CN110938708B

CN110938708B - 一种基于等温扩增技术检测h7n9禽流感病毒的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110938708B
Application number: CN201911055648.8A
Authority: CN
Inventors: 李翔; 方斌; 余晓; 刘琳琳; 叶国军; 徐军强; 宋毅
Original assignee: HUBEI PROVINCIAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: HUBEI PROVINCIAL CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110938708A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用重组酶介导的等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括反应缓冲溶液、RPA引物对、探针、RPA冻干粉末、醋酸镁溶液、无菌水和阳性对照；所述RPA引物对和探针用于扩增检测序列如SEQ ID NO.1所示的HA基因片段或序列如SEQ ID NO.2所示的NA基因片段。本发明提供了两个用于检测H7N9禽流感病毒的遗传标记物，建立了RT‑RPA扩增检测方法，所述检测方法的最低检出量为200copies/反应，特异性和灵敏度均优于传统RT‑PCR；且整个扩增反应在20℃～50℃范围的恒温条件下进行，20分钟即可完成反应。

Description

一种基于等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种采用重组酶介导的等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其应用。

背景技术

H7N9禽流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜，基因组为分节段单股负链RNA。H7N9禽流感病毒为新型重配病毒，2013年3月中国疾病预防控制中心首次证实H7N9禽流感病毒可感染人类，此后该病毒迅速在中国大陆及港澳台地区蔓延，并呈现季节性流行趋势。2013年11月中国疾病预防控制中心正式将其纳入乙类传染病范畴并按照甲类传染病标准进行管理。人感染H7N9禽流感潜伏期多为7天以内，也可长达10天。患者感染初期表现为流感样症状，后病情进展迅速，肺炎为主要临床表现，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血、休克、多器官功能衰竭综合征，甚至死亡。截止2016年4月30日，我国已有758例实验室确诊病例，死亡309例，致死率高达40.8％，对我国公民健康构成严重威胁。现有资料显示，患者主要通过直接接触感染的家禽或被病毒污染的环境而感染，中国大陆地区尤其是农村地区多有活禽交易市场，粗放式的管理方式加剧了禽流感病毒的传播，因此构建一种灵敏、快速、特异、简便的现场检测方法，及早发现病原，对人禽流感H7N9疫情的监测、预防和控制具有极其重要的意义。

H7N9禽流感病毒的检测包括病毒的分离培养、动态急性期和恢复期双份血清抗体检测及实时定量荧光RT-PCR检测。病毒分离培养工作和血清学检测需要在BSL-3级生物安全实验室中进行，且病毒分离培养周期长，不利于大规模检测，无法达到早期检测目的。动态急性期和恢复期血清采集间隔通常在14天以上，也无法达到早期检测目的。因此，基于PCR的核酸检测已成为H7N9禽流感病毒监测的主要手段。常规RT-PCR和实时定量荧光RT-PCR只能在装备有价格昂贵的荧光定量PCR仪的实验室进行检测，且耗时较长，如果加上样品采集、运送到实验室、到获得检测结果至少需要一天时间，这对基层和偏远地区开展现场快速诊断不利。

重组酶聚合酶扩增反应(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种基于重组酶介导的等温扩增技术，被认为是最有希望替代传统PCR的核酸检测技术。与传统PCR技术相比，核酸等温扩增的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成反应，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA的最适反应温度在37℃～42℃之间，无需变性，在常温下20分钟即可完成扩增反应，可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

用于检测H7N9禽流感病毒的遗传标记物，包括HA基因片段和NA基因片段，所述HA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述NA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5’-AGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGCTGATTCAGAAATGGACAAACTGTATGAACGGGTGAAAAGACAGCTGAGAGAGAATGCTGAAGAGGATGGCACTGGTTGCTTTGAAATATTTCACAAGTGTGATGATGACTGTATGGCCAGTATTAGAAACAACACCTATGATCACAGAAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAGCTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCCTCGGGGCATCATGTTTCATACTTCTAGCCATTGTAATGGGCCTTGTCTTCATAT-3’(SEQ ID NO.1)

