CN114085928B

CN114085928B - 一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系

Info

Publication number: CN114085928B
Application number: CN202210058335.3A
Authority: CN
Inventors: 李小锋; 李晨阳; 高小龙
Original assignee: Guangdong Hexin Health Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Hexin Health Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2042-01-19
Also published as: WO2023137794A1; CN114085928A

Abstract

本发明公开了一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系，所述体系中的引物探针是基于双向ARMS PCR技术设计，靶向Omicron突变株的6个突变位点进行检测，对Omicron突变株的检测准确度提高到近100%，最低检测限可低至200copies/mL。具有很好的灵敏性和特异性；可在30分钟内完成整个流程，操作简单、快速、灵敏，对硬件要求低，成本较低，有利于技术制备成试剂盒用于广泛推广。并且将这种检测体系做成冻干形态，进一步提高检测灵敏度。为新型冠状病毒Omicron突变株的快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

Description

一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系

技术领域

本发明属于病毒快速检测试剂领域，具体涉及用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系。

背景技术

2021年11月26日，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将奥密克戎（Omicron，B.1.1.529）列为值得关注的新冠变种（Variant of concern，VOC），VOC为最危险变异株，提示它可能具有很高的传播能力或很强的致病性，并且可能降低目前药物和新冠疫苗的有效性。这一变异株受到全球广泛关注。因此，需要迫切了解Omicron的起源和特征，明确现有药物和新冠疫苗对其的保护性，以便为阻断Omicron的传播和治疗该变异株引起的COVID-19提供理论基础。

根据WHO的报告，第一个已知的Omicron感染病例可追溯到2021年11月9日收集的标本，第一个Omicron序列从11月11日在博茨瓦纳收集的标本中获得。南非流行病学数据显示，Beta变异株疫情爆发至100天左右时，测序病例中Beta变异株占每日总测序量的50%左右；在同样的时间周期Delta变异株占每日总测序量的80%左右；而Omicron在爆发后的25天内达到每日总测序量的90%左右。这些数据表明，Omicron变异株可能比Beta和Delta具有更高的传染性。

但是目前，由于这种突变类型是最近被发现，因此市面还没有相关对Omicron分型检测试剂盒的批准。而现有的检测试剂不能做到对Omicron分型检测，甚至可能面对Omicron样本，检测试剂会失效，并由此导致假阴性检测结果。而这对疾病的诊断，防疫政策的成效都可能是极大地挑战。

现有的新冠核酸检测试剂都不能做到对Omicron突变株的快速检测并分型，甚至有可能会对Omicron突变株样本漏检并导致假阴性结果。同时目前所有新冠检测试剂都为液体形态，液体形态在储存，运输及使用过程都极大地延长了单一样本的检测时间。

发明内容

本发明的第一个目的，在于提供一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型检测的引物探针组合。

本发明的第二个目的，在于提供上述引物探针组合在制备新冠病毒新型冠状病毒Omicron突变株分型检测产品中的应用。

本发明的第三个目的，在于提供一种试剂盒。

本发明的第四个目的，在于提供一种新型冠状病毒Omicron突变株分型的检测方法。

本发明的第五个目的，在于提供本发明第一方面所述引物的设计方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供用于新型冠状病毒Omicron突变株检测的引物探针组合，包括引物探针组A、引物探针组B和引物探针组C中的至少一种；

所述引物探针组A的序列如下所示：

F1：5'-ACAAACTTGTGCCCTTTTCA-3'；

R1：5'-ACACTTAAAAGTGGAAAATTG-3'；

P1：5'-CGCCACCAGA TTTGCATCTG TTTATG-3'；

所述引物探针组B的序列如下所示：

F2：5'-CTGAAATCTATCAGGCCGGTGA-3'；

R2：5'-ACCAACACCATTAGTGGGAC-3'；

P2：5'-GTAATGGTGT TGAAGGTTTT AATTGT-3'；

所述引物探针组C的序列如下所示：

F3：5'-CTGTT TAATAGGGGCTGAGT-3'；

R3：5'-TACGTGCCCGCCGAGGAGTC-3'；

P3：5'-ATGAGTGTGA CATACCCATTGGTGCA-3'。

其中引物探针组A针对新型冠状病毒Omicron突变株的S基因上的339G>D和373S>P突变位点；引物探针组B针对新型冠状病毒Omicron突变株的S基因上的477S>N和498Q>R突变位点；引物探针组C针对新型冠状病毒Omicron突变株的S基因上的655H>Y和679N>K突变位点。

