CN109913589B

CN109913589B - 一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法

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Publication number: CN109913589B
Application number: CN201910281656.8A
Authority: CN
Inventors: 马东礼; 邢志浩; 姜含芳
Original assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Current assignee: Shenzhen Childrens Hospital
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN109913589A

Abstract

本发明涉及一种用于检测带状疱疹病毒(VZV)的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测VZV的方法。本发明根据VZV的基因保守区域设计引物和探针，通过实时荧光定量PCR技术检测VZV基因。本发明进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给VZV感染性疾病的研究以及临床精准诊断VZV感染性疾病带来很大的帮助。

Description

一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及于病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)是双链DNA病毒，属人类疱疹病毒α亚科3型(HHV-3)，形状呈同心圆状结构，有包膜。VZV没有动物储存宿主，人是唯一自然宿主。原发感染可引起不同严重程度的典型疾病,健康儿童感染VZV后多数症状轻微，预后良好。但在某些特殊人群，如免疫功能缺陷及使用免疫抑制剂治疗的儿童，会导致严重后果，甚至死亡。成人感染VZV后症状也甚为严重。

VZV能感染儿童诱发水痘的产生，恢复后少量病毒潜伏于脊髓后根神经节或颅神经的感觉神经节中。成年后外伤、发热等因素能激活潜伏在神经节内的病毒，活化的病毒经感觉神经纤维轴突下行至所支配的皮肤区，增殖后引起带状疱疹。并发症有脑脊髓炎和眼结膜炎等。

水痘是具有高传染性的世界流行性疾病，96％呈显性感染，有明显的临床症状，隐性感染仅4％，感染后可获终生免疫，一般很少发生第二次水痘感染。20岁以上尚未感染水痘者仅占8％。

VZV实验室诊断包括：(1)电子显微镜检查：直接在电镜下观察VZV；(2)VZV培养：可从水痘及带状疱疹病人水疱液中分离到VZV进行细胞传代培养。但该方法费时，阳性率低；(3)血清学方法：确定个体对水痘的免疫状况，在筛检易感者，诊断不典型急性水痘、带状疱疹及疫苗效果评价方面，具有重要意义。已建立的方法较多，敏感性及特异性较高的方法有补体扩大中和试验(CENT)、免疫吸附血凝反应(IAHA)、膜抗原荧光抗体法(FAⅥA)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)，尤以FAMA和ELISA较适于血清流行病学调查；ELISA由于操作简单而被推广使用；(4)细胞免疫学方法：体外以VZV持续感染的人胚肺二倍体细胞作为靶细胞的直接细胞毒试验(CTL)在某些实验室已成为检测VZV特异细胞免疫力的最敏感方法，但由于操作复杂而使应用受到较多限制；VZV皮试：稀释抗原注射于皮下，48小时后观察结果，能够很好反映VZV特异的细胞免疫状况，简便易行，可作为筛检VZV易感者、评价疫苗接种效果的方法；(5)分子生物学诊断：应用PCR技术检测VZV DNA，具有较高的敏感性和特异性。

由于上述的实验室检查方法具有灵敏度低、特异性差，耗时长的缺点，检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致疾病的误诊、漏诊。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的不足，本发明通过生物信息学方法，根据VZVDNA片段高度保守区域设计出引物和探针组合，探索最佳反应条件，建立包含适宜组分的反应体系，在此基础上开发出一种高特异性和高灵敏度的实时荧光定量PCR方法，本发明利用上述引物探针组合物可同时针对VZV基因组上特异DNA目的片段和内标DNA片段进行双重荧光PCR扩增。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

本发明的第一个目的是提供一种用于检测VZV的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针。

为了进一步优化上述技术方案，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的引物和探针的设计过程如下：在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载Human herpesvirus 3的参照序列(GenBank:NC_001348.1，序列全长124884bp)，并使用免费开源的kers工具Jellyfish(http://www.cbcb.umd.edu/software/jellyfish/jellyfish-1.1.10.tar.gz)对全基因组序列进行连续切割，逐个碱基划动得到的序列长度为200的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2)的序列比对到NCBI的NT数据库，最终得到高度保守序列Spec_i37249，以此目的序列为模板，设计特异性的引物和探针。

进一步地，所述引物探针组合物还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。

进一步地，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、Cy5，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA。上述荧光基团和淬灭基团可为本领域常规使用的任一合适的基团。更进一步地，所述用于扩增目的DNA片段的探针与用于扩增内标DNA片段的探针标记的荧光基团不相同，更优选为用于扩增目的DNA片段的探针采用HEX荧光基团，用于扩增内标DNA片段的探针采用FAM荧光基团，所述淬灭基团均采用TAMRA。

