CN113846191A - 用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学检测领域，具体涉及用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用。本发明设计了四组引物探针，采用常用的TaqMan‑MGB探针法对新型冠状病毒进行检测，可用于检测新型冠状病毒野生型、新型冠状病毒变异株、新型冠状病毒B.1.617亚型变异株以及新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株。假病毒测试结果表明，试剂灵敏度可达到500copies/mL。10份健康志愿者和4份常见其他呼吸道病原体检测均没有非特异性扩增，引物探针组合及试剂特异性较好。

Description

用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用
技术领域
本发明属于医学检测领域，具体涉及用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒SARS-CoV-2，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。据世界卫生组织官网显示，目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，其中，新型冠状病毒Delta变异毒株（B.1.617.2，最早发现于印度）已传播至全球90多个国家，Delta变异毒株可能成为全球主流传播毒株。新型冠状病毒Delta变异毒株具有以下特点：
(1)传播力增强、潜伏期短：Delta变异毒株是目前WHO已经确定的几个“须关切变异株”中传播能力最强的，是在英国发现的Alpha变异株传播能力的1.23倍。
(2)病毒载量高、传染性强：数据显示，患者体内的病毒载量比普通株要整整高出100倍，传染性比普通株高1倍，核酸转阴所需要的时间较长，治疗周期长。
(3)致病力强、病情发展快：Delta变异毒株的致病力并没有随着传播力增强而减弱，患者发病以后转为重型、危重型的比例比以往高，而且转为重型、危重型的时间提前，据部分国家研究发现，感染Delta变异毒株的患者可能出现的症状还包括胃痛、恶心、呕吐、食欲减退、听力损失和关节疼痛等，一些患者会出现微血栓或小血栓，严重时甚至会组织死亡。
(4)接种疫苗仍然有效：数据显示，未接种过疫苗的人转为重症或者发生重症的比例显著高于接种过疫苗的人，表明接种疫苗对变异毒株仍然有免疫作用。但目前，Delta变异毒株进一步突变形成Delta plus（Delta+）变异毒株，传播能力更强，且研究认为该突变可导致免疫逃逸。
新型冠状病毒变异株相对于原始毒株而言，存在基因突变，这种突变实际上就是不同变异株基因组序列中单个碱基的变异，即单核苷酸多态性（SNP），不同变异毒株的检测就是对特异性SNP进行鉴定，从而实现对不同变异株的区分。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致，而只有一个碱基不同的现象，即SNP，它包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。
SNP检测方法众多，大约有20多种。基因测序是基因突变鉴定标准技术，但存在鉴定时间周期长，实验操作复杂，实验成本等缺点。ARMS-Taqman技术即突变阻滞扩增系统，又名等位基因特异PCR，基本原理为 TaqDNA聚合酶缺少3-5'外切酶活性。在一定条件下，PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。ARMS的特异性引物设计完成后，还需要一对等位基因特异性荧光共振能量转移的TaqMan探针。由于 ARMS所用的引物是从一段序列在 3'末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出来的、能够区分单个位点等位基因的引物，此方法引物设计及筛选工作量大，且结果需要通过非变异引物扩增非变异核酸的扩增曲线与变异核酸的扩增曲线的差异来判读，误差较大。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测新型冠状病毒的引物和探针。
本发明的再一目的在于提供上述引物和探针的应用。
本发明的再一目的在于提供检测新型冠状病毒的试剂盒。
根据本发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒的引物和探针，所述引物和探针包括以下各组的至少一组：
第一组为检测新型冠状病毒（包括野生株和变异株）的特异性引物、探针组合，以ORF1ab基因为靶序列，用于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与其他呼吸道病原体的鉴别诊断；
引物序列一：
SEQ ID NO.1：ORF1ab-Fwd：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：ORF1ab-Rwd：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：
SEQ ID NO.3：ORF1ab-P：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'。
第二组为检测新冠病毒变异株的引物、探针组合，选择变异株共有的S基因中D614G突变位点，可用于新冠病毒（SARS-CoV-2）野生株和变异株的鉴别诊断，
引物序列二：