5’-AACATAGGACTGCATCTAAAACCGGGCTGCAATTGCTCACACTCACAACCTGAAACAACCAACACAAGCCAAACAATAATAAACAACTATTATAATGAAACAAACATCACCAACATCCAAATGGAAGAGAGAACAAGCAGGAATTTCAATAACTTAACTAAAGGGCTCTGTACTATAAATTCATGGCACATATATGGGAAAGACAATGCAGTAAGAATTGGAGAGAGCTCGGATGTTTTAGTCACAAGAGAACCCTATGTTTCATGCGACCCAGATGAATGCAGGTTCTA-3’(SEQ ID NO.2)

上述检测H7N9禽流感病毒的遗传标记物在H7N9禽流感病毒检测领域的应用。

一种基于等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，包括反应缓冲溶液、RPA引物对、探针、RPA冻干粉末、醋酸镁溶液、无菌水和阳性对照；所述RPA引物对和探针用于扩增检测序列如SEQ ID NO.1所示的HA基因片段或用于扩增序列如SEQ ID NO.2所示的NA基因片段。

上述方案中，所述用于扩增检测序列如SEQ ID NO.1所示的HA基因片段的RPA引物对和探针的序列如下：

正向引物序列H7-FP2：5’-AGCAATGGAGAACCAGCATACAATTGATCTGGC-3’(如SEQ IDN0.3所示)，

反向引物序列H7-RP2：5’-TAAACCAAAGTATCACATCTTTGTAGCCGC-3’(如SEQ ID N0.4所示)，

探针序列H7-RPA-LF1：5’-TACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATA[THF]AGATTGACCCAGTCA-3’(如SEQ ID N0.5所示、且第31个碱基用THF(四氢呋喃基团)替代C碱基)。

上述方案中，所述用于扩增检测序列如SEQ ID NO.2所示的NA基因片段的RPA引物对及探针的序列如下：

正向引物序列N9-FP8：5’-AACATCACCAACATCCAAATGGAAGAGAG-3’(如SEQ ID N0.6所示)，

反向引物序列N9-RP8：5’-TAGAACCTGCATTCATCTGGGTCGCATGAAAC-3’(如SEQ IDN0.7所示)，

探针序列N9-RPA-LF：

5’-TAAAGGGCTCTGTACTATAAATTCATGGCA[THF]ATATATGGGAAAGAC-3’(如SEQ IDN0.8所示、且第31个碱基用THF(四氢呋喃基团)替代C碱基)。

上述方案中，所述序列如SEQ ID N0.4所示的反向引物的5’端和所述序列如SEQID N0.5所示的探针的5’端采用两种不同的标记物标记；所述序列如SEQ ID N0.7所示的反向引物的5’端和所述序列如SEQ ID N0.8所示的探针的5’端采用两种不同的标记物标记，所述序列如SEQ ID N0.5所示的探针和所述序列如SEQ ID N0.8所示的探针的3’端均采用封闭基团进行封闭。

上述方案中，所述标记物选自Biotin标记、DIG标记、FITC标记、或FAM标记。

上述方案中，所述封闭基团选自SpacerC3、磷酸盐、或双脱氧核苷酸。

上述方案中，所述RPA冻干粉末包括噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合酶、逆转录酶和dNTPS。

上述方案中，所述试剂盒还包括侧向层析试纸条、上样缓冲液(含0.05％Tween-20的10mM Tris盐缓冲液)；所述侧向层析试纸条的前端包被有探针5’端标记物抗体修饰的纳米金粒子，检测线上包被有反向引物标记物抗体，质控线包被有可以与前端所述纳米金粒子结合显色的固定抗体。

上述方案中，所述阳性对照为重组质粒pGEM-T，浓度为10⁵copies/反应～10²copies/反应。本发明所述阳性对照标准品的构建方法是采用PCR对H7N9 cDNA模板进行扩增，得到所需的H7N9的HA基因序列片段或NA基因序列片段，序列片段纯化后连接到pGEM-T质粒载体上，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证得到所需的阳性对照质控样品。

