CN103305634A

CN103305634A - H7n9禽流感病毒等温扩增快速检测方法

Info

Publication number: CN103305634A
Application number: CN2013102388534A
Authority: CN
Inventors: 王乃福; 赵祥平; 张立怀; 吴冬雪; 王玉玲; 董志珍; 郑文杰; 黄晨; 王建华; 陈本龙
Original assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Current assignee: Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-06-05
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)检测H7N9亚型禽流感病毒的方法，用于食品及原料、环境样本、医学样本及卫生防疫领域禽流感病毒的检测。其技术方案是以禽流感基因组中编码HA和NA的区域基因序列为目的序列，设计特异性引物，优化反应体系，进行目的基因特异性扩增，本发明只需一个恒温装置，不需要模板的热变性、长时间温度循环，而且可以直接观察结果，具有低成本、高效率、操作简单的特点。本发明建立的H7N9亚型禽流感病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，为H7N9亚型禽流感病毒检测提供了一种新的技术与方法。

Description

H7N9禽流感病毒等温扩增快速检测方法

技术领域

本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用环介导等温扩增法来检测流感病毒，特别是H7N9禽流感病毒的检测方法。

背景技术

H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的禽类疾病，原本属于低致病性流感病毒，长期以来仅有其来源于野鸟的报道；但2013年3月下旬，H7N9亚型禽流感病毒跨越种属，人类感染H7N9病毒的患者在上海、江苏，陆续又在中国多个省份被发现，这是该病毒全球首次感染人类。截止5月11日，全国内地共报告人感染H7N9禽流感确诊病例130例，其中死亡人数33人，H7N9禽流感已经成为我国及周边国家和地区公共卫生机制新的考验。同时，由于H7N9禽流感的爆发，国内家禽养殖业受到巨大影响，周边国家越南和印尼已经禁止从我国进口家禽，国家和家禽养殖户蒙受巨额经济损失。据统计，此次人感染H7N9禽流感病毒出现前，全球共检出25株H7N9亚型流感病毒，均来自野鸟，从未在家禽中发现，因此快速、准确的检测家禽样品中是否含有H7N9亚型禽流感病毒将有助于控制H7N9禽流感在人群间的传播，并为我国的家禽养殖业动物及其产品的正常贸易提供强有力的技术支持。

通常，禽流感的诊断主要依靠流行病学与临床诊断，确诊依赖于病毒分离、病毒抗原与血清抗体等监测。病毒分离和血凝抑制试验是检测AIV和鉴定其亚型的标准方法，但费时费力。此次H7N9禽流感病毒在人群间传播，国家流感中心及北京出入境检验检疫局分别建立了用于H7N9禽流感病毒检测的荧光定量PCR检测方法，该方法快速，灵敏度高，但该方法对人员素质及设备要求都很高，难于在基层诊断实验室普及应用。Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，其特点是在等温条件(65℃左右)下作用60min左右即可完成核酸扩增反应，更为重要的是此方法不需要贵重的仪器和试剂，在水浴锅中就能完成反应，特别适合在野外现场和基层部门应用。近年来，LAMP法已被成功地用于诊断发生于人类和动物的病毒性疾病，成为检测多种致病病毒的有效工具。我们依据H7N9亚型禽流感病毒的HA基因和NA基因序列保守区域设计了LAMP引物，以所构建的阳性质粒为模板，建立了一种H7N9禽流感病毒的LAMP早期快速检测方法。

发明内容

为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过实验检测，终于探索出一种运用环介导等温扩增法检测流感病毒的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本、适合在野外现场和基层部门应用等特点。

本发明的目的是提供了一种应用环介导等温扩增法检测禽流感病毒的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一套检验H7N9禽流感病毒的引物，其特征在于：通过环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的引物组，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，上述引物可以检测到至少10个拷贝的禽流感病毒。

上述引物在制备用于检验H7N9禽流感病毒的试剂盒中的应用。

一种用于检验H7N9禽流感病毒的试剂盒，包括：

(1)环介导等温扩增反应试剂，包括扩增体系中各成分的组成；

(2)按照比例混合SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

(3)阳性标本对照、阴性标本对照；

(4)使用说明书。

上述试剂盒中还包括SYBR Green I染料，加入到产物中可以在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。