上述引物及探针序列具体如下：

目的DNA片段的上游引物：5'-ATGACAGCCCAGTGGAGAAA-3'(SEQ ID NO：1)；

目的DNA片段的下游引物：5'-TCATCCTCCGATGACGATCC-3'(SEQ ID NO：2)；

目的DNA片段的探针：5'-HEX-CGTCTTCATCCTCTTCCTCGTCGTGG-TAMRA-3'(SEQ IDNO：3)；

内标DNA片段的上游引物：5'-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3'(SEQ ID NO：4)；

内标DNA片段的下游引物：5'-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3'(SEQ ID NO：5)；

内标DNA片段的探针：5'-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3'(SEQ ID NO：6)

内标DNA片段的序列如下：TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG(SEQ ID NO：7)。

本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述的引物探针组合物的用于检测VZV的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。更进一步地，该试剂盒包括反应液A和反应液B，其中，反应液A中组分主要有以上两组用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物和两条探针，反应液B中组分主要有热启动酶和UNG酶；进一步地，反应液A中的组分包含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 9.0，25℃)，0.1％Triton X-100，5mM MgCl₂，0.32mM dNTP，0.4nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的引物，0.125nM用于扩增目的DNA片段和内标DNA片段的探针。反应液B含有2U/μl的Taq酶、0.4μg/μl的Taq酶抗体，0.2U/μl的Uracil-DNA Glycosylase(UNG酶，尿嘧啶-DNA糖基化酶)。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为VZV标准菌株的菌悬液。

本发明的第三个目的是提供一种采用任一上述的试剂盒用于的检测VZV的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1)样本的采集及提取，其中，所述样本在提取过程中加入内标，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示；

步骤2)将提取的样本置于PCR反应体系中进行PCR扩增反应，所述PCR反应体系包括反应液A和反应液B；其中，所述反应液A包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针以及如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针；所述反应液B包括热启动酶和UNG酶；

步骤3)根据扩增产物的Ct值，进行结果判定，其中：

样本Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阳性；

样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阴性；

样本Ct≥35且无明显S型扩增曲线，内标Ct≥35且无明显S型扩增曲线，其结果为无效。

进一步地，所述样本为疱疹液。

进一步地，所述样本的提取步骤包括：疱疹液中加适量的生理盐水，用加样枪反复吹打后，置2～8℃冰箱过夜，使疱疹液充分液化；用加样枪或吸管取适量充分液化的疱疹液至离心管中，10000～15000rpm离心3～10分钟；取内标DNA加入到样本处理液中，加入比例为1：30～70；去上清，沉淀中加入适量的样本处理液，充分混匀，85～120℃恒温处理5～15分钟；10000～15000rpm离心3～10分钟，获得样本提取液。

进一步地，所述PCR扩增反应程序为：50℃120s，95℃600s，1个循环；95℃15s，55℃45s，40个循环；37℃20s，1个循环。

进一步地，所述PCR反应体系的总体积为20μL，其中反应液A 16μl；反应液B 1μl；样本提取液3μL。

进一步地，所述方法还包括阴性对照和阳性对照，其为在每一反应体系中分别各自接入反应液A、反应液B和阴性质控品或阳性质控品，其扩增程序与样本的扩增程序相同。

本发明的第四个目的是提供一种任一上述的探针引物组合物在制备诊断VZV感染性疾病的试剂中的应用。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明根据VZV的基因保守区域设计引物和探针，提供一种VZV实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)基因检测试剂盒，通过实时荧光定量PCR技术检测VZV基因。本发明进行实时荧光定量PCR检测，大大提高了检测的灵敏度和特异性，同时减少检测时间，给VZV感染性疾病的研究以及临床精准诊断VZV感染性疾病带来很大的帮助。

附图说明

图1为本发明一实施例中PCR扩增条件温度曲线图；

图2为本发明一实施例中阴性对照PCR扩增曲线图；

图3为本发明一实施例中阳性对照PCR扩增曲线图；

图4为本发明一实施例中样本的PCR扩增曲线图。

具体实施方式

本发明涉及一种用于检测VZV的引物探针组合物，其包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针，还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针。本发明还涉及含有上述引物探针组合物的试剂盒及利用该试剂盒检测VZV的方法。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为一较佳方式的检测VZV的方法，其包括如下步骤：