一种基于上述试剂盒快速检测判断H7N9禽流感病毒的方法，包括如下步骤：

(1)RT-RPA体系配置：将RPA冻干粉末加入到反应缓冲液中，再加入正向引物、反向引物、探针、待测模板，加入无菌水，混匀离心，再加入醋酸镁，颠倒混匀，离心；

(2)将RT-RPA反应体系置于20～50℃温度范围的恒温装置或环境中，孵育20min后取出；用上样缓冲液对反应产物进行稀释，将侧向层析试纸条置于稀释的反应产物中，室温孵育5～10min取出，进行结果判定；

(3)结果判定：当侧向层析试纸上只有质控线显色时，结果为阴性；当侧向层析试纸上质控线和检测线同时显色时，结果为阳性，说明检测的样品中存在H7N9核酸片段；当侧向层析试纸上质控线不显色时，说明本次检测无效，需要重新检测。

上述方案中，所述RT-RPA总反应体系50μL，包括25～29.5μL反应缓冲液、10μmol/L正向引物1～2.4μL、10μmol/L反向引物1～2.4μL、10μmol/L探针0.1～0.6μL、待测模板0.5～10μL、280mmol/L醋酸镁2.5μL、剩余无菌水补足。

本发明所述基于上述试剂盒快速检测判断H7N9禽流感病毒的方法的检测原理为：本发明分别以H7N9禽流感病毒的HA和NA基因中的保守序列为靶标，设计了RPA反应引物对，通过筛选，选出可特异扩增的最优引物组合；通过带有标记物(如Biotin标记)的引物对和带有标记物(如FAM标记)的探针对待测模板进行等温扩增，扩增出的产物同时带有标记物(Biotin和FAM标记)。侧向层析试纸前端包被有带标记物抗体修饰(如FAM抗体修饰)的纳米金粒子，检测线上包被标记物抗体(Biotin抗体)，当试纸条插入稀释的反应扩增产物时，带标记物(Biotin和FAM标记物)的扩增产物通过抗原抗体结合作用与带有标记物抗体修饰(如FAM抗体修饰)的金标粒子结合，并通过层析作用沿试纸条上行，在检测线上形成生物素抗体-核酸金标粒子复合物并显色，质控线上包被的抗体能与带标记物抗体修饰(如FAM抗体)的金标粒子结合显色。当质控线和检测线同时显色，说明待测模板中存在H7N9的核酸片段。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了两个用于检测H7N9禽流感病毒的遗传标记物，并在此基础上建立了RT-RPA扩增检测方法，所述检测方法的最低检出量为200copies/反应，特异性和灵敏度均优于传统RT-PCR；且整个扩增反应在20℃～50℃范围的恒温条件下进行，20分钟即可完成反应，大大缩短了检测时间；

(2)本发明利用侧向层析试纸条对RPA的扩增产物进行可视化定性和半定量检测，结果读取方便；

(3)本发明的整个反应和检测过程均无需依赖特殊仪器，非常适合基层和疫情爆发区域对人禽流感H7N9现场检测的需求，有助于对人禽流感H7N9疫情的长期监测和及时防控。

附图说明

图1为H7N9禽流感RT-RPA扩增引物的优化；其中，M-标准DNA分子量DL500，1-SEQID N0.3/SEQ ID N0.4，2-SEQ ID N0.6/SEQ ID N0.7，3-阴性对照。

图2为H7N9禽流感RT-RPA扩增温度的优化；其中，1-20℃；2-25℃；3-30℃；4-35℃5-40℃；6-45℃；7-50℃。

图3为检测H7N9禽流感病毒HA基因的引物对和探针特异性检测结果；其中，1-新型甲H1N1pdm09流感病毒；2-人季节性H3N2流感病毒；3-B型流感病毒Victoria系；4-B型流感病毒Yamagata系；5-H5N6禽流感病毒；6-H7N9禽流感病毒；7-H9N2禽流感病毒。

图4为检测H7N9禽流感病毒NA基因的引物对和探针特异性检测结果；其中，1-新型甲H1N1pdm09；2-人季节性H3N2；3-B型流感Victoria系；4-B型流感Yamagata系；5-H5N6禽流感病毒；6-H7N9禽流感病毒；7-H9N2禽流感病毒。