在本发明的一些实施方式中，所述探针组合还包括新型冠状病毒通用引物探针。

其中，引物探针组A、引物探针组B、引物探针组C任一种和通用引物探针也可以实现新型冠状病毒Omicron突变株分型检测，但当引物探针组A、引物探针组B、引物探针组C共同使用时，同时靶向六个突变位点，可极大提高对突变株分型的准确性。

在本发明的一些实施方式中，所述新型冠状病毒通用引物探针的序列为：

引物F4：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'；

引物R4：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'；

探针P4：5'-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3'。

在本发明的一些实施方式中，所述探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，所述探针的5'端标记的荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY5、TET、JOE、TAMRA、HEX或CY3；其中P1、P2、P3、P4的荧光报告基团各不相同。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针的3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、TAMRA、ECLIPSE或DABCYL。

本发明的第二方面，提供本发明第一方面所述引物探针组合在制备新冠病毒新型冠状病毒Omicron突变株检测产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述检测产品为试剂盒、芯片等。

本发明的第三方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一方面所述的引物探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒包括扩增反应液、阳性对照和稀释液；所述扩增反应液包括Mg²⁺、DNA聚合酶，MMLV反转录酶、dNTPs和本发明第一方面所述的引物探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应液为干粉化，即将其制作为冻干粉形式，方便携带；但需要注意的是，其扩增反应液的形式并不影响检测效果，也可以作为液态形式。

在本发明的一些实施方式中，所述扩增反应液为干粉化时，还包含冻干保护液。

在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护液包含1～2%海藻糖，0.5～1.5%甘露醇，0.7～1.1%氯化钠，0.1～0.3%肌醇，0.65～0.85mg/mL PEG和0.1～0.3mg/mL Tween 80。

在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护液包含2%海藻糖，1%甘露醇，0.9%氯化钠，0.2%肌醇，0.75mg/mL PEG和0.2mg/mL Tween 80。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含封闭液；所述封闭液优选为石蜡油。

本发明的第四方面，提供一种新型冠状病毒Omicron突变株分型的检测方法，包含以下步骤：

（1）提取待检样本的DNA；

（2）采用本发明第三方面所述的试剂盒，然后进行实时荧光定量PCR扩增；

（3）收集荧光信号，通过荧光信号判断是否存在突变；

该方法不用于疾病的诊断。

在本发明的一些实施方式中，所述判断标准为：

在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR的程序为：47～49℃ 4～6min；91～93℃ 18～22 sec；91～93℃ 0.5～1.5 sec，53～57℃ 13～16 sec，共39～41个循环。

本发明还提出一种本发明第一方面所述引物的设计方法：分别以两个突变位点作为上游和下游的3'端进行引物的设计。这样一条作为正向引物，一条作为反向引物，正反向引物的3'端都位于突变位点并与突变型序列一致，与野生型序列不一致，这样可以保证对突变型扩增有效，而对野生型扩增受阻，以此做到根据扩增信号有无区分突变型和野生型。

在本发明的一些实施方式中，其中两个突变位点距离在80-150bp，在这个距离是荧光PCR合适的扩增区段，常规的Taq酶扩增效率一般为每分钟500-1000bp，而荧光PCR需要在较短时间进行多达40个循环并收集荧光信号，通常的引物延伸时间设定在30秒以内，因此，两个突变位点距离在80-150bp是合适的产物长度，一般引物长度为20bp，探针长度为26bp，引物与探针序列不能重叠，引物包括引物探针本身的长度，以及引物与探针的间隔，因此序列至少需要80bp长度。

而如果序列过长，有以下几方面弊端：

1、可能导致扩增效率差，PCR片段不能完全扩增并影响下一轮PCR扩增；

2、片段过长，导致每一循环延伸时间长，由于Taq酶在高温下会逐渐失活，因此较长的PCR时间会加快Taq酶的失活速率，以致不能保证在PCR后期Taq酶具有足够的酶活性；

