CN113718046B - 一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引物和探针与应用 - Google Patents

一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引物和探针与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引物和探针与应用，属于微生物检测技术领域。百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，其对应的引物和探针分别为SEQ ID NO.5‑7、SEQ ID NO.8‑10、SEQ ID NO.11‑13和SEQ ID NO.14‑16所示。本发明提供了百日咳鲍特杆菌基因组中重复出现，且不在其他微生物中存在的特异性多拷贝基因片段，以此基因片段设计的百日咳鲍特杆菌基因检测方法，实现了高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题。

Description

一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引 物和探针与应用
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引物和探针与应用。
背景技术
百日咳鲍特杆菌(简称百日咳杆菌)为卵圆形短小杆菌，大小为0.5～1.5×0.2～0.5um，属鲍特杆菌属(Bordetella)，无鞭毛、芽胞，革兰氏染色阴性，用甲苯胺蓝染色可见两极异染颗粒，专性需氧，初次分离培养时营养要求较高，需用即鲍-金氏培养基才能生长，经37℃2～3天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长，并有少量粘性沉淀。
与百日咳鲍特杆菌致病性有关的物质有荚膜、细胞壁脂多糖及多种生物学活性因子。百日咳外毒素是主要的致病因子，能诱发肌体的持久免疫力，有多种生物活性，如提高小鼠对组织胺、5～羟色胺和敏感性，促进白细胞增多，抑制巨噬细胞功能，损伤呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽等。细菌破裂后还能在宿主细胞浆中查到一种热不稳定性毒素和其他几种抗原成份，可引起纤毛上皮细胞炎症和坏死。
百日咳鲍特杆菌引起人类百日咳。病人尤其是症状轻微的非典型病人是重要的传染源，主要经飞沫传播。易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周，病程分三期：(1)卡他期：发病早期仅有轻度咳嗽，细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。(2)痉挛期：1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调“鸡鸣样”喘息音。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀。此外可伴有呕吐、惊厥。(3)恢复期：4～6周后阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。本病病程较长，故名百日咳。在致病过程中，百日咳鲍特杆菌始终在纤毛上皮细胞表面，并不入血。
感染百日咳鲍特杆菌后可出现多种特异性抗体，免疫力较为持久，仅少数病人可再次感染，再发的病情亦较轻。粘膜局部的分泌型IgA具有阻止细菌粘附气管粘膜细胞纤毛的作用，其抗感染作用比血清中的抗体更重要。细胞免疫在百日咳鲍特杆菌感染中的作用还不甚明了。
目前临床上常用百日咳鲍特杆菌检测方法有：细菌培养、血清学筛查、核酸检测等。
(1)细菌培养是临床微生物检验的金标准方法，但百日咳鲍特杆菌生长缓慢，用普通的血平板培养不能很好的分离得出，需要通过特殊的培养基—鲍-金培养基才能分离筛选培养，其中还伴随着培养周期长、技术要求高、敏感性低的缺陷；
(2)血清学筛查(即血清学实验)，是百日咳鲍特杆菌的靶抗原或患者血清中抗体，在体外同相应抗体或抗原所发生的特异性结合反应的试验，如凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、溶解反应、中和试验、肥达反应等，均可用于检查患者血清中有无抗体或痰液(咽拭子)中有无百日咳鲍特杆菌抗原，以鉴定病原体。但该方法窗口期长，有滞后性，且在检测过程中有交叉反应而经常出现假阳性结果；
(3)传统的核酸检测利用已知特殊基因或保守基因设计引物，其缺点在于引物设计效率低，需要通过查阅文献资料，得知保守基因序列后，才能进行引物设计；再者，已知保守基因往往是单个拷贝的序列，由于拷贝数偏低，使得PCR检测限偏高，无法满足临床高敏感性的需求；若使用已知高拷贝的基因序列，如IS481基因序列，其能比对上百日咳鲍特杆菌的同时，也能比对上霍氏鲍特杆菌，特异性较低；因此，通过传统方法设计引物无法同时兼顾敏感性、特异性。
