CN112458212A

CN112458212A - 同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN112458212A
Application number: CN202011460072.6A
Authority: CN
Inventors: 李进福; 高利飞; 兰定云; 麦艳娜; 李振红; 王玮; 付光宇
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112458212B

Abstract

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。本发明提供的引物探针组合中，包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且，该试剂具有良好的稳定性，2～8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。

Description

同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。

背景技术

呼吸道感染是人类最常见的疾病之一，造成呼吸道感染的主要原因是各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。其中，甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)为临床较常见且重要的呼吸道病毒。呼吸道病毒引起的感染症状和流行性感冒特点相似，而引起的疫情及对社会造成的危害程度却不相同，由于很难仅靠临床症状确定真正的病原体，因此快速有效的鉴定呼吸道病原体种类，对于制定治疗和用药方案以及疫情防控均具有重要意义。

在现有技术中，分离培养是呼吸道病毒检测的“金标准”，但该方法操作复杂，耗时长，不适合用于早期诊断。抗体检测虽然操作简便，但其灵敏度和特异性变化较大，容易出现假阳性和假阴性。以核酸为基础的PCR(聚合酶链式反应)是一种用于特定核酸片段的扩增放大技术，该技术广泛应用于基因检测和病原体检测，具有灵敏度高，特异性好，简便，快捷等特点，对生物和医学研究及临床诊断具有重大意义。但现有技术中的荧光PCR检测，因引物特异性等方面的原因，很难实现对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的多重检测。并且，现有技术中的检测试剂保存条件非常严苛(为-20℃)，对运输条件要求高，且冻融次数少(小于3次)，导致检测成本高。且针对FluA/FluB/RSV鉴定的基因片段的选择和引物探针的涉及存在不合理的现象，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，该试剂盒具有良好的灵敏性、特异性，且试剂的可以于2～8℃稳定性保存。

本发明提供的引物探针组合，其包括：

甲型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

甲型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

甲型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

乙型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

乙型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

乙型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示；

呼吸道合胞病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:7所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物1，其核酸序列如SEQ ID NO:8所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物2，其核酸序列如SEQ ID NO:9所示；

呼吸道合胞病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明所述的引物探针组合，可以用于对样品中的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒进行定性或定量检测。本发明中，SEQ ID NO.1～2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示；该片段为甲型流感病毒的保守序列M基因。如SEQ ID NO.4～5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。该片段为乙型流感病毒的nuclear exportprotein(NEP)基因。如SEQ ID NO.7～9所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:16所示。该片段为呼吸道合胞病毒的保守序列并经过NCBI多序列比对。

本发明还提供了同时检测检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，其包括含有本发明所述引物探针组合的反应液。

一些实施例中，所述反应液中还包括内标的引物和探针；所述内标的序列为SEQID NO:17。本发明中，所述内标采用18S rRNA基因，针对其中SEQ ID NO:17所示的核苷酸片段设计引物和探针。其中，内标的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:11所示；内标的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:12所示；内标的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:13所示。

本发明提供的引物和探针均具有良好的特异性，互相不发生交叉反应。从而能够在一个反应体系中，同时检测多个靶标，具有良好的准确性、特异性和灵敏度，并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒，可以对未知样本中的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸进行快速检测，为诊断甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸提供可靠的实验依据，解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。

一些实施例中，

如SEQ ID NO.3所示探针的5’端连接FAM荧光基团；

如SEQ ID NO.6所示探针的5’端连接ROX荧光基团；

如SEQ ID NO.10所示探针的5’端连接CY5荧光基团；

如SEQ ID NO.13所示探针的5’端连接HEX荧光基团。

一些实施例中，所述反应液中还包括：Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰和水。

本发明中，所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰，可以以溶液形式分别独立存在，也可以混合形成反应液共同存在，在该反应液存储的过程中，可以包括或不包括引物和探针。一些实施例中，所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰，以溶液形式分别独立存在，其中，Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10％的Tween20、100％的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5u/ul、醋酸锰的浓度为50mM。

本发明所述的试剂盒中，还包括核酸提取及纯化试剂(安图生物，豫郑械备20180037号)。

一些实施例中，本发明所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌水；所述阳性质控品为人工合成的浓度1×10⁵Copies/ml的装甲RNA。

本发明还提供了一种非诊断目的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，其以本发明所述的试剂盒对样品进行检测，根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。

本发明中，所述的检测方法为real-time PCR法，根据报告的Ct值判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。所述根据Ct值判断包括：

SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所示探针通道无荧光值，且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35，报告检测结果为阴性；

SEQ ID NO.3、所示探针通道的CT值≤40，报告为甲型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.6、所示探针通道的CT值≤40，报告为乙型流感病毒阳性；

SEQ ID NO.10、所示探针通道的CT值≤40，报告为呼吸道合胞病毒阳性；

SEQ ID NO.3所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告甲型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≥40，但SEQID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告乙型流感病毒样本浓度低于检测下限；SEQ IDNO.10所示探针通道CT值皆≥40，但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35，报告呼吸道合胞病毒样本浓度低于检测下限；

当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≥35，出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。