3、PCR产物片段过长提高了引物和产物片段的非特异结合，例如引物二聚体，发夹结构等，这也会消耗PCR体系中引物，导致引物浓度降低，并导致扩增效率降低。

其中，正向引物、反向引物的设计遵循常规的ARMS PCR引物设计方法，引物的长度，Tm值，GC含量，解离常数等遵循常规的引物设计要求无特别要求。在此原则下，其中引物的3'端倒数第二位碱基可以人为进行序列突变并筛选，以保证引物与野生型序列在3′端具有两个碱基不匹配，以提高靶标扩增的特异性。

其中主要针对多突变位点的检测，可以同时对两个突变位点进行检测，其并不局限于Omicron突变株，也包括delta，gamma，beta，Mu，lambda等以及在未来可能出现的其它新冠突变株，以及其它具有多突变位点的病原体，优选为Omicron突变株。

这种引物设计方法基于ARMS PCR技术并进行了一定的改进，具有以下优点：

（1）同一靶标将突变位点的检测数量提高1倍，通过上下游引物的不同涵盖，一个靶标可以同时检测两个突变位点。

（2）基于第（1）条原理，采用上下游引物的Dual ARMS PCR设计，可以极大提高PCR反应特异性；因为对于ARMS PCR，特异性PCR反应是此技术方法有效并发挥作用的最重要因素。

本发明中的引物设计方法Dual ARMS PCR类似于给PCR反应中特异性能力加了双重保险。假设单向ARMS PCR的特异性为80%，那双向Dual ARMS PCR的特异性为1-（1-80%）×（1-80%）=96%。如果单向ARMS PCR特异性为90%，则双向Dual ARMS PCR的特异性则可以提高到99%。

本发明的有益效果是：

本发明提出一种对Omicron突变株核酸快速检测并分型的引物探针组合和检测体系。所述引物探针是基于Dual ARMS PCR技术设计，可以靶向Omicron突变株的6个突变位点进行检测，对Omicron突变株的检测准确度提高到近100%，最低检测限可低至200copies/mL。具有很好的灵敏性和特异性。可在30分钟内完成从样本采集，核酸提取，PCR检测，Omicron分型结果判读全流程。操作简单、快速、灵敏，对硬件要求低，成本较低，有利于技术制备成试剂盒用于广泛推广。

并且将这种检测体系做成冻干形态，在对试剂提前分装到八连管（PCR反应管）后对试剂进行冻干，可以使得后面在试剂使用过程中免去了分液的步骤，大大缩短检测时间，同时又由于复融可以直接用样本处理后核酸复融，因此可以进一步提高检测灵敏度。为新型冠状病毒Omicron突变株的快速检测筛查提供有效的技术手段，具有重要意义。

本发明还提供一种引物设计方法：分别以两个突变位点作为上游和下游的3'端进行引物的设计。这样一条作为正向引物，一条作为反向引物，可以从正向和反向做到对野生型目的核酸的扩增阻滞，可以根据扩增信号有无区分突变型和野生型，提高对突变型的检测准确性。其基于ARMS PCR技术并进行了一定的改进，同一靶标将突变位点的检测数量提高1倍，通过上下游引物的不同涵盖，一个靶标可以同时检测两个突变位点，大大提高了检测特异性，可以用于多突变位点的检测。

附图说明

图1为扩增反应液冻干粉。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的Omicron快速鉴定并分型的检测引物、体系和方法是Dual ARMS PCR，Dual ARMS PCR是基于ARMS PCR所开发的。其中突变扩增系统（amplification refractorymutation system，ARMS）又称等位基因特异性扩增法（allele specific amplification，ASA），是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计不同引物，其3'端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。此种方法在目前的技术应用中都是基于自然界中常见的单碱基突变类型并在引物的上游或下游设计引物进行检测。

本发明开发的Dual ARMS PCR，基于Omicron突变位点繁杂，不同突变位点接近，并处于荧光PCR合理的靶标设计长度（100bp左右），通过筛选在一个合理的突变位点距离，其中两个突变位点距离在80-150bp之间，保证荧光PCR的扩增效率，分别以两个突变位点作为上游和下游的3'端进行引物的设计。

这种设计方法具有几方面优点：

（2）基于第（1）部分原理，采用上下游引物的Dual ARMS PCR设计，可以极大提高PCR反应特异性，因为对于ARMS PCR，特异性PCR反应是此技术方法有效并发挥作用的最重要因素。

本发明中的Dual ARMS PCR类似于给PCR反应中特异性能力加了双重保险。假设单向ARMS PCR的特异性为80%，那双向Dual ARMS PCR的特异性为1-（1-80%）×（1-80%）=96%。如果单向ARMS PCR特异性为90%，则双向Dual ARMS PCR的特异性则可以提高到99%。