由于上述的实验室检测方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，重复性差等缺点，使检测结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列，该特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
本发明的目的之二在于提供检测百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列的引物和探针，所述特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.1时，其对应的引物和探针如SEQ ID NO.5-7所示；所述特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.2时，其对应的引物和探针如SEQ ID NO.8-10所示；所述特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.3时，其对应的引物和探针如SEQ ID NO.11-13所示；所述特异性多拷贝序列为SEQ ID NO.4时，其对应的引物和探针如SEQ ID NO.14-16所示。
本发明的目的之三在于提供一种百日咳鲍特杆菌的荧光检测试剂盒，该荧光检测试剂盒包括引物和探针SEQ ID NO.5-7、SEQ ID NO.8-10、SEQ ID NO.11-13或SEQ IDNO.14-16。
优选地，所述试剂盒中，由终浓度1×的Taq buffer；终浓度分别为0.16mM的dATP、dGTP、dCTP；终浓度为0.32mM的dUTP；终浓度都为0.15μM的百日咳鲍特杆菌检测引物对；终浓度为0.05μM的百日咳鲍特杆菌检测探针共同组成PCR反应液A；由终浓度为2U的热启动Taq酶、终浓度为0.2U的UNG酶共同组成PCR反应液B。
优选地，所述试剂盒中还包括阴性质控品和阳性质控品。
本发明的目的之四在于提供上述引物和探针在制备百日咳鲍特杆菌检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
将本发明提供的引物和探针可以应用于不同的核酸检测技术，例如普通PCR、荧光定量PCR、恒温扩增、基因芯片等，开发出多种敏感性高、特异性强、成本低、检测通量更大的百日咳鲍特杆菌核酸检测方法。
本发明采用具有自主知识产权的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，将完整的百日咳鲍特杆菌参考序列打断为固定长度的kmers，然后使用核酸序列比对软件将kmers和NCBI的nt库(非冗余核酸数据库)进行比对，得到百日咳鲍特杆菌基因组中重复出现，且不在其他微生物中存在的多拷贝基因片段，以此基因片段设计的百日咳鲍特杆菌基因检测方法，实现了高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题。
附图说明
图1为实施例1中kmer片段的编号。
图2为实施例1中kmer特异性比对结果图。
图3为实施例1中kmer敏感性比对结果图。
图4为实施例1中node1序列与参考基因blast比对结果图。
图5为实施例1中node2序列与参考基因blast比对结果图。
图6为实施例1中node3序列与参考基因blast比对结果图。
图7为实施例1中node4序列与参考基因blast比对结果图。
图8为实施例2中IS481基因与参考基因组blast比对结果图。
图9为实施例2中IS481基因特异性比对结果图。
图10为实施例3中pstS1基因在NCBI中的详细信息。
图11为实施例3中pstS1基因与参考基因组blast比对结果图。
图12为实施例3中pstS1基因特异性比对结果图。
图13为实施例5中阳性样本qPCR实验结果图。
图14为实施例5中百日咳鲍特杆菌与副百日咳鲍特杆菌qPCR结果对比结果图。
图15为实施例5中阴性样本qPCR实验结果图。
具体实施方式
实施例1
(1)利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载百日咳鲍特杆菌的参考基因组序列(GenBank:NC_002929.2，序列全长4086189bp)。
(2)利用核酸序列打断软件把参考基因组序列打断成200bp大小的kmer片段(kmer编号参见图1)，统计基因组中不同kmer的出现次数，筛选出现2次以上的kmer片段并进行编号，组成候选kmer集合(命名为BP_kmer_200.fa)。