图5为检测H7N9禽流感病毒HA基因的引物对和探针灵敏性检测结果；其中，1-2×10⁵copies/反应；2-2×10⁴copies/反应；3-2×10³copies/反应；4-2×10²copies/反应；5-2×10¹copies/反应；6-2×10⁰copies/反应。

图6为检测H7N9禽流感病毒NA基因的引物对和探针灵敏性检测结果；其中，1-2×10⁵copies/反应；2-2×10⁴copies/反应；3-2×10³copies/反应；4-2×10²copies/反应；5-2×10¹copies/反应；6-2×10⁰copies/反应。

图7为对疑似感染H7N9临床患者咽拭子样本的检测结果；其中1-11号为疑似感染H7N9临床患者咽拭子样本；12号为阴性对照。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1引物的设计与优化

RPA扩增的关键在于引物的设计，常规PCR所用引物长度一般在18～25bp，且有多款成熟的商业软件可用于引物设计。而RPA引物长度一般在30～35bp，探针长度为46～52bp(一般5’端到THF位点至少30bp，THF位点到3’端至少15bp)，因为引物和探针长度相对较长，还要考虑引物探针的GC含量，以及可能影响实验效果的二级结构和引物二聚体等情况，而且目前尚无用于RPA引物设计的软件，因此，对RPA引物探针的设计和筛选有较高的要求。

另外，在进行RPA引物设计时，靶标区域的选择也非常关键。本发明通过对GIDAIDEpi flu数据库中已报道的H7N9禽流感病毒的HA和NA基因序列分别进行比对，找到特异性的保守靶序列，以数据库中的H7N9禽流感病毒A/Anhui/1/2013(Isolate ID：EPI_ISL_138739)的HA序列(Accession number：EPI439507)和NA序列(Accession number：EPI439509)为参照，分别设计了4条保守引物，见表1和表2。

针对H7N9禽流感病毒的HA基因的保守区设计了一系列的RPA引物，具体见表1。

表1针对H7N9禽流感病毒的HA基因的保守区设计的RPA引物

针对H7N9禽流感病毒的NA基因的保守区设计了一系列的RPA引物，具体见表2。

表2针对H7N9禽流感病毒的NA基因的保守区设计的RPA引物

利用RPA扩增反应对表1和表2中的引物进行筛选，提取H7N9禽流感病毒的RNA，用阳性质控质粒对RNA进行定量，用无菌双蒸水稀释到10⁵copies/μL，将其作为模板，进行RPA检测，具体步骤如下：按照TwistDX公司

nfo试剂盒操作说明进行，RPA冻干粉末中加入RPA反应缓冲液25μL，10μmol/L正向引物2.4μL，10μmol/L反向引物2.4μL，模板RNA 2μL，dd H₂O 15.7μL，漩涡混匀离心；加入280mmol/L醋酸镁2.5μL，颠倒混匀，离心，反应体系置于37℃恒温金属浴中反应20min，反应结束后进行2％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，观察结果。

引物的优选结果：通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果发现，引物对H2(H7-FP2/H7-RP2)对HA基因的扩增效果最好，引物对N4(N9-FP8/N9-RP8)对NA基因的扩增效果最好(如图1所示)。因此，选择引物对H2(H7-FP2/H7-RP2)和N4(N9-FP8/N9-RP8)进行后续的优化、特异性和敏感性试验。

实施例2RT-RPA反应温度优化

采用引物对H2(H7-FP2/H7-RP2)和N4(N9-FP8/N9-RP8)对H7N9禽流感病毒进行RPA检测，具体操作步骤与实施例1大体一致，不同之处在于：将反应体系置于20℃～50℃的恒温金属浴中反应20min。反应结束后，将反应产物加上样缓冲液(含0.05％Tween-20的10mMTris盐缓冲液)按20倍稀释，将侧向层析试纸条置于200μL的稀释产物中反应5～10min，取出，即可通过肉眼直接读取结果。

结果如图2所示，反应温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃时，RT-RPA反应均能发生，且反应温度为40℃时的反应效率最高。本发明优化后的反应条件，逆转录和RPA扩增同在一个温度下进行，操作更简便。