本发明中，所述样品为咽拭子、鼻拭子或环境样品。

所述扩增的体系包括：25μL反应液和5μL样品提取物；

所述反应液包括：

本发明所述方法中，所述扩增的程序包括：

本发明提供的引物探针组合中，包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性，结合real time PCR检测方法，能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明，本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且，该试剂具有良好的稳定性，2～8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。

附图说明

图1示甲型流感病毒线性扩增图；

图2示乙型流感病毒线性扩增图；

图3示呼吸道合胞病毒线性扩增图。

具体实施方式

本发明提供了同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒的制备

试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示：

表1引物、探针序列

	名称	核苷酸序列
			FluA上游引物	SEQ ID NO：1	CTTCTAACCGAGGTHGAAACG
FluA下游引物	SEQ ID NO：2	GAGGTGACAGGATYGGTCTTGT
			FluA探针	SEQ ID NO：3	CCMTCAGGCCCCCTCAAAGCCGA
FluB上游引物	SEQ ID NO：4	TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG
			FluB下游引物	SEQ ID NO：5	CCAATTTGGTCAAGAGCACCG
FluB探针	SEQ ID NO：6	CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGG
			RSV上游引物	SEQ ID NO：7	GGCAAATATGGAAACATACGTGA
RSV下游引物1	SEQ ID NO：8	GATGCAGGATCATCGTCTTTTTC
			RSV下游引物2	SEQ ID NO：9	GATGCGGGATCATCATCTTTTTC
RSV探针	SEQ ID NO：10	CACGAAGGCTCCACATACACAGC
			内标上游引物	SEQ ID NO：11	GGTTGCAAAGCTGAAACTTAAA
内标下游引物	SEQ ID NO：12	AGTCAAATTAAGCCGCAGGC
			内标探针	SEQ ID NO：13	TTGACGGAAGGGCACCACCAGG

试剂盒中还包括：Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10％的Tween20、100％的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5U/ul、醋酸锰的浓度为50mM。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×10⁵Copies/ml的装甲RNA)。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

本发明的检测方法为Realtime RT-PCR，Real Time RT-PCR反应过程为(1)逆转录，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为42℃～60℃，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为10～20min。(2)预变性，时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃～105℃，时间一般为2～10min，预变性的目的为使双链核酸序列彻底分离为单链；(3)变性，温度一般为91℃～105℃，时间一般为10s～35s；(4)退火，使各引物退火至甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃～60℃，退火的时间可以是10s～60s(5)延伸，引物与模板结合，开始合成新的DNA双链，延伸温度一般为40℃～80℃，延伸时间可以是10s～1min。

每个检测体系的组成如表2：

荧光检测通道选择：(1)选择FAM通道(ReporTer：FAM，QuenCher：none)，检测甲型流感病毒；(2)选择ROX通道(ReporTer：ROX，QuenCher：none)，检测乙型流感病毒；(3)选择CY5通道(ReporTer：CY5，QuenCher：none)，检测呼吸道合胞病毒；(4)选择HEX通道，检测内标；(5)参比荧光(PAssive ReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。

表3：荧光定量实时PCR反应条件

反应结束后，仪器自动保存结果，利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下：

实施例3本发明试剂盒的可行性试验

1.最低检测限(LOD)试验

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。

(2)样本提取

将管中5个不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本,利用核酸提取及纯化试剂(安图生物，豫郑械备20180037号)批号为：20190527。进行核酸的纯化。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒均为25copies/ml。具体数据表4，表5、表6。

表4：甲型流感病毒检测限确认

样本浓度(copies/ml)	检测重复数	阳性检测数	阳性检出率
				1	21	1	9.52％
2.5	21	10	47.62％
				10	21	16	76.19％
25	21	21	100.00％
				100	21	21	100.00％

表5：乙型流感病毒检测限确认

表6:呼吸道合胞病毒检测限确认

样本浓度(copies/ml)	检测重复数	阳性检测数	阳性检出率
				1	21	1	9.52％
2.5	21	8	38.10％
				10	21	12	57.14％
25	21	20	95.24％
				100	21	21	100.00％

2、试剂线性灵敏度验证

(1)实验样本

取6份不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本(浓度分别为2.5×10⁴copies/mL、2.5×10³copies/mL、2.5×10²copies/mL、25copies/mL、2.5copies/mL、1.0copies/mL)对试剂的线性灵敏度进行验证。

(2)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测，具体数据图1，图2、图3。

3、与其它疾病的交叉反应情况

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制，通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂。

(2)交叉病原体样本提取：将管中含有麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，人副流感病毒4型病原体，白色念珠菌，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒1型，EB病毒，百日咳杆菌，杰氏棒杆菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，表皮葡萄球菌，唾液链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体，肺炎衣原体的咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。

(3)样本检测:将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测反应管中，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒作为阳性对照试验，按照实例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析：通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，人副流感病毒4型病原体，白色念珠菌，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒1型，EB病毒，百日咳杆菌，杰氏棒杆菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌，卡他莫拉菌，脑膜炎奈瑟菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌，表皮葡萄球菌，唾液链球菌，肺炎克雷伯菌，肺炎支原体，肺炎衣原体病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表7。