(3)在NCBI的GenBank数据库中，以“Bordetella pertussis”为关键词进行搜索，导出所有归属为百日咳鲍特杆菌的核酸序列的索引号，大约包括414010条核酸序列，命名为BP_GI文件。
(4)kmer片段特异性比对：利用核酸序列比对软件，把候选kmer集合(BP_kmer_200.fa)比对到去除百日咳鲍特杆菌特异性序列(BP_GI)后的NCBI的nt数据库，比对结果参见图2。以evalue＝1.0E-5为阈值，统计比对的非特异性结果的kmer序列，从候选kmer集合去除这部分非特异性kmer，获得了百日咳鲍特杆菌特异性的kmer集合(命名为kmer_spe.fa)。
(5)kmer片段敏感性比对：利用核酸序列比对软件，把特异性kmer集合(kmer_spe.fa)比对到只有百日咳鲍特杆菌特异性序列(BP_GI)的NCBI的nt数据库，比对结果参见图3。依据比对结果统计特异性kmer(kmer_spe.fa)可以比对上的百日咳鲍特杆菌核酸序列数目，根据比对数目从高到低排列，获得高敏感性的kmer集合(命名为kmer_sen.fa)。
(6)根据核酸序列组装软件对高敏感性的kmer序列(kmer_sen.fa)进行组装和去重复，获得更长的百日咳鲍特杆菌的特异性多拷贝序列(BP_nodes.fa)，共4个长片段序列(命名为node序列)，序列如下，比对到百日咳鲍特杆菌基因组(GenBank:NC_002929.2)中，每个node序列在该基因组有17个拷贝：
>NODE_1_length_216(SEQ ID NO.1)
CGACTCCGCCCAGAGCCTGGCCGCCTATCTCGGGGTGGTCCCTGTGCAGCGCCAATCCGGCAGCAGTCTGAACAGCTGCGCACGCCTGTCCAAAGCCGGCCCCTCCCAGGTGCGCGCCACGTTATACATGGCGGCCCTGGTTGGGACCCGCCACAACCCCCACATCCGCGCCCTTTACCAGCGCCTGCTCAAAGCAGGAAAAAGCAAAAAGGCCGC。
node1序列与参考基因blast的比对结果参见图4。
>NODE_2_length_256(SEQ ID NO.2)
GCCTTGTTGACGCGACGCGAGGCGCTGAGCAAGGATCTGTTGCGTGAGCTCAATCGCAAAGAGAAGAGCCAGTTCAGCCCCTCGGCGCCCTTGGTCGATGGTTCCATCGACAAGGCCATCGCGTTCTTGCGCGAACAGATCAAACAAATCGAGCGGGCGATCGATCAGCACATCGACAACCACCCCGACCTCAAGCAAGACTGCGAGCTGCTGAACTCCATCCCCGCCATCGGGCCTCAGGCCGGCAACGCCATCC。
node2序列与参考基因blast的比对结果参见图5。
>NODE_3_length_253(SEQ ID NO.3)
GATGGCGTTGCCGGCCTGAGGCCCGATGGCGGGGATGGAGTTCAGCAGCTCGCAGTCTTGCTTGAGGTCGGGGTGGTTGTCGATGTGCTGATCGATCGCCCGCTCGATTTGTTTGATCTGTTCGCGCAAGAACGCGATGGCCTTGTCGATGGAACCATCGACCAAGGGCGCCGAGGGGCTGAACTGGCTCTTCTCTTTGCGATTGAGCTCACGCAACAGATCCTTGCTCAGCGCCTCGCGTCGCGTCAACAAG。
node3序列与参考基因blast的比对结果参见图6。
>NODE_4_length_210(SEQ ID NO.4)
CCCAGCGCGGCCTTTTTGCTTTTTCCTGCTTTGAGCAGGCGCTGGTAAAGGGCGCGGATGTGGGGGTTGTGGCGGGTCCCAACCAGGGCCGCCATGTATAACGTGGCGCGCACCTGGGAGGGGCCGGCTTTGGACAGGCGTGCGCAGCTGTTCAGACTGCTGCCGGATTGGCGCTGCACAGGGACCACCCCGAGATAGGCGGCCAGGCTC。
node4序列与参考基因blast的比对结果参见图7。
实施例2
传统基因检测，常常以IS481基因序列为靶标建立基因检测方法。本实施例将实施例1中获得的特异性多拷贝序列与IS481基因序列在生物信息分析层面进行了比对，具有显著的高特异性，结果如下：
通过参考文献“Novel Multitarget Real-Time PCR Assay for RapidDetection of Bordetella Species in Clinical Specimens，DOI：10.1128/JCM.00601-11”，得到IS481基因序列(Genbank NO.M28220.1，全长1073bp)；在NCBI上对这段序列进行敏感性比对，结果参见图8，有高达240个拷贝，表现出优越的敏感性。