利用上述试剂盒进行环介导等温扩增检测H7N9禽流感病毒方法，包括：

(1)RNA的提取及cDNA的制备

取样本，将病毒灭活后，进行反转录反应，得到cDNA，-20℃备用；

(2)H7N9亚型禽流感病毒HA或NA基因区的检测

2μL cDNA样品、5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、2μL Bst DNA聚合酶(8000U/L)、5μL dNTP(10mmol/L)、3μL Betaine(5mol/L)、6μL Mg SO4(25mmol/L)、对应于HA基因的引物如权利要求1所述的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8各4μL、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6各0.5μL、6μLH2O，混匀；

(3)恒温水浴或热块扩增或任何保温材料60℃～65℃，30min～90min；

(4)扩增产物采用荧光染料法同步检测。

上述方法能够检测到至少10个拷贝的禽流感病毒。

该方法在检测食品及原料、环境样本中H7N9禽流感病毒方面的用途。可以在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检测、卫生评价等方面。

附图说明

图1HA基因和NA基因扩增图(1，2为HA基因；3，100bp Marker；4，DL2000；5，6为NA基因)；

图2HA和NA重组质粒酶切图(1，DL15000；2，DL2000；3，HA PCR结果；4，HA重组质粒酶切；5，DL2000；6，7NA重组质粒酶切；8，DL15000)；

图3LAMP扩增电泳结果(1，100bp Marker；2，3HA基因；4，HA阴性对照；5，100bpMarker；6，NA基因；7，NA阴性对照)；

图4AMP扩增可见光结果(1，HA；2，HA阴性对照；3，NA；4NA阴性对照)；

图5AMP扩增紫外光结果(1，HA；2，HA阴性对照；3，NA；4NA阴性对照)；

图6HA基因检测灵敏度(1，Marker；2，106，；3，105；4，104；5，103；6，102；7，101；8，100；9，阴性对照)；

图7NA基因检测灵敏度(1，Marker；2，106，；3，105；4，104；5，103；6，102；7，101；8，100；9，阴性对照)；

图8特异性试验(1、8、9、16，Marker；2，H7N9(HA)；10，H7N9(NA)；3、11，H1N1；4、12，H3N2；5、13，H5N1；6、14，新城疫；7、15，阴性对照)；

图9荧光定量PCR在H7N9禽流感病毒检测中的灵敏度测试.

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的分子生物学常规技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。

材料和方法

1.1材料

禽流感H7N9(安徽株)灭活病毒由国家流感中心舒跃龙教授惠赠；总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、Bst DNA聚合酶、M-MULV反转录酶、RNA酶抑制剂购自NEB公司；质粒小量提取试剂盒、大肠杆菌TOP10感受态细胞购自TIANGEN公司；Betaine(甜菜碱)、MgSO4购自Sigma公司。

1.2引物的设计与合成

根据登录于GISAID数据库的H7N9禽流感HA基因和NA基因序列，应用生物学软件进行序列比对，在HA和NA的保守区利用PrimerExplorer V4设计了2对引物(外引物和内引物)。荧光定量PCR所用引物和探针为国家流感中心公布，所有探针、引物的合成修饰由英俊公司完成，序列见表1。

表1引物和探针序列

1.3RNA的提取及cDNA的制备

取经DEPC水处理过的EP管，加入1mL TRIzol和200μL灭活病毒液，混匀后室温放置5min；加入200μL氯仿，用力摇晃30s，室温静置3min，4℃离心15min，得到分层液；取上层液移入干净的EP管，加入500μL异丙醇，-20℃静置30min，4℃离心15min；移去上层悬液；加入1mL 75％的DEPC乙醇，涡旋振荡，4℃离心10min；去上清，空气中干燥5min；向试管中加入50μL DEPC水。参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录，得到cDNA，-20℃备用。

1.4阳性重组质粒的构建

利用针对H7N9禽流感HA基因和NA基因的特异性引物，将cDNA在50μL体系中进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T easy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，进行酶切鉴定，HA重组质粒用EcoR I，Not I双切，NA重组质粒用sfi I单切鉴定，选取阳性重组质粒进行测序，从而为检测提供阳性质粒，并利用此阳性质粒对LAMP方法进行优化。