SEQ ID NO.4： D614G-Fwd： 5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5： ORF1ab-Rwd： 5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：
SEQ ID NO.6：D614G-M-P： 5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'。
第三组为检测新冠病毒B.1.617变异株三种亚型的引物、探针组合，选择B.1.617变异株三种亚型共有的P681R突变位点，避开B.1.427/429变异株同样具有的L452R突变位点，从而可用于B.1.617变异株与其他变异株（B.1.1.7、B.1.351、P.1、P.2、B.1.427/429、B.1.525、B.1.526、C.37、B.1.620、B.1.621变异株）的鉴别诊断，
引物序列三：
SEQ ID NO.7：P681-Fwd：5'-GTGCAGGTATATGCGCTAGTTA-3'，
SEQ ID NO.8：P681-Rwd：5'-GTAGGCAATGATGGATTGACTAG-3'；
探针序列三：
SEQ ID NO.9：P681R-M-P：5'-ACTAATTCTCGTCGGCGG-3'。
第四组为检测新冠病毒B.1.617.2（Delta）亚型变异株的引物、探针组合，选择B.1.617.2亚型变异株特异性的V382L突变位点，可用于B.1.617变异株内部B.1.617.2亚型与B.1.617.1、B.1.617.3亚型的鉴别诊断，避开T19R、T478R等突变位点可能存在的假阴性结果，
引物序列四：
SEQ ID NO.10：V382L-Fwd：5'-ATTCCGCATCATTTTCCACT-3'，
SEQ ID NO.11：V382L-Rwd：5'-GCATAGACATTAGTAAAGCAGAGATC-3'；
探针序列四：
SEQ ID NO.12：V382L-W-P：5'-TGTTATGGAYTGTCTCCT-3'。
根据本发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒变异株的引物和探针，所述引物和探针包括：
引物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'。
根据本发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒B.1.617变异株的引物和探针，所述引物和探针包括：
引物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'；以及，
引物序列三：SEQ ID NO.7：5'-GTGCAGGTATATGCGCTAGTTA-3'，
SEQ ID NO.8：5'-GTAGGCAATGATGGATTGACTAG-3'；
探针序列三：SEQ ID NO.9：5'-ACTAATTCTCGTCGGCGG-3'。
根据发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒B.1.617.2变异株的引物和探针，所述引物和探针包括：
物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'；以及，
引物序列三：SEQ ID NO.7：5'-GTGCAGGTATATGCGCTAGTTA-3'，
SEQ ID NO.8：5'-GTAGGCAATGATGGATTGACTAG-3'；
探针序列三：SEQ ID NO.9：5'-ACTAATTCTCGTCGGCGG-3'；以及
引物序列四：SEQ ID NO.10：5'-ATTCCGCATCATTTTCCACT-3'，
SEQ ID NO.11：5-GCATAGACATTAGTAAAGCAGAGATC-3'；
探针序列四：SEQ ID NO.12：5'-TGTTATGGAYTGTCTCCT-3'。
为了监控标本采集情况及核酸提取效果，本发明还提供人源性内参基因的特异性引物、探针组合，
SEQ ID NO.13：Human IC-F：5'-ATGGACACGCTCCCCTGAC-3',
SEQ ID NO.14：Human IC-R：5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAAA-3'；
SEQ ID NO.15：Human IC-P：5'-GCAATGCCTCCTGCACCACCAA-3'。
其中，上述探针的5’端菌标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，荧光基团可选ROX、FAM、VIC、HEX、JOE、CY5、CY5.5等，若同时使用多组引物探针组，探针间使用不同的荧光基团；淬灭基团可选TAMRA、BHQ（BHQ1、BHQ2、BHQ3）、MGB等，本发明的优选方案为MGB、BHQ1。
具体的，本发明以同时使用到五种探针为例：
ORF1ab-P：5' FAM-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-MGB 3' ；不限于FAM标记，可以是VIC、HEX、JOE、ROX、CY5、CY5.5等染料，不同于其他四条探针所用荧光基因即可。
D614G-M-P：5' VIC-CTTTATCAGGGTGTTAACT-MGB 3'；不限于VIC标记，可以是FAM、HEX、JOE、ROX、CY5、CY5.5等染料，不同于其他四条探针所用荧光基因即可。
P681R-M-P：5' ROX-ACTAATTCTCGTCGGCGG-MGB 3'，不限于ROX标记，可以是FAM、VIC、HEX、JOE、CY5、CY5.5等染料，不同于其他四条探针所用荧光基因即可。
