CN107287346B - 用于禽流感病毒n亚型基因分型的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

用于禽流感病毒n亚型基因分型的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、禽流感病毒N亚型反应液A、禽流感病毒N亚型反应液B、禽流感病毒N亚型反应液C、阳性对照A、阳性对照B、阳性对照C和空白对照。本发明克服了现有技术中禽流感病毒N亚型核酸分型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低等缺陷，提出了一种具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点的用于禽流感病毒N亚型基因分型的检测试剂盒，在禽流感病毒N亚型的临床诊断、疾病监测等方面具有极大的应用前景。

Description

用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂 盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种核酸检测试剂盒及其应用，具体涉及一种用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
禽流感病毒(Avian Influenza virus，简称AIV)属于正粘病毒科的一种RNA病毒。自从1997年发现其可以感染人类并致死以来，引起世界极大的关注。禽流感病毒的基因组由8条独立的单股负链组成，分别编码不同的蛋白质，具有高度的重组性。其中NA和HA变异性最强，也是划分病毒不同亚型的依据。人感染AIV后典型症状特征是突发高热、头晕头痛、咳嗽(通常干咳)、疲劳、食欲不振、肌肉和关节痛、严重身体不适，同时可伴有喉咙痛和鼻塞、流涕、胸痛等症状。发热体温可达39～40℃，一般持续3～4天后渐退。
目前禽流感病毒N亚型被分为N1-9亚型，禽流感病毒的反复感染可能就与不同亚型的存在有关。开展禽流感病毒N亚型的监测对流行病学研究及疫苗的发展都有极其重要的意义。
目前医院诊断禽流感病毒感染的方法主要有病毒分离培养、免疫学诊断以及核酸检测法。病毒分离培养检测操作复杂，费时较长，需几周才能报告结果，且敏感性低；免疫学诊断主要以金标法和EIA为主，具有快速，简便等优点，但特异性和敏感性较差；核酸检测法是刚刚兴起的最新的检测方法，发展迅速，具有非常高的特异性和敏感性，技术操作也不复杂，可以有利于早期诊断、无症状病人诊断、以及病程的跟踪。
目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。对于荧光PCR检测病毒来说，引物的设计至关重要，其直接影响检测的特异性。如果引物的特异性不够，则可能导致假阳性的出现。
多重荧光定量PCR技术则是在同一反应体系中加入多条不同荧光标记的探针。例如，针对靶基因1的探针标记FAM，针对靶基因2的探针标记VIC，针对靶基因3的探针标记ROX。PCR反应过程中，若待检样本包含靶基因1，则标记FAM的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因2，则标记VIC的探针产生荧光信号；若待检样本包含靶基因3，则标记ROX的探针产生荧光信号。这样，同一管反应则可确定多个靶基因(如图1所示)。
现有的禽流感病毒N亚型基因分型检测试剂盒大多存在特异性差、灵敏性较低无分型检测等缺陷，有待改进。本发明针对不同N亚型禽流感病毒的靶序列分别设计了不同引物和Taqman探针，在很大程度上保证了用于检测病毒时的结果的特异性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的禽流感病毒N亚型基因分型检测试剂盒特异性差、灵敏性较低等缺陷，提供一种用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒具有高通量、操作简便、重复性强、检测结果快速客观等优点，对禽流感病毒N亚型的分型检测具有良好的应用前景。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的一种用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下各组分：核酸扩增反应液、酶混合液、禽流感病毒N亚型反应液A、禽流感病毒N亚型反应液B、禽流感病毒N亚型反应液C、阳性对照A、阳性对照B、阳性对照C和空白对照；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液A包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N1-3亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N1亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.7所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N2亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.8所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N3亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.9所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液B包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N4-6亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N4亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.16所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N5亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.17所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N6亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.18所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液C包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N7-9亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N7亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.25所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N8亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.26所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N9亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQ ID No.27所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