实施例1 Omicron突变株荧光PCR检测引物探针设计

本实施例是在申请人开发的Dual ARMS PCR设计方法中通过大量生物信息学分析并筛选符合要求的突变位点，针对这些突变位点设计针对Omicron突变株核酸分型检测用的引物和探针。

首先，需要对Omicron进行基因的突变位点分析，包括特异性和保守性。从GISAID数据库全基因序列下载近三个月所有上传的VOC delta GK （B.1.617.2），VUM GH/490R（B.1.640），VOC Alpha GRY （B.1.1.7），VOC beta GH （B.1.351），VOC gamma GR （P.1），VOC Lambda GR （C.37），VOC Mu GH （B.1.621）以及VOC Omicron GRA （B.1.1.529），包括BA.1和BA.2两个分支的所有序列。然后分别以Omicron不同突变位点为靶标，与以上所有序列进行Blast全序列比对分析，统计分析突变位点在不同突变株序列的发生百分比。统计数据如表1所示。

表1 突变位点在不同突变株序列的发生百分比

突变株	序列数量	339G>D	373S>P	477S>N	498Q>R	655H>Y	679N>K
								VOC delta GK （B.1.617.2）	2384458	0%	0%	0.002%	0%	0.002%	0%
VUM GH/490R （B.1.640）	351	0%	0%	0%	0%	0%	0%
								VOC Alpha GRY （B.1.1.7）	37858	0%	0%	0.01%	0%	0.01%	0%
VOC beta GH （B.1.351）	4233	0%	0%	0%	0%	0%	0%
								VOC gamma GR （P.1）	27136	0%	0%	0%	0%	78%	0%
Lambda GR （C.37）	2271	0%	0%	0%	0%	0%	0%
								VOC Mu GH （B.1.621）	5713	0%	0%	0%	0%	0%	0%
VOC Omicron GRA （B.1.1.529）	33123	98.2%	99.3%	95.9%	98.3%	100%	99.1%

从分析可知，所筛选的6个突变点，在Omicron突变株及BA.1和BA.2两个分支上的保守型较好，突变点在所有株上的发生率都超过95%以上，并且可以有效覆盖Omicron的BA.1和BA.2分支。同时所筛选的6个突变点与VOC delta GK （B.1.617.2），VUM GH/490R（B.1.640），VOC Alpha GRY （B.1.1.7），VOC beta GH （B.1.351），VOC gamma GR （P.1），VOC Lambda GR （C.37），VOC Mu GH （B.1.621）等都没有比对同源性，表明了所筛选位点的特异性较好，所有突变位点为Omicron所特有。结果也表明655H>Y突变位点在VOC gamma GR（P.1）上具有较大的发生概率，但是这不影响检测Omicron的准确性，因为本实施例的引物设计是从6个突变位点去对Omicron进行鉴定分型。

在前面序列分析后，申请人确定了6个突变位点去对Omicron进行鉴定分型。从分析中可以确定6个突变位点，除去655H>Y位点，其它5个位点都为Omicron所特有。同时对6个位点的检测，可以理论上基本做到100%对Omicron做到分型准确。下面用人工构造样本对此方案进行验证。

实验所用VOC delta GK （B.1.617.2），VUM GH/490R （B.1.640），VOC Alpha GRY（B.1.1.7），VOC beta GH （B.1.351），VOC gamma GR （P.1），VOC Lambda GR （C.37），VOCMu GH （B.1.621）样本都采用前期公司与中国卫健委临床检验中心合作，由临检中心提供的假病毒颗粒，Omicron样本为人工构建质粒并由申请人构建假病毒颗粒。其中假病毒的核苷酸序列如下所示：

tcaaacttctaactttagagtccaaccaacagaatctattgttagatttcctaatattacaaacttgtgcccttttgatgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcaccattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtaacaaaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacgatcatatagtttccgacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttcttttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctttatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcctacttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaataggggctgaatatgtcaacaactcatatgagtgtgacatacccattggtgcaggtatatgcgctagttatcagactcagactaagtctcctcggcgggcacgtagtgtagctagtcaatccatcat（SEQ ID NO.13）。