V382L-W-P：5' CY5-TGTTATGGAYTGTCTCCT-MGB 3' ，不限于CY5标记，可以是FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、CY5.5等染料，不同于其他四条探针所用荧光基因即可。
Human IC-P：5' CY5.5-GCAATGCCTCCTGCACCACCAA-BHQ1 3'，不限于CY5标记，可以是FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、CY5.5等染料，不同于其他四条探针所用荧光基因即可。
同样的，当检测过程中同时使用到四种探针时，任意一种探针所用的荧光染料不同于其他三条探针所用荧光基团即可；当检测过程中同时使用到三种探针时，任意一种探针所用的荧光染料不同于其他两条探针所用荧光基团即可。
根据本发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其包含上述任一项的用于检测新型冠状病毒的引物和探针，其中，
若用检测新型冠状病毒野生株，试剂盒所需探针和引物包括引物探针组一（SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3）和人源性内参基因的特异性引物、探针。
若要检测新型冠状病毒变异株，试剂盒所需探针和引物包括引物探针组一、二和人源性内参基因的特异性引物、探针，即SEQ ID NO.1～6和SEQ ID NO.13～15。
若要检测新型冠状病毒B.1.617变异株，试剂盒所需探针和引物包括引物探针组一、二、三和人源性内参基因的特异性引物、探针，即SEQ ID NO.1～9和SEQ ID NO.13～15。
若要检测新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株（Delta），试剂盒所需探针和引物包括引物探针组一、二、三、四和人源性内参基因的特异性引物、探针，即SEQ ID NO.1～15。
根据本发明具体实施方式的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒除了包含引物和探针外，还包括2×PCR反应缓冲液、扩增酶混合液、阳性对照、阴性对照。
本发明提供的试剂盒可应用于新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻/口咽拭子、痰液、肺泡灌洗液标本，也可用于回顾性验证实验，即对于之前检测阳性的标本，如果想知道病毒是否存在突变，可以使用本发明的引物、探针进行检测，进而检视分析标本的突变情况。
本发明适用的临床标本类型包括鼻/口咽拭子、痰液、肺泡灌洗液。
根据本发明具体实施方式的上述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括使用上述引物和探针对待测样品进行PCR扩增的步骤。
具体的，根据本发明具体实施方式的试剂盒的使用方法，其包括以下步骤：
（1）提取待测样品中的RNA；
（2）用特异性引物、探针对步骤（1）提取的RNA进行PCR扩增；
（3）判断样本中是否存在新型冠状病毒。
其中，新型冠状病毒的结果判断符合以下条件：
（a）质量标准：
SARS-CoV-2阴性对照：所有探针的荧光通道下均无Ct值，或Ct值=45；
SARS-CoV-2阳性对照：人源内参基因的探针通道下，有明显的S型扩增曲线，且Ct值均≤32；且待检基因的荧光通道有扩增曲线；
以上两个条件必须在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。
（b）Ct值和阴、阳性关系结果判定：
实验有效的前提下，阴、阳性结果判断如下表：
Figure 885246DEST_PATH_IMAGE001
本发明所指“待检基因”为新型冠状病毒野生型ORF1ab基因、新型冠状病毒变异株D614G突变位点、新型冠状病毒B.1.617变异株P681R突变位点或新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株V382L位点，其中，
当待检基因为新型冠状病毒野生型ORF1ab基因时，SARS-CoV-2阳性对照的质量标准阳性对照须满足：新型冠状病毒野生型的荧光通道有扩增曲线，而Ct值判定时，新型冠状病毒野生型的荧光通道的Ct≤37，且有典型的S型扩增曲线，方可判断为新型冠状病毒野生型阳性。
当待检基因为新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株V382L突变位点时，SARS-CoV-2阳性对照的质量标准阳性对照须满足：新型冠状病毒野生型、新型冠状病毒变异株、新型冠状病毒B.1.617变异株、新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株的荧光通道均有扩增曲线，而Ct值判定时，新型冠状病毒野生型、新型冠状病毒变异株、新型冠状病毒B.1.617变异株或新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株的荧光通道的Ct均需≤37，且有典型的S型扩增曲线，方可判断为新型冠状病毒B.1.617.2亚型阳性，即Delta变异毒株阳性。
本发明的有益效果：
本发明设计了四组引物探针，采用TaqMan-MGB探针法对新型冠状病毒进行检测，可用于检测新型冠状病毒野生型、新型冠状病毒变异株、新型冠状病毒B.1.617亚型变异株以及新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株。