但是，特异性方面，通过NCBI比对(参见图9)，IS481基因序列能与多个鲍特菌属下的其他菌种比对上，特别是霍氏鲍特杆菌，除此之外，还比对上鲍特菌属所属科的其他菌属下的物种，这表明IS481基因特异性很低；虽然可以通过一定手段设计引物，以降低敏感性提升特异性，但该基因能与霍氏鲍特杆菌基因组有98.62％的匹配度，即全长1073bp的序列只有至多15个碱基错配，引物无法避免与霍氏鲍特杆菌基因结合发生PCR扩增；也有文献(Towards Improved Accuracy of Bordetella pertussis Nucleic Acid AmplificationTests，DOI：10.1128/JCM.00612-12)报道，该基因拷贝数虽高，保守性也好，常用于百日咳鲍特杆菌核酸鉴定，但该基因片段在霍氏鲍特杆菌中同样存在多个拷贝，在检测临床样本时，假阳性结果被误诊为百日咳鲍特杆菌，引起假性百日咳鲍特杆菌爆发，因此单独用IS481基因进行核酸检测毫无临床意义。
由生物信息分析可知，实施例1中的4个特异性多拷贝序列在百日咳鲍特杆菌全基因组都有17个拷贝，表现出极高的敏感性，同时在引起人类疾病的其他微生物及鲍特杆菌属其它种没有非特异性比对，以这4个特异性多拷贝序序列设计引物用于临床核酸检测，以较高的检测性能(高特异性、高敏感性)、较低的成本、简单的操作流程，解决临床上漏诊、误诊百日咳鲍特杆菌的难题，在临床百日咳鲍特杆菌精准检测方面应用前景广阔。
实施例3
传统基因检测，应用最多的基因靶序列还包括pxtS1基因序列，pstS1基因在NCBI的详细信息参见图10。将实施例1中的特异性多拷贝序列与pxtS1基因序列在生物信息分析层面进行了比对，具有显著的高敏感性，结果如下：
通过参考文献“Novel Multitarget Real-Time PCR Assay for RapidDetection of Bordetella Species in Clinical Specimens，DOI：10.1128/JCM.00601-11”，得到ptx基因序列(Genbank NO.M14378.1，全长4936bp)，通过备注信息截取该基因的S1区(507-1316)。
在NCBI上对ptx基因序列进行敏感性比对，结果参见图11，该基因为典型的单拷贝基因，在与本发明参考基因组比对时，只有1个拷贝，敏感性远远低于实施例1中的特异性多拷贝序列。
特异性方面，通过NCBI比对(参见图12)，ptx基因序列也能与百日咳鲍特杆菌以外的其它种如副百日咳鲍特杆菌及支气管鲍特杆菌比对上，这表明pxtS1基因虽然在特异性上相比IS481基因有着显著提升，但拷贝数只有1个，检测限高，临床上很难避免假阴性情况，导致漏诊。同样也被文献(Towards Improved Accuracy of Bordetella pertussisNucleic Acid Amplification Tests，DOI：10.1128/JCM.00612-12)报道，pxtS1为单拷贝基因，同时存在于副百日咳鲍特杆菌基因组中，通过核酸检测方法检测百日咳鲍特杆菌，会有假阳性结果出现，必须联合其他已知序列才能精准检测出百日咳鲍特杆菌。
由上述生物信息分析可知，实施例1中的4个特异性多拷贝序列在百日咳鲍特杆菌全基因组都有17个拷贝，表现出极高的敏感性，同时在引起人类疾病的其他微生物及鲍特杆菌属其它种没有非特异性比对，以这4个特异性多拷贝序列设计引物用于临床核酸检测，以较高的检测性能(高特异性、高敏感性)、较低的成本、简单的操作流程，解决临床上漏诊、误诊百日咳鲍特杆菌的难题，在临床百日咳鲍特杆菌精准检测方面应用前景广阔。
实施例4
基于Taqman实时荧光定量PCR技术，针对实施例1中的特异性多拷贝序列设计引物、探针。其中，将产物长度限制在60-120bp，引物Tm值设定为56±4℃，探针Tm值设定为66±4℃，分别在4个node特异性多拷贝序列中设计一个引物、探针组合，得到4对引物、4个探针如下：
BPnode1-F(SEQ ID NO.5)：GCACGCCTGTCCAAAGCC；
BPnode1-R(SEQ ID NO.6)：CAGGGCCGCCATGTATAAC；
BPnode1-P(SEQ ID NO.7)：CCTCCCAGGTGCGCGCCAC；
BPnode2-F(SEQ ID NO.8)：CGCAAAGAGAAGAGCCAGTT；
BPnode2-R(SEQ ID NO.9)：GATGGCCTTGTCGATGGAAC；
BPnode2-P(SEQ ID NO.10)：CCCTCGGCGCCCTTGGTCGA；
BPnode3-F(SEQ ID NO.11)：GCCCGCTCGATTTGTTTGAT；
BPnode3-R(SEQ ID NO.12)：GATGGTTCCATCGACAAGGC；