(1)样品采集：

取疱疹液，及时送检。共收集样本183例。所有临床样本均来源于深圳市儿童医院。

(2)样本提取：

1)疱疹液中加4倍体积的生理盐水，用1ml的加样枪反复吹打后，置4℃冰箱过夜，使疱疹液充分液化；

2)用加样枪或吸管取1ml充分液化的疱疹液至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟；

3)取内标加入到样本处理液中，加入比例为1：50；

4)去上清，沉淀中加入50μl样本处理液，充分混匀，100℃恒温处理10分钟；

5)12,000g离心5分钟，备用。

(3)反应体系：

实时荧光定量PCR反应体系包括反应液A、反应液B、样本(或者阴性质控品、阳性质控品)。反应体系如下：

1)样本孔

2)阴性对照孔

组分名称	组成成分	加量
			反应液A	引物、探针	16μl
反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阴性质控品	生理盐水	3μL
总体积		20μL

3)阳性对照孔

组分名称	组成成分	加量
			PCR反应液A	引物、探针	16μl
PCR反应液B	热启动酶、UNG酶	1μl
			阳性质控品	标准毒株的DNA	3μL
总体积		20μL

(4)实时荧光定量PCR反应：

对应上述反应体系，将试剂盒中各成分分别加入PCR反应管中，进行实时荧光定量PCR扩增反应，PCR扩增条件温度曲线如图1所示，具体反应步骤如下：

50℃120s，1个循环；

95℃600s，1个循环；

95℃、15s，55℃、45s(收集荧光)，40个循环；

37℃、20s，1个循环。

(5)结果判定(根据Ct值)

上述实验结果如图2～图4所示，图2为本实施例中阴性对照PCR扩增曲线图，样本FAM通道无明显S型扩增曲线(图2上)，内参HEX通道有明显S型扩增曲线(图2下)，结果判为阴性。图3为本实施例中阳性对照PCR扩增曲线图，样本样本FAM通道Ct值为28.1有明显S型扩增曲线(图3上)，内参HEX通道Ct值为30.5，有明显S型扩增曲线(图3下)，结果判为阳性。图4为本实施例中样本的PCR扩增曲线图，根据以上规则判定阴性和阳性。

由上述实施例可知，本发明利用重复性好、特异性好、灵敏度高、检测效率高的引物和探针组合，所涉及的试剂盒及检测方法可准确和快速的检测疱疹液中VZV。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 深圳市儿童医院

<120> 一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法

<130> IPI190705

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 目的DNA片段的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacagccc agtggagaaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 目的DNA片段的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 2

tcatcctccg atgacgatcc 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 目的DNA片段的探针(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtcttcatc ctcttcctcg tcgtgg 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 内标DNA片段的上游引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcatgtgga ggaaggtggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 内标DNA片段的下游引物(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatggactg gctctccgtt 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 内标DNA片段的探针(Artificial Sequence)

<400> 6

acgcagccct gcttcgttcg ccg 23

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> 内标DNA片段(Artificial Sequence)

<400> 7

tcacaagcag gagtgtgcca ggagaaggcc aaaccatcca gtgccggtgg tttgaccacg 60

aggagtgcat cctgcacgga gtcactgagc tcgtgacctc cacgctgctc gtcccctgcg 120

ctatcgagag ggcactctct gtgtctcagc tggtgccgct ggcgcagagt gttttgggcc 180

ccttaaagct cagcatggct ggttctggag agatggaaaa gagaaaggat ttcccccatt 240

tgggtgcctc gggcatgtgg aggaaggtgg tccggcgaac gaagcagggc tgcgtgaagg 300

ggatctgata acccacgtca acggagagcc agtccatgg 339

Claims

1.一种用于检测带状疱疹病毒的引物探针组合物，其特征在于，包括用于扩增目的DNA片段的如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物和如SEQ ID No.3所示序列的探针；

所述引物探针组合物还包括用于扩增内标DNA片段的如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示序列的引物和如SEQ ID No.6所示序列的探针；所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5'端标记荧光基团，所述探针的3'端标记淬灭基团；其中，所述荧光基团为FAM、VIC、HEX、JOE、ROX或Cy5，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2或TAMRA。

3.一种含有权利要求1或2所述的引物探针组合物的用于检测带状疱疹病毒的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括热启动酶和UNG酶。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为带状疱疹病毒标准菌株的菌悬液。

6.一种非诊断目的的检测带状疱疹病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1)样本的采集及提取，其中，所述样本在提取过程中加入内标DNA片段，所述内标DNA片段的序列如SEQ ID No.7所示；

步骤3)根据扩增产物的Ct值，进行结果判定，其中：

样本Ct<35且有明显S型扩增曲线，其结果为阳性；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：50℃120s，95℃600s，1个循环；95℃15s，55℃45s，40个循环；37℃20s，1个循环。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系的总体积为20μL，其中反应液A16μl；反应液B1μl；DNA模板3μL。