实施例3特异性验证

为了验证本发明检测试剂盒及其检测方法的特异性，分别提取了新型甲H1N1pdm09流感病毒、人季节性H3N2流感病毒、B型流感病毒Victoria系、B型流感病毒Yamagata系、H5N6禽流感病毒、H7N9禽流感病毒、H9N2禽流感病毒的RNA做模板，进行RT-RPA反应，反应产物用侧向层析试纸条读取结果。实验结果如图3、图4所示，只有H7N9禽流感病毒为阳性，其他均为阴性，说明本发明的RPA引物和检测探针特异性好，不与其他相关性病毒发生交叉反应。

实施例4灵敏性验证

为了验证本检测试剂盒及其检测方法的灵敏性，将提取H7N9禽流感病毒RNA定量，按10倍梯度进行稀释，进行RT-RPA反应，反应产物用侧向层析试纸条读取结果。实验结果如图5、图6所示，本发明的探针检测灵敏度均为200copies/反应。

实施例5临床样本检测

收集疑似感染H7N9临床患者咽拭子样本11份和密接人群咽拭子样本10份，置于装有5mL样本保存液的病毒采集管中，漩涡混匀，参照RNA提取试剂盒说明书提取待检样本中的RNA。采用上海之江生物科技股份有限公司生产的禽流感病毒H7亚型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)作为比对方法。用荧光PCR法和本专利方法，同时检测临床样本。

根据比对试剂盒内说明书判定标准，检测到FAM荧光信号且Ct值小于38，可判定为禽流感H7亚型核酸阳性。结果显示，采用荧光PCR法检测疑似感染H7N9临床患者咽拭子样本中有8份样本为禽流感H7亚型核酸阳性，10份密接人群咽拭子样本均为禽流感H7亚型核酸阴性。采用本专利检测方法，在感染H7N9临床患者咽拭子样本中检出8份阳性患者样本(实验结果如图7所示)，检出患者编号与比对荧光PCR试剂盒检出的阳性患者编号一致，密接人群咽拭子样本检测结果为阴性，两种方法检测符合一致率达100％。

综上所述，本发明中的方法可以快速、准确检测出样本中的禽流感H7N9病毒，满足了当前对现场快速检测的禽流感H7N9病毒的需求。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>湖北省疾病预防控制中心

<120>一种基于等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒及其应用

<160>8

<210> 1

<211>326bp

<212> DNA

<213>H7N9禽流感病毒HA基因片段

<400> 1

agcaatggag aaccagcata caattgatct ggctgattca gaaatggaca aactgtatga 60

acgggtgaaa agacagctga gagagaatgc tgaagaggat ggcactggtt gctttgaaat 120

atttcacaag tgtgatgatg actgtatggc cagtattaga aacaacacct atgatcacag 180

aaaatacagg gaagaggcaa tgcaaaatag aatacagatt gacccagtca agctaagcag 240

cggctacaaa gatgtgatac tttggtttag cctcggggca tcatgtttca tacttctagc 300

cattgtaatg ggccttgtct tcatat 326

<210> 2

<211>290bp

<212> DNA

<213>H7N9禽流感病毒NA基因片段

<400> 2

aacataggac tgcatctaaa accgggctgc aattgctcac actcacaacc tgaaacaacc 60

aacacaagcc aaacaataat aaacaactat tataatgaaa caaacatcac caacatccaa 120

atggaagaga gaacaagcag gaatttcaat aacttaacta aagggctctg tactataaat 180

tcatggcaca tatatgggaa agacaatgca gtaagaattg gagagagctc ggatgtttta 240

gtcacaagag aaccctatgt ttcatgcgac ccagatgaat gcaggttcta 290

<210> 3

<211>33bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

agcaatggag aaccagcata caattgatct ggc 33

<210> 4

<211>30bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

taaaccaaag tatcacatct ttgtagccgc 30

<210> 5

<211>46bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtca 46

<210> 6

<211>29bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

aacatcacca acatccaaat ggaagagag 29

<210> 7

<211>32bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tagaacctgc attcatctgg gtcgcatgaa ac 32