BPnode3-P(SEQ ID NO.13)：CATCGCGTTCTTGCGCGAACAG；
BPnode4-F(SEQ ID NO.14)：GTGCGCAGCTGTTCAGAC；
BPnode4-R(SEQ ID NO.15)：AGCCTGGCCGCCTATCTC；
BPnode4-P(SEQ ID NO.16)：TGCAGCGCCAATCCGGCAGC。
拷贝数分析：将引物对应的产物序列比对到百日咳鲍特杆菌参考基因组(GenBank:NC_002929.2)中，得到的匹配数即为引物在该基因组中的拷贝数，统计如表1所示；亦可将产物序列比对到bordetella pertussis(taxidermy：520)中，得到产物与多个百日咳鲍特杆菌的匹配数。
覆盖度分析：通过NCBI基因库下载所有百日咳鲍特杆菌全基因组(BP_gilist_CG.gi)，将4对引物对应的产物进行统计，制备.fa格式文件(BP_Primer Puduct.fa)；将产物(BP_Primer Puduct.fa)与百日咳鲍特杆菌全基因组(BP_gilist_CG.gi)进行序列比对，得到能与产物配对的特异性blast文件(BP_spcial.blast)，去除重复，得到去重复特异性blast文件(BP_L_spcial.blast)，统计BP_L_spcial.blast文件各产物匹配完整基因条数，并统计BP_gilist_CG.gi文件完整基因序列条数，两者的比值即为覆盖度(覆盖度越大，说明在百日咳鲍特杆菌全基因组(BP_gilist_CG.gi)中检出完整百日咳鲍特杆菌基因序列条数越多)，详细统计数据参见表1；
特异性比对：利用NCBI中的blast网站进行两次评估，分别为产物的评估及探针的评估。将bordetella pertussis(taxidermy：520)从数据库中剔除，再将各个产物与数据库进行匹配，统计匹配结果，详细统计数据见表1。
表1 4个node特异性多拷贝序列技术参数统计
Figure BDA0003274840360000081
可见，针对本发明的百日咳鲍特杆菌多拷贝基因序列设计出的引物、探针序列，覆盖度广、拷贝数多，表现出很高的敏感性；特异性上，没有比对上存在并引起人类疾病的副百日咳鲍特杆菌及霍氏鲍特杆菌，或其他微生物，虽然能比对到极少的支气管败血鲍特杆菌，但此菌常见于动物呼吸道，不存在于人呼吸道中，并不影响临床核酸检测。
针对本发明的百日咳鲍特杆菌多拷贝基因序列设计出的引物、探针序列，其敏感性、特异性都非常优越，将其运用到临床核酸检测上，可以弥补现阶段实验室检查方法中敏感性差，特异性低，重复性差等缺点。
实施例5
本实施例利用BPnode1对应的引物对和荧光探针检测百日咳鲍特杆菌的特异性和敏感性评价。
1.样本准备
(1)阳性样本：培养百日咳鲍特杆菌，提取核酸，用Qubit测定浓度，然后计算并用缓冲液将核酸以10倍的稀释度稀释至1.0×107copies/mL～1.0×100copies/mL八个浓度梯度。
(2)阴性及其它病原体样本：与百日咳鲍特杆菌种属相近、临床症状相似的病原体，或呼吸道常见菌群的核酸，如副百日咳、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、口腔链球菌、表面葡萄球菌、卡他球菌、肺炎支原体、腺病毒、EB病毒、甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、副流感病毒，共12个细菌、7个病毒、1个支原体；生理盐水。
2.反应体系
(1)PCR反应液包括PCR反应液A、PCR反应液B。其中反应液A包括Taq buffer(Mg2+Plus，菲鹏)，终浓度1×；dATP、dGTP、dCTP，终浓度0.16mM，dUTP，终浓度0.32mM；百日咳鲍特杆菌引物(BP node1引物)，终浓度每个0.15μM，百日咳鲍特杆菌探针(BPnode1探针，FAM-BHQ1)，浓度每个0.05μM；反应液B包括热启动Taq酶(Taq DNA Polymerase与Taq Antibody混合，2.5U/μL)，终浓度2U；UNG酶，终浓度0.2U。
(2)反应体系
反应液A 39μL×n(n为检测数)+反应液B 1μL×n，混匀后向每管分装40μL，加入样本/模板10μL，短暂离心后上机检测。
3.荧光PCR反应条件
对应上述加样体系，将方法中各成份分别加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应，具体反应步骤如下：
50℃120s，1个循环；
95℃600s，1个循环；
95℃、10s，55℃、30s(收集荧光)，40个循环；
37℃、20s，1个循环。
4.结果判定(根据Ct值)
表2
样本(FAM) 判定结果
Ct<37有明显S型扩增曲线 阳性
Ct≥37无明显S型扩增曲线 阴性
5.检测结果
