CN111560444A - 百日咳杆菌核酸检测试剂盒 - Google Patents

百日咳杆菌核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种百日咳杆菌核酸检测试剂盒。所述百日咳杆菌核酸检测试剂盒包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物。本发明提供的所述百日咳杆菌核酸检测试剂盒解决了现有技术的百日咳的PCR的快速诊断所采用的引物灵敏度不高技术问题。

Description

百日咳杆菌核酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种百日咳杆菌核酸检测试剂盒。
背景技术
百日咳杆菌是一种专性需氧的革兰阴性小杆菌，属于鲍特氏菌属，无芽孢，无鞭毛，新分离菌株为光滑型，具有荚膜和毒力。百日咳杆菌的唯一宿主是人类，百日咳杆菌主要引起的百日咳，是一种急性呼吸系统疾病，传染性强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一。
现有传统方案检测百日咳杆菌的方法主要有以下：1.百日咳培养为百日咳检测的金标准，其特异性强，但其培养的周期长(一般约7d)，灵敏度低且对培养技术高，不适用与实验室的快速检测。2.百日咳的免疫学检测方法常取疑似急性期与恢复期2份血清标本进行检测，取样周期比较长，且灵敏度和特异性都不高，不适用百日咳的快速诊断。 3.百日咳的快速诊断为PCR诊断，但目前所采用的引物其灵敏度不高，不适于检测鼻咽拭子样本中的百日咳杆菌核酸。
发明内容
为解决现有技术的百日咳的PCR的快速诊断所采用的引物灵敏度不高技术问题，本发明提供一种解决上述问题的百日咳杆菌核酸检测试剂盒。
一种百日咳杆菌核酸检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物，所述上游引物、所述下游引物、所述探针分别为SEQ IDNO：01至SEQ ID NO：03所示的序列。
在本发明提供的百日咳杆菌核酸检测试剂盒的一种较佳实施例中，还包括内标，为SEQ ID NO：07所示的序列。
根据权利要求2所述的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：在本发明提供的百日咳杆菌核酸检测试剂盒的一种较佳实施例中，04至SEQ ID NO：06所示的序列。
在本发明提供的百日咳杆菌核酸检测试剂盒的一种较佳实施例中，还包括酶混合液，其中包含Taq酶和0.5～2U/ul的尿嘧啶DNA 糖基化酶；还包括PCR反应液，其中包含dUTP。
在本发明提供的百日咳杆菌核酸检测试剂盒的一种较佳实施例中，还包括百日咳杆菌-阳性对照、百日咳杆菌-阴性对照。
相较于现有技术，本发明提供的所述百日咳杆菌核酸检测试剂盒适用于鼻咽拭子样本中的百日咳杆菌核酸检测，且具有良好的灵敏度、测定范围，且特异性、重复性好，满足实验需求。
附图说明
图1是2.00E+09～2.00E+02copies/ml梯度样本检测结果；
图2是2.00E+09～2.00E+02copies/ml梯度样本标准曲线；
图3是400copies/ml样本的检测结果；
图4是200copies/ml样本的检测结果；
图5是100copies/ml样本的检测结果；
图6是36例特异性样本的示意图；
图7是R1的8次重复扩增曲线；
图8是R2的8次重复扩增曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
所述百日咳杆菌核酸检测试剂盒包括多条序列：SEQ ID NO：01 所示的上游引物、SEQ ID NO：02所示的下游引物、SEQ ID NO：03 所示的探针、SEQ ID NO：07所示的内标、SEQID NO：04所示的内标上游引物、SEQ ID NO：05所示的内标下游引物、SEQ ID NO：06 所示的内标探针；以及实时荧光定量PCR检测所需试剂。试剂应避光密闭保存，置于-20±5℃保存。反复冻融不超过5次。
试剂适用于ABI7500、Stratagene Mx3000P荧光PCR仪。
试剂适用于鼻咽拭子样本。样本采集时应用无菌捻拭子拭取咽部或鼻腔分泌物，将分泌物或咽拭子置入无菌玻璃管(含0.4ml灭菌生理盐水)，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质(如聚脂或涤纶)、柄为铝制或塑料。不应使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。标本可立即用于检测，也可保存于-20℃待测。
待测样本48小时内进行检测的可存放于4℃，2个月以内可存放于-20℃以下，2个月以上应置于-70℃以下。应避免反复冻融。
检测时具体包括以下操作步骤：
1.试剂准备：
1.1取出各组分，室温放置至温度平衡后，混匀备用。
1.2根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例(DNA提取溶液100μl/人份+百日咳杆菌内标0.4μl/人份)取提取试剂及百日咳杆菌内标，充分混匀成提取试剂混合液，瞬时离心后备用。
1.3根据待测样本、阴性对照、阳性对照数量，按比例(百日咳杆菌PCR反应液40μl/人份+RT-PCR增强剂1μl/人份)取百日咳杆菌PCR反应液及RT-PCR增强剂，充分混匀成PCR混合液，瞬时离心后备用。
2.样本处理(阴性对照、阳性对照与待测样本同步处理)：
2.1采用浓缩法或磁珠法处理样本。
2.2吸取上述已经处理好的DNA样本(包括待测样本、阴阳性对照)各10μl，分别转移至扩增八连管，每管加入40μl PCR混合液。
3.PCR扩增：
3.1将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及未知样本，并设置样本名称。
3.2荧光检测通道选择(ABI、Stratagene系列仪器):
1)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)检测百日咳杆菌DNA；2)选择HEX/VIC通道(Reporter:HEX/VIC，Quencher； none)检测百日咳杆菌的内标。3)参比荧光(Reference Dye)：选择 ROX。设置Sample Volume为50。
3.3循环参数设定(ABI、Stratagene系列仪器)：
Figure RE-GDA0002120018320000041
4.结果分析(以ABI系列仪器为例)：
反应结束后自动保存结果，对百日咳杆菌的曲线和相应百日咳杆菌内标的曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start 值、End值以及Threshold值，点击Analyze进行分析，使各项参数符合下述内容中的要求。然后到Plate窗口下记录定量结果。
5.质量控制：
百日咳杆菌阴性对照：FAM曲线无Ct值显示；百日咳杆菌内标检测(HEX/VIC)为阳性，且Ct≤40；
百日咳杆菌阳性对照：FAM曲线Ct≤30；
以上要求需在同一次实验中同时满足。