在本发明中，用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测引物及探针的核苷酸序列见表1：
表1 检测禽流感病毒N亚型的引物及探针
名称 序列(5′→3′)
N1-FP AGACCTTGCTTCTGGGTTG(SEQ ID No.1)
N1-RP CTACTTGTCAATGGTAAACGG(SEQ ID No.2)
N1-P X1-TGGACTAGTGGGAGCAGCATATCTTT-Y1(SEQ ID No.7)
N2-FP TTACAGGGTTTGCACCTTTTTCT(SEQ ID No.3)
N2-RP GGGCAAATTGATAACATTTGT(SEQ ID No.4)
N2-P X2-TGACAAGAGAACCTTATGTGTCATGCGA–Y2(SEQ ID No.8)
N3-FP AGATATGTGTTGCTTGGTCAAGTAG(SEQ ID No.5)
N3-RP CTCCATGATTTAATGGAGTCCGTC(SEQ ID No.6)
N3-P X3-AGTTGCTTCGATGGAAAGGAATGGAT-Y1(SEQ ID No.9)
N4-FP AACAATCGGTAGTGTCAGCATTGTAC(SEQ ID No.10)
N4-RP TGTTTGAGTTACCTGATTATAATGGC(SEQ ID No.11)
N4-P X1-ACAATAGGACTGCTCCTCCAAATAACAAGC-Y1(SEQ ID No.16)
N5-FP CCAAATCAGAAAATAATAACAATTG(SEQ ID No.12)
N5-RP CTTTTGTCACTGATATTATTCCTATG(SEQ ID No.13)
N5-P X2-CAACATACTGCTTCATATTGCATCAATAG-Y1(SEQ ID No.17)
N6-FP AAGGGGCAAATAGACCAGTAAT(SEQ ID No.14)
N6-RP TTGGGGCGACTTGTATCGGTTA(SEQ ID No.15)
N6-P X3-ATGATGACCCACACAAGCAAGTACTTGTG-Y1(SEQ ID No.18)
N7-FP GAATCCAAATCAGAAACTATTTGCA(SEQ ID No.19)
N7-RP ACAGTAGTGTTGTTTTGATTAATGGT(SEQ ID No.20)
N7-P X1-TCTCAAATGTCGGATTGAATGTATCTCTACA-Y1(SEQ ID No.25)
N8-FP TGCTTCTGGGTTGAGATGAT(SEQ ID No.21)
N8-RP AAGAATAGCTCCATCGTGCCA(SEQ ID No.22)
N8-P X2-AGTAGCTCCATTGTGATGTGTGGAGTAGA-Y1(SEQ ID No.26)
N9-FP GCAAATCTAGGGTTGAACATAGGAC(SEQ ID No.23)
N9-RP TAATAGTTGTTTATTATTGTTTGGCTT(SEQ ID No.24)
N9-P X3-CTGCAATTGCTCACACTCACAACCTGA-Y1(SEQ ID No.27)
注：X1\X2\X3为荧光报告基团，Y1和Y2为荧光淬灭基团。
本发明对上述引物和探针的摩尔配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，它们之间不同的摩尔配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具有最优的检测效果：
在本发明中，优选的，禽流感病毒N亚型反应液A组分(1)中SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物序列按照摩尔比为4:4:6:6:6:6混合，禽流感病毒N亚型反应液B组分(1)中SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15，禽流感病毒N亚型反应液C组分(1)中SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQID No.24所示的引物序列均按照等摩尔配比混合。
在本发明中，优选的，禽流感病毒N亚型反应液A、B或C中组分(2)、组分(3)或组分(4)中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LCRED640中的任一种，且组分(2)、组分(3)或组分(4)中的荧光报告基团不同；组分(2)、组分(3)或组分(4)中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。
在本发明中，优选的，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液A中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9为4:4:6:6:6:6:3:4:3。
在本发明中，优选的，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液B中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18为4:4:4:4:4:4:3:3:1.5。
在本发明中，优选的，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液C中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27为4:4:4:4:4:4:4:4:2。
在本发明中，优选的，所述的核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁以及核苷酸混合液。
在本发明中，优选的，所述的酶混合液包括Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂，更优选的，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
在本发明中，优选的，所述的阳性对照A为灭活的禽流感病毒N1-3亚型的病毒培养液，阳性对照B为灭活的禽流感病毒N4-6亚型的病毒培养液，阳性对照C为灭活的禽流感病毒N7-9亚型的病毒培养液；所述的空白对照为去RNA酶水。
进一步的，本发明还公开了以上任一项所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒在制备检测禽流感病毒N亚型的试剂中的应用。
本发明的试剂盒采用多重荧光定量PCR技术，分别设计针对禽流感病毒N亚型的特异性引物和探针，实现了在同一反应体系中同时检测禽流感病毒N1-9亚型的目的。引物和探针的设计采用primer 5.0专用软件设计，将设计的引物和探针在NCBI的GeneBank进行比对，检测引物和探针的特异性。引物和探针在专业合成公司合成，采用紫外分光光度计测定光密度值(A260nm/A280nm在1.8-2.0之间为合格)。
相较于现有技术，本发明提供的一种用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒具有如下有益效果：
1)本试剂盒操作简便且能有效防止污染，PCR荧光检测时间(从标本处理开始)仅为2-3小时，而且在同一反应体系中三管实现同时检测禽流感病毒N1-9亚型。PCR荧光检测是全封闭操作，加入样本抽提产物之后可以不再打开管盖，减少了污染产生的机会。