阳性样本qPCR实验结果参见图13，可知，阳性样本在1.0×107copies/mL～1.0×101copies/mL之间有很好的线性关系，且检测限可达到1.0×101copies/mL，这表明根据本发明特异性多拷贝序列设计出的引物有着极高的敏感性。
百日咳鲍特杆菌与副百日咳鲍特杆菌的qPCR对比结果参见图14，可知，在PCR反应正常进行的情况下，副百日咳鲍特杆菌样本没有明显的扩增曲线，判为阴性；除此之外，其他病原体样本同样没有出现明显扩增曲线，阴性样本qPCR实验结果参见图15，表明通过本发明特异性多拷贝序列设计出的引物有着极高的特异性。
实施例6
本实施例对实施例5百日咳鲍特杆菌的PCR荧光检测方法与普通荧光检测方法进行比对实验。
1.样本采集
取咽拭子样本，及时送检。共收集样本224个，所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。
2.本发明所述百日咳鲍特杆菌的PCR荧光检测反应体系与实施例5一致。
3.普通荧光检测引物
根据文献“Novel Multitarget Real-Time PCR Assay for Rapid Detection ofBordetella Species in Clinical Specimens，DOI：10.1128/JCM.00601-11”，得到引物、探针序列，并对相应探针标记荧光基团如下：
IS481基因的上游引物(SEQ ID NO.17)：5’-CAAGGCCGAACGCTTCAT-3’；
IS481基因的下游引物(SEQ ID NO.18)：5’-GAGTTCTGGTAGGTGTGAGCGTAA-3’；
IS481基因的探针(SEQ ID NO.19)：5’-FAM-CAGTCGGCCTTGCGTGAGTGGG-BHQ1-3’；
hIS1001基因的上游引物(SEQ ID NO.20)：5’-GGCGACAGCGAGACAGAATC-3’；
hIS1001基因的下游引物(SEQ ID NO.21)：5’-GCCGCCTTGGCTCACTT-3’；
hIS1001基因的探针(SEQ ID NO.22)：5’-HEX-CGTGCAGATAGGCTTTTAGCTTGAGCGC-BHQ1-3’；
pIS1001基因的上游引物(SEQ ID NO.23)：5’-TCGAACGCGTGGAATGG-3’；
pIS1001基因的下游引物(SEQ ID NO.24)：5’-GGCCGTTGGCTTCAAATAGA-3’；
pIS1001基因的探针(SEQ ID NO.25)：5’-ROX-AGACCCAGGGCGCACGCTGTC-BHQ2-3’；
ptxS1基因的上游引物(SEQ ID NO.26)：5’-CGCCAGCTCGTACTTC-3’；
ptxS1基因的下游引物(SEQ ID NO.27)：5’-GATACGGCCGGCATT-3’；
ptxS1基因的探针(SEQ ID NO.28)：5’-CY5-AATACGTCGACACTTATGGCGA-BHQ3-3’。
4.PCR检测
(1)溶解引物，终浓度为10μM；
(2)使用上述引物进行PCR，试剂使用TaKaRa Probe qPCR Mix,with UNG(RR392A)，模板量10ul。
(3)PCR体系
表3
Probe qPCR Mix,with UNG(2×) 12.5μl
上游引物 0.5μl
下游引物 0.5μl
探针 0.25μl
PCR水 补足25μl
模板 5.0μl
(4)PCR条件
25℃600s，1个循环；
95℃300s，1个循环；
95℃、15s，57℃、60s(收集荧光)，45个循环；
37℃、20s，1个循环。
5.结果判定
表4
Figure BDA0003274840360000111
6.检测结果
在224个咽拭子中：本发明检测方法检测出105个百日咳鲍特杆菌阳性，119个百日咳鲍特杆菌阴性；对比方法检测出105个百日咳鲍特杆菌阳性，有119个百日咳鲍特杆菌阴性，具体数据参见表5。
表5
Figure BDA0003274840360000112
本发明方法的敏感度为97.14％；特异度为97.48％，由此对比得出本方法有着极高的敏感性和特异性。并且，对比方法的119个百日咳鲍特杆菌阴性结果中，有81个IS481基因单独阳性结果，再次证实生物信息分析结果，该基因并非百日咳鲍特杆菌独有，如不结合其他基因同时检测，便会导致81个百日咳鲍特杆菌阴性样本的临床误判，对临床治疗造成不必要的影响。发明人针对上述表5中6个结果存在差异的样本进行了Sanger测序，结果为：本发明检测结果为阳性、对比方法检测结果为阴性的3例样本，Sanger测序结果全部阳性；本发明检测结果为阴性、对比方法检测结果为阳性的3例样本，Sanger测序结果1例阳性，2例阴性，与本发明的检测结果高度一致。可见，拷贝数过高的IS481基因表现出极低的特异性，需要结合多个基因同时检测，才能得出样本的正确结果。然而，根据对比文献(DOI：10.1128/JCM.00601-11)，对比方法使用了四个基因的荧光定量PCR核酸检测技术，成本太高；若用普通PCR法，需要通过电泳分析，其过程容易发生气溶胶污染且费时间；而本发明特异性多拷贝序列设计引物用于检测：(1)敏感性高，拷贝数高，降低检测限，反应更灵敏；(2)特异性高，不会扩增百日咳鲍特杆菌以外的物种；(3)与对比方法相比，单重检测成本低；(4)可基于不同的核酸检测技术平台，建立适合不同场景的检测试剂，扩大核酸检测的可实施性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 深圳市儿童医院