1.5 H7N9亚型禽流感病毒的环介导等温扩增方法检测

1.5.1 H7N9亚型禽流感病毒HA基因区的检测

经过摸索和优化反应条件后，建立如下扩增反应体系：2μL cDNA样品、5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、2μL Bst DNA聚合酶(8000U/L)、5μL dNTP(10mmol/L)、3μL Betaine(5mol/L)、6μLMg SO4(25mmol/L)、对应于HA基因的引物FIP和BIP各4μL、F3和B3各0.5μL、6μLH2O。混匀，65℃，水浴1.5h。

1.5.2 H7N9亚型禽流感病毒NA基因区的检测

方法与HA基因区的检测相同，使用的引物为对应于NA基因区的四条特异性引物。

1.6扩增产物的检测

LAMP反应结束后，取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳；其余扩增产物采用荧光染料法同步检测，向扩增管中加入2μL 50倍稀释的SYBR Green I染料，在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。回收HA和NA基因的阳性产物，并以此为模板进行普通PCR扩增，扩增产物送上海生工测序。

1.7 H7N9禽流感病毒HA和NA基因的检测灵敏度

取阳性质粒DNA，经紫外分光光度计测定浓度，10倍系列稀释后，进行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的灵敏度检测试验。具体试验方案参照LAMP的常规操作程序进行。

1.8特异性试验

分别以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒(NDV)核酸作为待测样品，以所提取的H7N9亚型禽流感病毒质粒DNA为阳性对照，以经DEPC处理的水为阴性对照，检验方法的特异性。

1.9 H7N9禽流感病毒的荧光定量PCR检测

H7N9亚型禽流感病毒核酸的定量检测按国家流感中心发布的“H7N9禽流感病毒荧光定量检测标准操作规程”内容进行。同时，进行LAMP检测作为平行对照，对结果进行分析和比较。

实施例1

H7N9亚型禽流感病毒HA基因和NA基因的扩增

取灭活病毒液，提取病毒基因组后，参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录，得到cDNA，利用特异性引物对H7N9亚型禽流感病毒HA基因和NA基因进行扩增，结果如图1所示，经扩增后得到HA基因1683bp，NA基因1398bp，与理论扩增值相符。

实施例2

阳性重组质粒的鉴定

将扩增后的HA和NA基因，克隆到pGEM-T easy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，进行酶切鉴定，HA重组质粒用EcoR I，NotI双切，NA重组质粒用sfi I单切，结果如图2所示，构建的HA和NA重组质粒经酶切后均得到与理论相符的目的条带。取构建好的阳性质粒测序，测序结果显示扩增序列与登录于GISAID数据库的H7N9序列一致性为100％，表明所构建的质粒确实含有目的基因片段，可以作为阳性质粒使用。

实施例3

H7N9亚型禽流感病毒LAMP方法的检测

1.1凝胶电泳结果观察

经过摸索和优化反应条件后，建立针对H7N9亚型禽流感病毒HA基因区和NA基因区的LAMP检测方法，检测结果如图3所示，HA基因区(2、3)和NA基因区(6)的扩增结果中核酸电泳条带呈阶梯状分布，与理论结果相符，阴性对照(4、7)未见特异性产物出现。

1.2染料法结果观察

LAMP方法扩增产物中加入2μL50倍稀释的SYBR Green I染料，在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。图4所示，HA和NA基因阳性扩增管在可见光下呈黄绿色，阴性对照为橘红色。图5中，HA和NA基因阳性扩增管在紫外光下可见荧光产生，阴性对照管内无荧光产生。回收HA和NA基因的阳性产物，进行普通PCR扩增后测序得知，扩增序列与GISAID数据库中的H7N9序列一致，表明LAMP方法特异性的扩增检测H7N9病毒的HA基因和NA基因。

实施例4

HA和NA基因的灵敏度试验

取阳性质粒DNA，经紫外分光光度计测定浓度，10倍系列稀释后，进行H7N9禽流感病毒HA和NA基因的灵敏度检测试验。图6和图7中所示H7N9禽流感病毒HA和NA基因10拷贝以上的稀释度均显示了典型的LAMP扩增带型，说明该检测方法的灵敏度可达到10个拷贝的水平。

实施例5

特异性试验

分别以H1型、H3型、H5型禽流感病毒和新城疫病毒(NDV)核酸作为待测样品，以所提取的H7N9亚型禽流感病毒质粒DNA为阳性对照，以经DEPC处理的水为阴性对照，检验方法的特异性。结果如图8所示，阳性对照和阴性对照均成立，以H7N9亚型禽流感病毒所构建的质粒DNA呈阳性，其他试验样品呈阴性，表明试验所用引物对H7N9亚型禽流感病毒特异性良好。