2)能够同时检测出禽流感病毒N1-9亚型，解决了现有产品只能单管中单独检测禽流感病毒N1-9亚型的问题。本发明还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强、检测结果快速客观等优点，在禽流感病毒N1-9亚型的临床诊断、疾病预防监测领域具有极大的应用前景。
附图说明
图1是多重荧光定量PCR技术原理图；
图2是本发明试剂盒检测样本的曲线图；
图3是本发明试剂盒检测禽流感病毒N1亚型的灵敏度试验结果图；
图4是本发明试剂盒检测禽流感病毒N2亚型的灵敏度试验结果图；
图5是本发明试剂盒检测禽流感病毒N3亚型的灵敏度试验结果图；
图6是本发明试剂盒检测禽流感病毒N4亚型的灵敏度试验结果图；
图7是本发明试剂盒检测禽流感病毒N5亚型的灵敏度试验结果图；
图8是本发明试剂盒检测禽流感病毒N6亚型的灵敏度试验结果图；
图9是本发明试剂盒检测禽流感病毒N7亚型的灵敏度试验结果图；
图10是本发明试剂盒检测禽流感病毒N8亚型的灵敏度试验结果图；
图11是本发明试剂盒检测禽流感病毒N9亚型的灵敏度试验结果图；
图12是本发明试剂盒检测禽流感病毒N1亚型的特异性试验结果图；
图13是本发明试剂盒检测禽流感病毒N2亚型的特异性试验结果图；
图14是本发明试剂盒检测禽流感病毒N3亚型的特异性试验结果图；
图15是本发明试剂盒检测禽流感病毒N4亚型的特异性试验结果图；
图16是本发明试剂盒检测禽流感病毒N5亚型的特异性试验结果图；
图17是本发明试剂盒检测禽流感病毒N6亚型的特异性试验结果图；
图18是本发明试剂盒检测禽流感病毒N7亚型的特异性试验结果图；
图19是本发明试剂盒检测禽流感病毒N8亚型的特异性试验结果图；
图20是本发明试剂盒检测禽流感病毒N9亚型的特异性试验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例与试验例中所用试剂均为市售。
实施例1一种快速检测禽流感病毒N亚型的核酸分型检测试剂盒的制备
所述试剂盒包括核酸扩增反应液、酶混合液、禽流感病毒N亚型反应液A、禽流感病毒N亚型反应液B、禽流感病毒N亚型反应液C、阳性对照A、阳性对照B、阳性对照C和空白对照；
其中，核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁、核苷酸混合液；
禽流感病毒N亚型反应液A包含以下组分：
组分(1)：由六条检测禽流感病毒N1-3亚型的引物组成；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示；检测呼禽流感病毒N1-3亚型的引物浓度为：SEQ ID No.1为400nM(nmol/L)，SEQID No.2为400nM，SEQ ID No.3为600nM，SEQ ID No.4为600nM，SEQ ID No.5为600nM，SEQID No.6为600nM；
组分(2)：由一条检测禽流感病毒N1的探针组成，探针的碱基序列为SEQ ID No.7所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.7的浓度为300nM；
组分(3)：由一条检测禽流感病毒N2的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.8所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.5的浓度为为400nM。
组分(4)：由一条检测禽流感病毒N3的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.9所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团ROX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；探针SEQ IDNo.5的浓度为为300nM。
禽流感病毒N亚型反应液B包含以下组分：
组分(1)：由六条检测禽流感病毒N4-6亚型的引物组成；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示；检测呼禽流感病毒N4-6亚型的引物浓度为：SEQ ID No.10为400nM(nmol/L)，SEQ ID No.11为400nM，SEQ ID No.12为400nM，SEQ ID No.13为400nM，SEQ IDNo.14为400nM，SEQ ID No.15为400nM；
组分(2)：由一条检测禽流感病毒N4的探针组成，探针的碱基序列为SEQ ID No.16所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.16的浓度为300nM；
组分(3)：由一条检测禽流感病毒N5的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.17所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.17的浓度为为300nM。
组分(4)：由一条检测禽流感病毒N6的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.18所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团ROX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；探针SEQ IDNo.18的浓度为为150nM。
禽流感病毒N亚型反应液C包含以下组分：
组分(1)：由六条检测禽流感病毒N7-9亚型的引物组成；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.19、SEQ ID No.20和SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示；检测呼禽流感病毒N7-9亚型的引物浓度为：SEQ ID No.19为400nM(nmol/L)，SEQ ID No.20为400nM，SEQ ID No.21为400nM，SEQ ID No.22为400nM，SEQ IDNo.23为400nM，SEQ ID No.24为400nM；
组分(2)：由一条检测禽流感病毒N7的探针组成，探针的碱基序列为SEQ ID No.25所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.25的浓度为400nM；
组分(3)：由一条检测禽流感病毒N5的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.26所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团ROX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；探针SEQ IDNo.26的浓度为为200nM。
组分(4)：由一条检测禽流感病毒N6的探针组成；探针的碱基序列为SEQ ID No.27所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；探针SEQ IDNo.27的浓度为为200nM。
禽流感病毒N亚型反应液用去RNA酶水配制。
酶混合液包括Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂，其中，Taq酶为热启动Taq酶，逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