<120> 一种百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列及其对应的引物和探针与应用
<130> 2021.09.06
<141> 2021-09-23
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 216
<212> DNA
<213> 百日咳鲍特杆菌()
<400> 1
cgactccgcc cagagcctgg ccgcctatct cggggtggtc cctgtgcagc gccaatccgg 60
cagcagtctg aacagctgcg cacgcctgtc caaagccggc ccctcccagg tgcgcgccac 120
gttatacatg gcggccctgg ttgggacccg ccacaacccc cacatccgcg ccctttacca 180
gcgcctgctc aaagcaggaa aaagcaaaaa ggccgc 216
<210> 2
<211> 256
<212> DNA
<213> 百日咳鲍特杆菌()
<400> 2
gccttgttga cgcgacgcga ggcgctgagc aaggatctgt tgcgtgagct caatcgcaaa 60
gagaagagcc agttcagccc ctcggcgccc ttggtcgatg gttccatcga caaggccatc 120
gcgttcttgc gcgaacagat caaacaaatc gagcgggcga tcgatcagca catcgacaac 180
caccccgacc tcaagcaaga ctgcgagctg ctgaactcca tccccgccat cgggcctcag 240
gccggcaacg ccatcc 256
<210> 3
<211> 253
<212> DNA
<213> 百日咳鲍特杆菌()
<400> 3
gatggcgttg ccggcctgag gcccgatggc ggggatggag ttcagcagct cgcagtcttg 60
cttgaggtcg gggtggttgt cgatgtgctg atcgatcgcc cgctcgattt gtttgatctg 120
ttcgcgcaag aacgcgatgg ccttgtcgat ggaaccatcg accaagggcg ccgaggggct 180
gaactggctc ttctctttgc gattgagctc acgcaacaga tccttgctca gcgcctcgcg 240
tcgcgtcaac aag 253
<210> 4
<211> 210
<212> DNA
<213> 百日咳鲍特杆菌()
<400> 4
cccagcgcgg cctttttgct ttttcctgct ttgagcaggc gctggtaaag ggcgcggatg 60
tgggggttgt ggcgggtccc aaccagggcc gccatgtata acgtggcgcg cacctgggag 120
gggccggctt tggacaggcg tgcgcagctg ttcagactgc tgccggattg gcgctgcaca 180
gggaccaccc cgagataggc ggccaggctc 210
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gcacgcctgt ccaaagcc 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