<210> 8

<211>46bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

taaagggctc tgtactataa attcatggca catatatggg aaagac 46

Claims

1.用于检测H7N9禽流感病毒遗传标记物的引物对和探针，其特征在于，包括用于扩增HA基因片段和NA基因片段的引物对和探针，其中HA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述用于扩增SEQ ID NO.1所示的HA基因片段的RPA引物对和探针具有如下序列：正向引物序列如SEQ ID N0.3所示，反向引物序列如SEQ ID N0.4所示，探针序列如SEQ ID N0.5所示、且第31个碱基用四氢呋喃碱基；所述用于扩增SEQ ID NO.2所示的NA基因片段的RPA引物对及探针具有如下序列：正向引物序列如SEQ ID N0.6所示，反向引物序列如SEQ ID N0.7所示，探针序列如SEQ ID N0.8所示、且第31个碱基用四氢呋喃碱基代替。

2.权利要求1所述引物对和探针在制备用于检测H7N9禽流感病毒试剂盒中的应用。

3.基于等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲溶液、RPA引物对、探针、RPA冻干粉末、醋酸镁溶液、无菌水和阳性对照；所述RPA引物对和探针用于扩增如SEQ ID NO.1所示的HA基因片段、如SEQ ID NO.2所示的NA基因片段，所述用于扩增SEQ ID NO.1所示的HA基因片段的RPA引物对和探针具有如下序列：正向引物序列如SEQID N0.3所示，反向引物序列如SEQ ID N0.4所示，探针序列如SEQ IDN0.5所示、且第31个碱基用四氢呋喃碱基；所述用于扩增SEQ ID NO.2所示的NA基因片段的RPA引物对及探针具有如下序列：正向引物序列如SEQ ID N0.6所示，反向引物序列如SEQ ID N0.7所示，探针序列如SEQ ID N0.8所示、且第31个碱基用四氢呋喃碱基代替。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述序列如SEQ ID N0.4所示的反向引物的5’端和所述序列如SEQ ID N0.5所示的探针的5’端采用两种不同的标记物标记；所述序列如SEQ ID N0.7所示的反向引物的5’端和所述序列如SEQ ID N0.8所示的探针的5’端采用两种不同的标记物标记，所述序列如SEQ ID N0.5所示的探针和所述序列如SEQ IDN0.8所示的探针的3’端均采用封闭基团进行封闭。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物选自Biotin标记、DIG标记、FITC标记、或FAM标记；所述封闭基团选自SpacerC3、磷酸盐、或双脱氧核苷酸。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA冻干粉末包括噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合酶、逆转录酶和dNTPS；所述阳性对照为重组质粒pGEMT，浓度为10⁵copies/反应～10²copies/反应。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧向层析试纸条、上样缓冲液；所述侧向层析试纸条的前端包被有探针5’端标记物抗体修饰的纳米金粒子，检测线上包被有反向引物5’端标记物抗体，质控线包被有可以与前端所述纳米金粒子结合显色的固定抗体。

8.权利要求3～7任一项所述试剂盒在制备快速检测判断H7N9禽流感病毒的产品中的应用，所述应用方法包括如下步骤：(1)RT-RPA体系配置：将RPA冻干粉末加入到反应缓冲液中，再加入正向引物、反向引物、探针、待测模板，加入无菌水，混匀离心，再加入醋酸镁，颠倒混匀，离心；(2)将RT-RPA反应体系置于20～50℃温度范围的恒温装置或环境中，孵育20min后取出；用上样缓冲液对反应产物进行稀释，将侧向层析试纸条置于稀释的反应产物中，室温孵育5～10min取出，进行结果判定；(3)结果判定：当侧向层析试纸上只有质控线显色时，结果为阴性；当侧向层析试纸上质控线和检测线同时显色时，结果为阳性，说明检测的样品中存在H7N9核酸片段；当侧向层析试纸上质控线不显色时，说明本次检测无效，需要重新检测。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，RT-RPA总反应体系50μL，包括25～29.5μL溶解有RPA冻干粉末的反应缓冲液、10μmol/L正向引物1～2.4μL、10μmol/L反向引物1～2.4μL、10μmol/L探针0.1～0.6μL、待测模板0.5～10μL、280mmol/L醋酸镁2.5μL、剩余无菌水补足。