表7：交叉反应实验

4、对潜在外源物质的抗干扰性

(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制：通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制。

(2)样本处理

选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml，乙型流感病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml。呼吸道合胞病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml，同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。

(3)结果分析

干扰判断：干扰率小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

干扰率计算公式：(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100％。

试验表明，当样本中含有利巴韦林、氯化钠、地塞米松、盐酸组胺、盐酸组胺、奥司他韦、莫匹罗星、妥布霉素等常见的抗病毒药物时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表8。

表8：外源物质的抗干扰性实验

药物名称	干扰率(％)	药物名称	干扰率(％)
				利巴韦林	2.2	盐酸组胺	3.1
氯化钠	2.4	奥司他韦	2.2
				地塞米松	0.8	莫匹罗星	1.6
盐酸组胺	1.2	妥布霉素	1.4

5、对潜在内源物质的抗干扰性

(2)样本处理

选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml，乙型流感病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml。呼吸道合胞病毒两个浓度值分别为1×10⁶copies/ml和25copies/ml，同时将内源性干扰物质加入到对应病毒样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。

(3)结果分析

干扰判断：干扰率％小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10％)，即可判断为通过。

试验表明，当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表9。

表9：内源物质的抗干扰性实验

干扰物质	干扰率(％)
		血红蛋白	2.1
甘油三酯	1.6
		胆红素	2.3

实施例4本发明试剂盒的2-8℃稳定性考核

1.加速稳定性试验

(2)样本提取

将管中检出限浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃运输7天45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测，具体数据表10。

表10：加速稳定性试验

加速(45℃)时间(d)	检出情况
		7	稳定检出
10	稳定检出
		14	稳定检出

2.实时稳定性试验

(2)样本提取

(3)样本检测

将25μl处理好的标本上清加入到2-8℃运输7天2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中，每个型别2个复孔，同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照，按照实施例2中检测方法进行检测。

(4)结果分析

通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测，具体数据表11。

表11：实时稳定性试验

加速(2-8℃)时间(month)	检出情况
		3	稳定检出
6	稳定检出
		9	稳定检出
12	稳定检出

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 郑州安图生物工程股份有限公司

<120> 同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒

<130> MP2019802

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttctaaccg aggthgaaac g 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaggtgacag gatyggtctt gt 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccmtcaggcc ccctcaaagc cga 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctcaactc actcttcgag cg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaatttggt caagagcacc g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaattcgag cagctgaaac tgcgg 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcaaatatg gaaacatacg tga 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatgcaggat catcgtcttt ttc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatgcgggat catcatcttt ttc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacgaaggct ccacatacac agc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttgcaaag ctgaaactta aa 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agtcaaatta agccgcaggc 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgacggaag ggcaccacca gg 22

<210> 14

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cttctaaccg aagtcgaaac gtacgttctc tctatcgtcc cgtcaggccc cctcaaagcc 60

gagatcgcgc agagactgga agatgtcttt gcagggaaga acacagatct tgaggctctc 120

atggaatggc taaagacaag accaatcctg tcacctc 157

<210> 15

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcctcaact cactcttcga gcgtctcaat gaaggacatt caaagccaat tcgagcagct 60

gaaactgcgg tgggagtctt atcccaattt ggtcaagagc accga 105

<210> 16

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcaaatatg gaaacatacg tgaataaact tcacgagggc tccacataca cagctgctgt 60

tcaatacaat gtcctagaaa aagacgatga tcctgcatc 99

<210> 17

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtatggttgc aaagctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc 60

ctgcggctta atttgactca aca 83

Claims

1.引物探针组合，其包括：

甲型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

甲型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示；

甲型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

乙型流感病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

乙型流感病毒的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

乙型流感病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:6所示；

呼吸道合胞病毒的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:7所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物1，其核酸序列如SEQ ID NO:8所示；

呼吸道合胞病毒的反向引物2，其核酸序列如SEQ ID NO:9所示；

呼吸道合胞病毒的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

2.同时检测检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的引物探针组合的反应液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液中还包括内标的引物和探针；所述内标的序列为SEQ ID NO:17；

内标的正向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:11所示；

内标的反向引物，其核酸序列如SEQ ID NO:12所示；

内标的探针，其核酸序列如SEQ ID NO:13所示。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，

如SEQ ID NO.3所示探针的5’端连接FAM荧光基团；

如SEQ ID NO.6所示探针的5’端连接ROX荧光基团；

如SEQ ID NO.10所示探针的5’端连接CY5荧光基团；

如SEQ ID NO.13所示探针的5’端连接HEX荧光基团。

5.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液中还包括：Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰和水。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品和阳性质控品；所述阴性质控品为无菌水；所述阳性质控品为人工合成的浓度1×10⁵Copies/ml的装甲RNA。

7.非诊断目的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于，以权利要求2～8任一项所述的试剂盒对样品进行检测，根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。

8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品为咽拭子、鼻拭子或环境样品；扩增的体系包括：25μL反应液和5μL样品提取物；

所述反应液包括：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的程序包括：