cagggccgcc atgtataac 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cctcccaggt gcgcgccac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cgcaaagaga agagccagtt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gatggccttg tcgatggaac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ccctcggcgc ccttggtcga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gcccgctcga tttgtttgat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gatggttcca tcgacaaggc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
catcgcgttc ttgcgcgaac ag 22
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gtgcgcagct gttcagac 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
agcctggccg cctatctc 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
tgcagcgcca atccggcagc 20
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
caaggccgaa cgcttcat 18
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
gagttctggt aggtgtgagc gtaa 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
cagtcggcct tgcgtgagtg gg 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
ggcgacagcg agacagaatc 20
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
gccgccttgg ctcactt 17
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
cgtgcagata ggcttttagc ttgagcgc 28
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
tcgaacgcgt ggaatgg 17
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
ggccgttggc ttcaaataga 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
agacccaggg cgcacgctgt c 21
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
cgccagctcg tacttc 16
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
gatacggccg gcatt 15
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
aatacgtcga cacttatggc ga 22

Claims (5)

1.一种检测百日咳鲍特杆菌基因组特异性多拷贝序列的引物和探针，其特征在于，所述特异性多拷贝序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.5-7所示。
2.一种百日咳鲍特杆菌的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒包括权利要求1中的引物和探针。
3.如权利要求2所述的百日咳鲍特杆菌的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒包括由终浓度1×的Taq buffer ；终浓度分别为0.16mM的dATP、dGTP、dCTP；终浓度为0.32mM的dUTP；终浓度都为0.15μM的百日咳鲍特杆菌检测引物对；终浓度为0.05μM的百日咳鲍特杆菌检测探针共同组成PCR反应液A；由终浓度为2U的热启动Taq酶、终浓度为0.2U的UNG酶共同组成PCR反应液B。
4.如权利要求2或3所述的百日咳鲍特杆菌的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
5.权利要求1中所述的引物和探针在制备百日咳鲍特杆菌检测试剂中的应用。
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