分别以6个突变位点单独设计引物，配置引物的单重和多重检测体系，并测试所有假病毒样本。实验结果如表2所示。

表2 以6个突变位点为靶标的检测结果

由结果可知，不同突变位点单独设计ARMS PCR引物并检测不同突变类型样本时，都没有非常高的特异性，对于Omicron以外其它突变株，也会有微弱的扩增曲线，导致结果有CT值，这导致ARMS PCR特异性较差，而将两种突变组合到一起进行Dual ARMS PCR时，则未出现非特异扩增结果，这表明了Dual ARMS PCR具有较高特异性。这种特性，使得本检测体系对Omicron突变株的检测准确度提高到近乎100%。

同时，申请人用3个这样的双靶点同时对Omicron突变株样本进行多重PCR的分型鉴定，则更进一步可以提高对突变株分型检测的准确性。

基于此，以上述3个双靶点为基础，设计了一组用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的引物；包括新型冠状病毒2019-nCoV通检引物对及探针、Omicron突变株特异性检测靶点1 Dual ARMS PCR引物对及探针、Omicron突变株特异性检测靶点2 Dual ARMS PCR引物对及探针、Omicron突变株特异性检测靶点3 Dual ARMS PCR引物对及探针。

其中每个靶点涵盖Omicron所特有的两个突变位点：

Omicron突变株特异性检测靶点1包括S:p.339G>D上游引物和S:p.373S>P下游引物。

Omicron突变株特异性检测靶点2包括S:p.477S>N上游引物和S:p.498Q>R下游引物。

Omicron突变株特异性检测靶点3包括S:p.655H>Y上游引物和S:p.679N>K下游引物。

所述Omicron突变株特异性检测靶点1 Dual ARMS PCR引物对及探针（引物探针组A）如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3，和/或是SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示序列的相似序列或互补序列：

F1：5'-acaaacttgtgcccttttCa-3'（SEQ ID NO.1）；

R1：5'-acacttaaaagtggaaaatTg-3'（SEQ ID NO.2）；

P1：5'-VIC-cgccaccagatttgcatctgtttatg-BHQ1-3'（SEQ ID NO.3）；

所述Omicron突变株特异性检测靶点2 Dual ARMS PCR引物对及探针（引物探针组B）如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6，和/或是SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6所示序列的相似序列或互补序列：

F2：5'-ctgaaatctatcaggccggtGa-3'（SEQ ID NO.4）；

P2：5'-accaacaccattagtgggAc-3'（SEQ ID NO.5）；

R2：5'-ROX-gtaatggtgttgaaggttttaattgt-BHQ2-3'（SEQ ID NO.6）；

所述Omicron突变株特异性检测靶点3 Dual ARMS PCR引物对及探针（引物探针组C）如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9，和/或是SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9所示序列的相似序列或互补序列：

F3：5'-ctgtt taataggggctgaGt-3'（SEQ ID NO.7）；

P3：5'-tacgtgcccgccgaggagTc-3'（SEQ ID NO.8）；

R3：5'-CY5-atgagtgtgacatacccattggtgca-BHQ2-3'（SEQ ID NO.9）；

新型冠状病毒2019-nCoV扩增通用引物对及探针的序列如SEQ ID NO.10~SEQ IDNO.12所示，和/或是SEQ ID NO.10~SEQ ID NO.12所示序列的相似序列或互补序列：

F4：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'（SEQ ID NO.10）；

R4：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'（SEQ ID NO.11）；

P4：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'（SEQ ID NO.12）。

实施例2 一种荧光PCR检测体系

所述PCR检测冻干体系包括扩增反应液（冻干粉）、阳性对照和稀释液；所述扩增反应液包括Mg²⁺、DNA聚合酶，MMLV反转录酶，冻干保护液及dNTPs、实施例1中的对新型冠状病毒及Omicron突变株核酸检测用的引物和探针；同时配合HC800检测仪器，本检测体系还需要石蜡油。其中冻干粉制备配方如表3所示（1人份用量）。

表3 PCR检测冻干扩增反应液配方

其中冻干保护液包含2%海藻糖，1%甘露醇，0.9%氯化钠，0.2%肌醇，0.75mg/mL PEG和0.2mg/mL Tween 80。

将分装好的2019-nCoV Omicron反应液直接放至冻干机中按如下程序进行冻干，冻干程序见表4。冻干结束后，取出反应液，及时盖八联管盖子（房间湿度控制在30%以下）。包装好的反应液需要贴上贴签，再加一袋干燥剂将其装进铝箔袋中，封好铝箔袋。