阳性对照A为灭活的禽流感病毒N1-3亚型的病毒培养液，阳性对照B为灭活的禽流感病毒N4-6亚型的病毒培养液，阳性对照C为灭活的禽流感病毒N7-9亚型的病毒培养液；所述的空白对照为去RNA酶水。
实施例2本发明的试剂盒禽流感病毒N亚型基因分型中的应用
1、提取样本RNA
1.1取200ul临床样品，加入400ul添加了Poly(A)的Binding Buffer，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离心15s，弃去收集管中的废液。
1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃去收集管中的废液。
1.4重复步骤1.3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净。
1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。
2、在每个PCR反应管放入组分如表2中所示的禽流感病毒N亚型检测试剂(实施例1制备)和RNA样本：
表2
反应液组分 加量(ul)/1人份
核酸扩增反应液 7.5
酶混合液 5
禽流感病毒N亚型反应液 4
去RNA酶水(阴性参考品) 3.5
RNA样本 5
总体积 25
3、在荧光定量PCR扩增仪中扩增，按照下列程序进行PCR扩增：
50℃ 30min
95℃ 5min
Figure BDA0000954047130000101
4、扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染禽流感病毒N1-9亚型。扩增曲线如图2所示。
结果判定：在A管内FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.3，判断为禽流感病毒N2亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.3判断为禽流感病毒N2亚型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为禽流感病毒N1亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，判断为禽流感病毒N1亚型阴性；在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.1，判断为禽流感病毒N3亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.1，判断为禽流感病毒N3亚型阴性。在B管内FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为禽流感病毒N4亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0判断为禽流感病毒N4亚型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为禽流感病毒N5亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，判断为禽流感病毒N5亚型阴性；在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.3，判断为禽流感病毒N6亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.3，判断为禽流感病毒N6亚型阴性。在C管内FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.5，判断为禽流感病毒N9亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.5判断为禽流感病毒N9亚型阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为禽流感病毒N7亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.0，判断为禽流感病毒N7亚型阴性；在ROX通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.2，判断为禽流感病毒N8亚型阳性；无典型“S”型扩增或CT>35.2，判断为禽流感病毒N8亚型阴性。
15个临床样本具体检测结果见表3。
表3 15个临床样本的检测结果
Figure BDA0000954047130000111
试验例1本发明试剂盒的灵敏性试验
阳性参考品为灭活的禽流感病毒N1-9亚型病毒培养液。分别将含有5×104TCID50/ml禽流感病毒N1-9亚型培养液的核酸提取液按照稀释浓度为5×104、5×103、5×102、50、10、1TCID50/ml六个浓度进行灵敏度试验。
阴性参考品分别为乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒、A组乙型链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌的病毒培养液。
采用本发明试剂盒(实施例1制备)按照实施例2相同的方法进行检测。
检测结果表明本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度减少呈梯度改变，结果见图3-11。
试验结果表明，本发明试剂盒对于禽流感病毒N1-9亚型的诊断具有高度的灵敏性。其中，对禽流感病毒N1亚型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，对禽流感病毒N2亚型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，对禽流感病毒N3亚型的检测灵敏度能够达到5TCID50/ml，对禽流感病毒N4亚型的检测灵敏度能够达到5TCID50/ml，对禽流感病毒N5亚型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，对禽流感病毒N6亚型的检测灵敏度能够达到5TCID50/ml，对禽流感病毒N7亚型的检测灵敏度能够达到5TCID50/ml，对禽流感病毒N8亚型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，对禽流感病毒N9亚型的检测灵敏度能够达到1TCID50/ml，。
试验例3本发明试剂盒的特异性试验
用本发明禽流感病毒N1-9亚型检测试剂盒(实施例1制备)检测禽流感病毒N1-9亚型、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒1型、偏肺病毒、冠状病毒等。
检测结果表明：A管FAM通道仅对禽流感病毒N2亚型进行扩增，VIC通道仅对禽流感病毒N1亚型进行扩增，ROX通道仅对禽流感病毒N3亚型进行扩增。B管FAM通道仅对禽流感病毒N4亚型进行扩增，VIC通道仅对禽流感病毒N5亚型进行扩增，ROX通道仅对禽流感病毒N6亚型进行扩增。C管FAM通道仅对禽流感病毒N9亚型进行扩增，VIC通道仅对禽流感病毒N7亚型进行扩增，ROX通道仅对禽流感病毒N8亚型进行扩增。
试验结果表明本发明检测试剂盒能特异性扩增禽流感病毒N1-9亚型，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，结果见图12-图20。
Figure IDA0000954047200000011
Figure IDA0000954047200000021
Figure IDA0000954047200000031