实施例6

荧光定量PCR与所建立的LAMP方法的对比

分别以荧光定量PCR方法和LAMP方法检测构建好的阳性重组质粒，荧光定量PCR方法检测结果如图9所示，灵敏度达到10个拷贝水平，与所建立的LAMP方法检测灵敏度相同。

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新的核酸等温扩增技术，原理是在目的基因片段上的多个位点上设计4条或6条引物，通常只要4条引物即可完成目的基因的扩增，如果加入另外两条环引物，可以有效的加速整个反应过程，但反应体系内引物的增多也会增加引物二聚体的形成。LAMP反应结果判别方法多样，目前常用的有电泳法、荧光法、浊度法和钙黄绿素法。浊度法和钙黄绿素法是基于LAMP反应产生的大量焦磷酸盐副产物进行检测的方法，因此这2种方法均存在一定程度的背景干扰，且干扰强度随反应时间延长而增加；电泳法和荧光法利用双链嵌合染料直接检测扩增产物，因此背景更低，其中荧光法的阳性、阴性可用肉眼区分，对操作人员的技术要求低，更适合于现场快速检测。

本文采用LAMP技术建立了检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的检测方法，通过与中国疾控中心推荐的H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR法相比较，两种方法的检测灵敏度相当，将106复制的病毒量质粒进行10倍系列稀释后，实时RT-PCR检测和本文建立的LAMP方法检测灵敏度均为10个拷贝；从检测时间上看LAMP完成1次检测可在1.5h内完成，而实时RT-PCR法则需要3h。从所需仪器上看实时RT-PCR需要荧光定量PCR仪，而LAMP只需恒温水浴锅。

综上所述，本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检测、卫生评价、临床诊断等方面，为H7N9亚型禽流感病毒检测提供了一种新的技术与方法。

序列表

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>H7N9禽流感病毒等温扩增快速检测方法

<160>8

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

AGCATACAATTGATCTGGCT

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ATTCTATTTTGCATTGCCTCT

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GCCATCTTCTTCAGCATTCTCTCTAGAAATGGACAAACTGTACG

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CAAGTGTGATGATGACTGTATGGCTCCCTGTATTTGCTGTGATC

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GATGGGGCTAACACTTGG

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ATAGCAGTCCCCTTCAGC

<210>7

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

TCAATGCATTTGGCACTTTTAACATTAGGGAGGACAATAAGCAC

<210>8

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

TAGATCAAAGCCCATTCAAGGTCGTCCATGAAAGATCCACTGTA

Claims

1.一套检验H7N9禽流感病毒的引物，其特征在于：通过环介导等温扩增技术检测H7N9禽流感病毒的引物组，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，上述引物可以检测到至少10个拷贝的禽流感病毒。

2.权利要求1所述的引物在制备用于检验H7N9禽流感病毒的试剂盒中的应用。

3.一种用于检验H7N9禽流感病毒的试剂盒，包括：

(2)按照比例混合的权利要求1所述的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8。

(3)阳性标本对照、阴性标本对照；

(4)使用说明书。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中还包括SYBR Green I染料，加入到产物中可以在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。

5.利用权利要求1的引物或权利要求3的试剂盒进行环介导等温扩增检测H7N9禽流感病毒方法，包括：

(1)RNA的提取及cDNA的制备

(2)H7N9亚型禽流感病毒HA或NA基因区的检测

2μL cDNA样品、5μL Bst DNA聚合酶缓冲液(10×)、2μL Bst DNA聚合酶(8000U/L)、5μL dNTP(10mmol/L)、3μL Betaine(5mol/L)、6μL Mg SO4(25mmol/L)、对应于H A基因的引物如权利要求1所述的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8各4μL、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6各0.5μL、6μL H2O，混匀；

(4)扩增产物采用荧光染料法同步检测。

6.如权利要求5所述方法能够检测到至少10个拷贝的禽流感病毒。

7.如权利要求5所述方法在检测食品及原料、环境样本中H7N9禽流感病毒方面的用途。

8.如权利要求5所述方法可以在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检测、卫生评价等方面。