaacaac ctactagtga agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc 1620
agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct 1680
tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa 1740
ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac 1800
ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt acttaatgag aagtgctctg cctatacagt 1860
tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac 1920
tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc actgggcatt gatttagatg agtggagtat 1980
ggctacatac tacttatttg atgagtctgg tgagtttaaa ttg 2023
<210> 14
<211> 333
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(covid-19)
<400> 14
actactagcg tgcctttgta agcacaagct gatgagtacg aacttatgta ctcattcgtt 60
tcggaagaga caggtacgtt aatagttaat agcgtacttc tttttcttgc tttcgtggta 120
ttcttgctag ttacactagc catccttact gcgcttcgat tgtgtgcgta ctgctgcaat 180
attgttaacg tgagtcttgt aaaaccttct ttttacgttt actctcgtgt taaaaatctg 240
aattcttcta gagttcctga tcttctggtc taaacgaact aaatattata ttagtttttc 300
tgtttggaac tttaatttta gccatggcag att 333
<210> 15
<211> 1510
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(covid-19)
<400> 15
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
actcatgcag accacacaag gcagatgggc tatataaacg ttttcgcttt tccgtttacg 1320
atatatagtc tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact acatagcaca agtagatgta 1380
gttaacttta atctcacata gcaatcttta atcagtgtgt aacattaggg aggacttgaa 1440
agagccacca cattttcacc gaggccacgc ggagtacgat cgagtgtaca gtgaacaatg 1500
ctagggagag 1510
<210> 16
<211> 227
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(covid-19)
<400> 16
gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattagg cgcctggtca gcagggttgc 60
gtttaactct gttaaagtgg atattgttgc catcaatgac cccttcattg acctcaacta 120
catggtctac atgttccagt atgattccac ccatggcaaa ttccatggca ccatcaaggc 180
tgagaacggg aaatttgtca tcaaatggaa atcccatcac catcttt 227
<210> 17
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gccgctataa caatactaga tggaatttca cagtattcac tgagactcat tgatgctatg 60
atgttcacat ctgatttggc tactaacaat ctagttgtaa tggcctacat tacaggtggt 120
gttgttcagt tgacttcgca gtggctaact aacatctttg gcact 165
<210> 18
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgctttcgtg gtattcttgc tagttacact agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc 60
gtactgctgc aatattgtta acgtgagtct tgtaaaacct tct 103
<210> 19
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaaacgtact gccactaaag catacaatgt aacacaagct ttcggcagac gtggtccaga 60
acaaacccaa ggaaattttg gggaccagga actaatcaga caaggaactg attacaaaca 120
ttggcc 126
<210> 20
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattagg cgcctggtca gcagggttgc 60
gtttaactct gttaaagtgg atattgttgc catcaatgac cccttcattg acctcaacta 120
catggtctac atgttccagt atgattccac ccatggcaaa ttccatggca ccatcaaggc 180
tgagaacggg aaatttgtca tcaaatggaa atcccatcac catcttt 227

Claims (10)

1.一种用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，其特征在于，
所述引物探针组合包括用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物、用于扩增新型冠状病毒E基因的引物和用于扩增新型冠状病毒N基因的引物及用于检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针、用于检测新型冠状病毒E基因的探针和用于检测新型冠状病毒N基因的探针；
所述用于扩增新型冠状病毒ORF 1ab基因的引物包括正向引物ORF 1ab-F和反向引物ORF 1ab-R；所述正向引物ORF 1ab-F的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物ORF1ab-R的DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述用于扩增新型冠状病毒E基因的引物包括正向引物E-F和反向引物E-R；所述正向引物E-F的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物E-R的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述用于扩增新型冠状病毒N基因的引物包括正向引物N-F和反向引物N-R；所述正向引物N-F的DNA序列如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物N-R的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列如SEQ ID NO:7所示；所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列如SEQ ID NO:8所示；所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列如SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，其特征在于，
所述用于检测新型冠状病毒ORF 1ab基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；和/或
所述用于检测新型冠状病毒E基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；和/或
所述用于检测新型冠状病毒N基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1。
3.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，其特征在于，
所述引物探针组合还包括用于扩增内标IC基因的引物及用于检测内标IC基因的探针；
所述用于扩增内标IC基因的引物包括正向引物IC-F和反向引物IC-R，所述正向引物IC-F的DNA序列如SEQ ID NO:10所示，所述反向引物IC-R的DNA序列如SEQ ID NO:11所示；
所述用于检测内标IC基因的探针序列如SEQ ID NO:12所示。
4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒检测的引物探针组合，其特征在于，所述用于检测内标IC基因的探针序列中，探针5’端添加荧光报告基团CY5，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。
5.权利要求1～4任意一项所述的引物探针组合在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。
6.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括检测缓冲液、混合酶液、阳性质控品、阴性质控品以及权利要求1～4任意一项所述的新型冠状病毒检测引物探针组合。
7.根据权利要求6所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括含有新型冠状病毒ORF 1ab基因片段、E基因片段、N基因片段及内标IC基因片段的假病毒颗粒或质粒；和/或
所述阳性质控品包括从新型冠状病毒的ORF 1ab基因、E基因、N基因中各选取的长度为300bp～20000bp的基因片段。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括从新型冠状病毒的内标IC基因中选取的长度为200bp～20000bp的基因片段。
9.一种新型冠状病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测样本的核酸作为模板，使用权利要求6～8任意一项所述的新型冠状病毒检测试剂盒配制扩增反应体系后，进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线；分析所述扩增曲线，作出新型冠状病毒阴阳性判断。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，实时荧光PCR扩增反应的程序为：
S1、55℃，反应15min；
S2、95℃，反应30s；
S3、94℃反应10s，54℃反应15s，72℃反应20s，循环5次；
S4、94℃反应10s，58℃反应1min，循环40次；并在58℃采集数据。
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