本发明采用5种荧光标记，结合MGB探针可实现单管五重检PCR扩增，运用逐渐递进、逐步深入的思路，检测多个突变位点，实现对新型冠状病毒B.1.617.2亚型变异株的有效检测，具有检测通量高，成本低、操作简单、结果判读简单易懂的特点。假病毒测试结果表明，试剂灵敏度可达到500copies/mL。10份健康志愿者和4份常见其他呼吸道病原体检测均没有非特异性扩增，引物探针组合及试剂特异性较好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下列实施例涉及到的材料和试剂如下：
1.含有ORF1ab靶基因片段及D614G、P681R、V382L突变位点的假病毒参考品：自制；
2.特异性引物探针：自制；
3.2×PCR反应缓冲液：全称2×Hifair VN MP Buffer，货号13123A；
4.扩增酶混合物：全称Hifair VN Enzyme Mix（UDG plus），货号13123B；
5.DEPC处理水；公司自制；
6.核酸提取试剂：公司自产，型号Ex-DNA/RNA；
7.新型冠状病毒Delta变异株室间质量评价物质：国家卫健委；
8.10份健康志愿者咽拭子：公司员工；
9.其他病原体阳性标本或培养物：灭活肺炎支原体临床标本、灭活肺炎衣原体临床培养物、灭活流感病毒临床标本、灭活呼吸道合胞病毒临床标本，医院惠赠。
实施例 1新型冠状病毒检测方法步骤
1.1 模板制备
（1）新型冠状病毒Delta变异株，直接取200uL使用核酸提取试剂，在全自动核酸提取仪上提取病毒RNA。
（2）新冠假病毒：用PBS缓冲液调整浓度，获得104copies/mL和500copies/mL两个浓度，使用核酸提取试剂，在全自动核酸提取仪上提取假病毒RNA。
（3）健康志愿者咽拭子和其他病原体阳性标本或培养物：取200uL使用核酸提取试剂，在全自动核酸提取仪上提取标本核酸。
1.2 体系配制
Figure 583074DEST_PATH_IMAGE002
1.3 荧光PCR扩增
（1）反应体系（30μL）：PCR扩增反应液20μL+模板DNA溶液10μL。
（2）反应程序：50℃ 15min；95℃.3min；95℃ 10sec、58℃ 30sec，45个循环（58℃时采集荧光信号）。
1.4 结果判断
（1）质控标准
质控检测结果必须符合下述条件：
SARS-CoV-2阴性对照：FAM、VIC、ROX、CY5和CY5.5荧光通道下均无Ct值，或Ct值=45；
SARS-CoV-2阳性对照： FAM、VIC、ROX、CY5荧光通道下，有明显的S型扩增曲线，且Ct值均≤32；CY5.5荧光通道有扩增曲线；以上两个条件必须在一次试验中同时满足，否则，本次实验无效，全部实验应重新进行。
（2）Ct值和阴、阳性关系结果判定
实验有效的前提下，阴、阳性结果判断如下表：
Figure 161692DEST_PATH_IMAGE003
（3）SARS-CoV-2阴阳性、变异株结果判定
Figure 422909DEST_PATH_IMAGE004
实施例 2最低检出限测试实验
使用浓度为500copies/mL的假病毒提取物作为灵敏度模板，按照实施例1的反应程序，进行扩增检测，重复20个反应，反应结果如表1：
Figure 967154DEST_PATH_IMAGE005
结果如表1所述，当假病毒浓度为500copies/mL时，20次重复实验全部检出新冠病毒及突变位点，表明本试剂的最低检出限为500copies/mL。
实施例 3新型冠状病毒Delta变异株核酸检测室间质量评价能力验证实验
使用上述试剂检测提取后的新型冠状病毒Delta变异株核酸，结果见表2：
Figure 272102DEST_PATH_IMAGE006
结果如表2所示，本发明检测对新冠病毒德尔塔变异株核酸检测结果完全符合国家卫健委的参考值要求。
实施例 4特异性检测
在上海宏石医疗科技有限公司Slan-96P型号PCR仪上，检测10份健康志愿者咽拭子标本、4份其他病原体阳性标本或培养物、假病毒阳性对照和DEPC处理水，检测结果见表3：
Figure 901798DEST_PATH_IMAGE007
结果如表3所示，本发明的引物探针组合与健康人和常见其他呼吸道病原体没有非特异性扩增，试剂盒特异性较好。
实施例 5不同机型测试实验—POCT分子一体机检测
1.采用实施例1中引物探针组合，使用冻干型原料配制反应体系，并分装至POCT分子一体机芯片耗材中进行冻干处理。芯片耗材包含核酸提取试剂和核酸检测试剂，具有全自动核酸提取和扩增检测功能，易于保存、常温运输的预分装单人份冻干型试剂。
2. 10份健康志愿者咽拭子标本、4份其他病原体阳性标本或培养物、假病毒阳性对照和DEPC处理水，各取200uL分别加入16个上述预分装冻干型试剂中，使用POCT分子一体机进行核酸提取和扩增检测，结果见表4：
Figure 701127DEST_PATH_IMAGE008
结果如表4所示，使用本发明引物探针组合制备的冻干型试剂，在POCT分子一体机上的检测效果与Slan-96P 型荧光PCR仪检测效果相当，表明本发明引物探针组合配制的液体试剂或冻干型试剂具有相同的鉴定效果，且适配不同型号的检测仪器。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 深圳康美生物科技股份有限公司
北京康美天鸿生物科技有限公司