表4 PCR扩增反应液（冻干粉）冻干程序

冻干后的PCR扩增反应液冻干粉如图1所示。

一种试剂盒，包含上述PCR检测体系。

试剂盒的使用方法如下：

1、核酸的提取和纯化：

为保证快速的样本处理及检测分型，本体系可搭配使用广东和信健康科技有限公司生产的样本释放剂对样本进行快速核酸提取，及UltraFast QPCR实时荧光定量PCR仪HC800，可在28分钟内完成对样本的PCR检测，分型并结果判读。

本检测系统检测样本为咽拭子，将采集样本后的拭子头浸没于含有样本释放剂的滴管里，搅动拭子头并用手指挤压拭子头至少5次，尽可能使更多的样本充分释放出来，然后丢弃拭子，拧紧管盖，把滴管上下颠倒混匀5次，甩动滴管1次，室温静置2～5min，滴管里的液体即为待测样本核酸。请严格按照样本释放剂使用说明书操作。

2、PCR检测：

（1）试剂准备&RNA样本加样：

将八联管对称放进掌上离心机（注意平衡），离心3秒，将管内冻干粉甩至管底，以免打开盖子时冻干粉飞出。剪下所需要的管数，其余暂放2～8℃冰箱保存。然后打开PCR管盖，逐孔垂直滴加1滴（约20μL）待测样本核酸；然后，往每管中垂直滴加1滴石蜡油(加液时，不要碰触滴管)，用盖子盖紧PCR反应管，上下颠倒5次混匀，然后把8联管放置掌上离心机离心10秒，使石蜡油完全在反应混合液上层（如果管中有气泡，轻弹管壁去除气泡，然后再次离心）。

（2）仪器设置：

根据UltraFast QPCR HC800的用户手册进行项目和程序设置；将反应管置于仪器中，每个样品同时勾选FAM （激发波长：450-490nm，发射波长：510-530nm）；VIC （激发波长：515-535nm，发射波长：560-580nm）；ROX （激发波长：560-590nm，发射波长：610-650nm）；CY5（激发波长：620-650nm；发射波长：675-690nm）四个通道。设置检测程序，然后运行。具体程序设置见表5。

表5 PCR反应条件

（3）检验结果分析

1. 反应结束后，用仪器自带打印机打印实验结果。

2. 记录仪器自动分析计算出的样本Ct值。

3. 进行结果判定，具体标准见表6。

表6 结果判定标准

效果例

1、参考品验证：由于目前国内只有极少几例Omicron病例，因此未有临床数据。根据实验室构建Omicron突变株假病毒，制备不同的6个Omicron弱阳性假病毒样本和delta，gamma，beta，Mu，lambda及新冠野生型等阴性参考品做分析性能研究。实施例2中的检测体系对新冠阳性及Omicron突变株阳性参考品符合率都为100%。阴性参考品符合率（包括除Omicron变异株的其它突变型及新冠野生型）为100%。结果如表7所示。

表7 参考品检测

2、重复性：批内精密度：检测弱阳性和中阳性参考品各10次，Ct值的变异系数（CV，%）≤5%，重复性好。结果如表8所示。

表8 参考品精密度检测

3、灵敏度：最低检测限：本检测体系对新冠病毒及Omicron突变株的灵敏度参考品进行检测，两者最低检测限都为200copies/mL。检测结果如表9所示。

表9 检测体系的LOD验证

4、特异性：

a）本实施例2中的检测体系可特异性检出新型冠状病毒2019-nCoV并对Omicron突变株准确分型。

b）与以下临床常见其它各类病原体无交叉反应：冠状病毒（229E、OC43、HKU1、NL63）、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒、副流感病毒（PIV1、PIV2、PIV3、PIV4）、呼吸道合胞病毒（RSVA、RSVB）、麻疹病毒（MV）、腮腺炎病毒、人巨细胞病毒、腺病毒（1、2、3、4、5、7、55）、甲型流感病毒（2009H1N1、H1N1、H3N2、H5N1、H7N9）、乙型流感病毒（Victoria系、Yamagata系）、肠道病毒（CA16、EV71、EV70、CB5、CA24）、鼻病毒（A组，B组，C组）、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、人偏肺病毒、轮状病毒、诺如病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、新型隐球菌、百日咳杆菌，人基因组DNA；其中采用直接对相应病原体培养物或假病毒提取核酸后检测，具体结果见表10。