本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为38，内标Ct的参考值为 40。因此：
1)反应液FAM检测Ct值均≤38，且反应液内标检测为阳性(Ct 值≤40)，报告为百日咳杆菌阳性；
2)反应液FAM和CY5检测Ct值均>38，且反应液内标通道检测为阳性(Ct值≤40)，报告为百日咳杆菌阴性；
3)反应液内标检测Ct值>40或无显示，检测结果无效。
6.线性范围：
以经定值的百日咳杆菌核酸为初始样本，依次向下10倍梯度稀释至2.00E+09copies/ml、2.00E+08copies/ml、2.00E+07copies/ml、 2.00E+06copies/ml、2.00E+05copies/ml、2.00E+04copies/ml、 2.00E+03copies/ml、2.00E+02copies/ml。使用质检合格的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，严格按试剂盒说明书的要求操作，在同一台仪器上进行检测，考查能够直接对样本进行检测的测定范围。
请同时参阅图1、图2，是2.00E+09～2.00E+02copies/ml梯度样本检测结果和标准曲线。
标准品 1 2 3 4 5 6 7 8
浓度 2E9 2E8 2E7 2E6 2E5 2E4 2E3 2E2
Ct值 15.4 18.85 22.45 25.49 28.73 32.07 35.36 38.51
R2＝0.9997
经质检合格的百日咳杆菌核酸检测试剂盒检测，每个样本每个浓度重复2次检测，结果均为阳性，因此，本试剂盒可测定的测定范围为2.00E+09copies/ml～2.00E+02copies/ml。
7.检测下限：
将经定值的百日咳杆菌核酸样本释至4.00E+02copies/ml、2.00E+02copies/ml、1.00E+02copies/ml作为待测样本，用质检合格的百日咳杆菌核酸检测试剂盒进行检测，每个浓度样本各重复 8次检测，以确定本试剂盒的检测下限即分析灵敏度。
请同时参阅图3～图5，分别是400copies/ml、200copies/ml、 100copies/ml样本的检测结果。
分析灵敏度样本 阳性数/样本数 阳性率(％)
400copies/ml 8/8 100％
200copies/ml 8/8 100％
100copies/ml 6/8 75％
经质检合格的百日咳杆菌核酸检测试剂盒检测，核酸浓度为 400copies/ml和200copies/ml的样本均能100％检出，而浓度为 100copies/ml的样本检出率为75％，因此确定本试剂盒的分析灵敏度为200copies/ml。
8.特异性：
选择正常人类冠状病毒229E，人类冠状病毒OC43，人类冠状病毒HKU1，人类冠状病毒NL63，人类博卡病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体，腺病毒，甲型流感病毒，乙型流感病毒，副流感病毒1-3型，鼻病毒，合胞病毒样本共35例以及1例SARS冠状病毒体外转录RNA 样本。该36例样本用于考察试剂的特异性。
请参阅图6，是36例特异性样本的示意图。36份特异性样本，百日咳杆菌核酸检测均为阴性，试剂盒检测特异性好。
9.重复性：
对高浓度样本R1(1*106)和低浓度样本R2(1*104)分别进行 8次重复检测，验证其重复性
请同时参阅图7、图8，分别是R1、R2的8次重复扩增曲线。
R1 24.75 24.95 24.89 24.85 24.87 24.95 24.90 24.94
R2 31.61 31.59 31.81 31.55 31.89 31.64 31.81 31.54
不同次的检测结果之间差异很小，重复性好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 湖南宏雅基因技术有限公司
<120> 百日咳杆菌核酸检测试剂盒
<130> 0001
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gctgcacatc gacatcaaga a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gccacgaaga cgaagtccc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cggccccctc aacggtatcg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
caaagaccgt tgtgtccaga ag 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cgcatgttta cacttgggtt tc 22
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
caacgtcctg tccaccttcc tcctatg 27
<210> 7
<211> 178
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tggtattaat ggaattaacg tggagacgag cactaataac caaatcttat gtgacataat 60
attttgagta tattttatat agagcattct cactaaaaaa attacacata tcgtgagcaa 120
tgaactgatt atacttaaca ttaaaaaaga tgataacacc ttctacacct ccatatca 178

Claims (5)

1.一种百日咳杆菌核酸检测试剂盒，包括用于检测靶多核苷酸的探针、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物，其特征在于：所述上游引物、所述下游引物、所述探针分别为SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：03所示的序列。
2.根据权利要求1所述的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括内标，为SEQID NO：07所示的序列。
3.根据权利要求2所述的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括内标上游引物、内标下游引物、内标探针，分别为SEQ ID NO：04至SEQ ID NO：06所示的序列。
4.根据权利要求1至3任一所述的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括酶混合液，其中包含Taq酶和0.5～2U/ul的尿嘧啶DNA糖基化酶；还包括PCR反应液，其中包含dUTP。
5.根据权利要求1至3任一所述的百日咳杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括百日咳杆菌-阳性对照、百日咳杆菌-阴性对照。
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