<120> 用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttccatgtgg gctcttataa tc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcaacacaca taaaaacaat acctc 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttacttct aactactcag gtg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaccaggaa caaatacttc taacc 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcatgaata gcaacaggga 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctttatcagg gtgttaact 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgcaggtat atgcgctagt ta 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaggcaatg atggattgac tag 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
actaattctc gtcggcgg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
attccgcatc attttccact 20
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcatagacat tagtaaagca gagatc 26
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttatggay tgtctcct 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggacacgc tcccctgac 19
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgagtccttc cacgatacca aa 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcaatgcctc ctgcaccacc aa 22

Claims (7)

1.用于检测新型冠状病毒变异株的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
引物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'。
2.用于检测新型冠状病毒B.1.617变异株的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
引物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'；以及，
引物序列三：SEQ ID NO.7：5'-GTGCAGGTATATGCGCTAGTTA-3'，
SEQ ID NO.8：5'-GTAGGCAATGATGGATTGACTAG-3'；
探针序列三：SEQ ID NO.9：5'-ACTAATTCTCGTCGGCGG-3'。
3.用于检测新型冠状病毒B.1.617.2变异株的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
引物序列一：SEQ ID NO.1：5'-TTCCATGTGGGCTCTTATAATC-3'，
SEQ ID NO.2：5'-TCAACACACATAAAAACAATACCTC-3'；
探针序列一：SEQ ID NO.3：5'-TGTTACTTCTAACTACTCAGGTG-3'； 以及，
引物序列二：SEQ ID NO.4：5'-ACACCAGGAACAAATACTTCTAACC-3'，
SEQ ID NO.5：5'-TGCATGAATAGCAACAGGGA-3'；
探针序列二：SEQ ID NO.6：5'-CTTTATCAGGGTGTTAACT-3'；以及，
引物序列三：SEQ ID NO.7：5'-GTGCAGGTATATGCGCTAGTTA-3'，
SEQ ID NO.8：5'-GTAGGCAATGATGGATTGACTAG-3'；
探针序列三：SEQ ID NO.9：5'-ACTAATTCTCGTCGGCGG-3'；以及
引物序列四：SEQ ID NO.10：5'-ATTCCGCATCATTTTCCACT-3'，
SEQ ID NO.11：5'-GCATAGACATTAGTAAAGCAGAGATC-3'；
探针序列四：SEQ ID NO.12：5'-TGTTATGGAYTGTCTCCT-3'。
4.根据权利要求1～3任一项所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
5.用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的引物和探针。
6.根据权利要求5所述的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括人源性内参基因的特异性引物和探针，
引物序列：SEQ ID NO.13：5'-ATGGACACGCTCCCCTGAC-3',
SEQ ID NO.14：5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAAA-3'；
探针序列：SEQ ID NO.15：5'-GCAATGCCTCCTGCACCACCAA-3'。
7.根据权利要求5或6所述的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×PCR反应缓冲液、扩增酶混合液、阳性对照、阴性对照。
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