表10 交叉干扰检测结果

C）干扰物质：以下常见干扰物质不影响检测体系检测：5%血液、1%粘蛋白、0.4mg/mL肾上腺素（苯福林）、0.3mg/mL羟甲唑啉、36mg/mL含防腐剂的氯化钠、0.2mg/mL倍氯美松、0.1mg/mL氟尼缩松、0.2mg/mL地塞米松、0.22mg/mL曲安奈德、0.128mg/mL布地奈德、0.2mg/mL莫米松、0.2mg/mL氟替卡松、0.18mg/L盐酸组胺、10mg/mL扎那米韦、6.42mg/L利巴韦林、2.14mg/L奥司他韦、4.29mg/L帕拉米韦、0.71 mg/mL a-干扰素、0.57mg/mL 洛匹那韦、0.57mg/mL 利托那韦、0.43mg/mL 阿比多尔、4.38mg/L妥布霉素、0.54mg/mL左氧氟沙星、0.36mg/mL阿奇霉素、750mg/L头孢曲松、1.07mg/mL美罗培南；采用弱阳性样本添加干扰物方式制备样本检测，具体结果见表11。

表11 外源干扰物检测结果

综上所述，可以看出，本实施例2中的检测体系具有可以靶向新型冠状病毒Omicron突变株的6个突变位点进行检测，对Omicron突变株的检测准确度提高到近100%，最低检测限可低至200copies/mL。具有很好的灵敏性和特异性。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东和信健康科技有限公司

<120> 一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaaacttgt gcccttttca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acacttaaaa gtggaaaatt g 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccaccaga tttgcatctg tttatg 26

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgaaatcta tcaggccggt ga 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accaacacca ttagtgggac 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaatggtgt tgaaggtttt aattgt 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgtttaata ggggctgagt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tacgtgcccg ccgaggagtc 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgagtgtga catacccatt ggtgca 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 13

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcaaacttct aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac 60

aaacttgtgc ccttttgatg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg 120

gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcacc 180

attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac 240

taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg 300

gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt 360

tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta 420

tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta 480

tcaggccggt aacaaacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttacg 540

atcatatagt ttccgaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact 600

ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt 660

ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac 720

tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac 780

tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg 840

tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca 900

ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg 960

gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc 1020

tgaatatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag 1080

ttatcagact cagactaagt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat 1140

Claims

1.用于新型冠状病毒Omicron突变株分型检测的引物探针组合，包括引物探针组A、引物探针组B和引物探针组C和新型冠状病毒通用引物探针；

所述引物探针组A的序列如下所示：

F1：5'-acaaacttgtgcccttttCa-3'；

R1：5'-acacttaaaagtggaaaatTg-3'；

P1：5'-cgccaccagatttgcatctgtttatg-3'；

所述引物探针组B的序列如下所示：

F2：5'-ctgaaatctatcaggccggtGa-3'；

R2：5'-accaacaccattagtgggAc-3'；

P2：5'-gtaatggtgttgaaggttttaattgt-3'；

所述引物探针组C的序列如下所示：

F3：5'-ctgtttaataggggctgaGt-3'；

R3：5'-tacgtgcccgccgaggagTc-3'；

P3：5'-atgagtgtgacatacccattggtgca-3'；

所述新型冠状病毒通用引物探针的序列为：

引物F4：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'；

引物R4：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'；

探针P4：5'-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3'。

2.权利要求1所述引物探针组合在制备新冠病毒新型冠状病毒Omicron突变株检测产品中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增反应液、阳性对照和稀释液；所述扩增反应液包括Mg²⁺、DNA聚合酶，MMLV反转录酶、dNTPs、新型冠状病毒通用引物探针、引物探针组A、引物探针组B和引物探针组C。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液为冻干粉，还包含冻干保护液。

6.一种新型冠状病毒Omicron突变株分型的检测方法，包含以下步骤：

（1）提取待检样本的DNA；

（2）采用权利要求3～5任一项所述的试剂盒，然后进行实时荧光定量PCR扩增；

（3）收集荧光信号，通过荧光信号判断是否存在突变；

该方法不用于疾病的诊断；

判断标准如下：

。