Figure IDA0000954047200000041
Figure IDA0000954047200000051
Figure IDA0000954047200000061

Claims (11)

1.用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下各组分：核酸扩增反应液、酶混合液、禽流感病毒N亚型反应液A、禽流感病毒N亚型反应液B、禽流感病毒N亚型反应液C、阳性对照A、阳性对照B、阳性对照C和空白对照；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液A包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N1-3亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N1亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.7所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N2亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.8所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N3亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.9所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液B包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N4-6亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQID No.15所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N4亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.16所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N5亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.17所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N6亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.18所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
其中，所述的禽流感病毒N亚型反应液C包含以下4组组分：
组分(1)：六条分别用于检测禽流感病毒N7-9亚型的引物；其中，六条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQID No.24所示；
组分(2)：一条用于检测禽流感病毒N7亚型的探针，所述探针的碱基序列为SEQ IDNo.25所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(3)：一条用于检测禽流感病毒N8亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.26所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；
组分(4)：一条用于检测禽流感病毒N9亚型的探针；其中，所述探针的碱基序列为SEQID No.27所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，禽流感病毒N亚型反应液A组分(1)中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的引物序列按照摩尔比为4:4:6:6:6:6混合，禽流感病毒N亚型反应液B组分(1)中SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQID No.15，禽流感病毒N亚型反应液C组分(1)中SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的引物序列均按照等摩尔配比混合。
3.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，禽流感病毒N亚型反应液A、B或C中组分(2)、组分(3)或组分(4)中所述的荧光报告基团分别选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED640中的任一种，且组分(2)、组分(3)或组分(4)中的荧光报告基团不同；组分(2)、组分(3)或组分(4)中所述的荧光淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任一种。
4.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液A中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9为4:4:6:6:6:6:3:4:3。
5.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液B中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18为4:4:4:4:4:4:3:3:1.5。
6.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的检测禽流感病毒N亚型反应液C中，引物及探针的摩尔配比为：SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27为4:4:4:4:4:4:4:4:2。
7.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸扩增反应液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾、氯化镁以及核苷酸混合液。
8.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR酸检测试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液包括Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
9.根据权利要求8所述的多重荧光定量PCR酸检测试剂盒，其特征在于，所述的Taq酶为热启动Taq酶，所述的逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
10.根据权利要求1所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照A为灭活的禽流感病毒N1-3亚型的病毒培养液，阳性对照B为灭活的禽流感病毒N4-6亚型的病毒培养液，阳性对照C为灭活的禽流感病毒N7-9亚型的病毒培养液；所述的空白对照为去RNA酶水。
11.权利要求1-10任一项所述的多重荧光定量PCR检测试剂盒在制备检测禽流感病毒N亚型的试剂中的应用。
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