CN103397110B - 施马伦贝格病毒等温扩增快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)检测施马伦贝格病毒的方法，用于食品及原料、环境样本、医学样本及卫生防疫领域施马伦贝格病毒的检测。其技术方案是以施马伦贝格病毒基因组中编码S段区域基因序列为目的序列，设计特异性引物，优化反应体系，进行目的基因特异性扩增，本发明只需一个恒温装置，不需要模板的热变性、长时间温度循环，而且可以直接观察结果，具有低成本、高效率、操作简单的特点。本发明建立的施马伦贝格病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，为施马伦贝格病毒检测提供了一种新的技术与方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检验技术，具体地说是运用环介导等温扩增法来检测施马伦贝格病毒。
背景技术
施马伦贝格病毒(Schmallenbergvirus，SBV)与赤羽病病毒(Akabanediseasevirus)和加州脑炎病毒群(Californiaencephalitisviruses)同属于布尼病毒科布尼病毒属，于2011年11月在德国北莱茵-威斯特法伦州施马伦贝格小镇被发现。该病毒能引起牛、绵羊和山羊的成年动物中度病症，表现为产奶量下降、发烧、腹泻等，引起流产及出生缺陷，目前施马伦贝格病已蔓延到德国、荷兰、比利时、英国、法国、卢森堡和意大利等欧洲国家，该病传播速度较快，对养殖业的危害巨大，已经引起了欧盟和世界动物卫生组织(OIE)的重视，因此快速、准确的检测家畜血清样品中是否含有施马伦贝格病毒将有助于控制施马伦贝格病毒的传播，并为我国的养殖业动物及其产品的正常贸易提供强有力的技术支持。
目前，施马伦贝格病毒的检测方法为中和试验及荧光定量RT-PCR。中和试验所需检测时间过长，费时费力；荧光定量RT-PCR对人员和设备要求较高，难于在基层实验室普及推广。
Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，其特点是在等温条件(65℃左右)下作用60min左右即可完成核酸扩增反应，更为重要的是此方法不需要贵重的仪器和试剂，在水浴锅中就能完成反应，特别适合在野外现场和基层部门应用。近年来，LAMP法已被成功地用于诊断发生于人类和动物的病毒性疾病，成为检测多种致病病毒的有效工具。我们建立了一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)检测施马伦贝格病毒的方法，用于食品及原料、环境样本、医学样本及卫生防疫领域施马伦贝格病毒的检测。其技术方案是以施马伦贝格病毒基因组中编码S段区域基因序列为目的序列，设计特异性引物，优化反应体系，进行目的基因特异性扩增，本发明只需一个恒温装置，不需要模板的热变性、长时间温度循环，而且可以直接观察结果，具有低成本、高效率、操作简单的特点。
本发明建立的施马伦贝格病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，为施马伦贝格病毒检测提供了一种新的技术与方法。
发明内容
为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过实验检测，终于探索出一种运用环介导等温扩增法检测施马伦贝格病毒的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本、适合在野外现场和基层部门应用等特点。
本发明的目的是提供了一种应用环介导等温扩增法检测施马伦贝格病毒的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一套检测施马伦贝格病毒的引物，其特征在于：通过环介导等温扩增技术检测施马伦贝格病毒的引物组，序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4，上述引物可以检测到至少10个拷贝的施马伦贝格病毒。
上述引物在制备用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒中的应用。
一种用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒，包括：
(1)环介导等温扩增反应试剂，包括扩增体系中的反应缓冲液和反应酶的组成；
(2)按照比例混合SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4。
(3)阳性标本对照、阴性标本对照；
(4)使用说明书。
上述试剂盒中还包括SYBRGreenI染料，加入到产物中可以在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。
利用上述试剂盒进行环介导等温扩增检测施马伦贝格病毒方法，包括：
(1)RNA的提取及cDNA的制备
取样本，将病毒灭活后，进行反转录反应，得到cDNA，-20℃备用；
(2)施马伦贝格病毒S段基因区的检测
2μLcDNA样品、5μLBstDNA聚合酶缓冲液(10×)、2μLBstDNA聚合酶(8000U/L)、5μLdNTP(10mmol/L)、3μLBetaine(5mol/L)、6μLMgSO4(25mmol/L)、对应于S段基因的引物如权利要求1所述的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2各0.5μL、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4各4μL、18μLH2O，混匀；
(3)恒温水浴或热块扩增或任何保温材料60℃～65℃，30min～90min；
(4)扩增产物采用荧光染料法同步检测。
上述方法能够检测到至少10个拷贝的施马伦贝格病毒。
该方法在检测食品及原料、环境样本、进境奶牛血清样品中施马伦贝格病毒方面的用途。可以在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检测、卫生评价等方面。
附图说明
图1施马伦贝格病毒S段基因扩增图(1，HA基因；2和3为S基因)；
图2S段基因重组质粒酶切图(1，DL2000；2和3为S基因重组质粒酶切)；
图3LAMP扩增电泳结果(1，100bpMarker；2，S基因；3，阴性对照)；
图4LAMP扩增可见光结果(1，阴性对照；2，S基因)；
图5LAMP扩增紫外光结果(1，S基因；2，阴性对照)；
图6S基因检测灵敏度(1，100bpMarker；2，106，；3，105；4，104；5，103；6，102；7，101；8，100；9，阴性对照)；
图7特异性试验(1、8，100bpMarker；2，S基因；3，赤羽病毒；4，牛病毒性腹泻病毒；5，口蹄疫病毒；；6，牛白血病病毒；7，阴性对照)；
图8荧光定量PCR在施马伦贝格病毒检测中的灵敏度测试。
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的分子生物学常规技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。
材料和方法
1.1材料
施马伦贝格病毒S段基因由英俊生物制品公司合成；总RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、BstDNA聚合酶、M-MULV反转录酶、RNA酶抑制剂购自NEB公司；质粒小量提取试剂盒、大肠杆菌TOPl0感受态细胞购自TIANGEN公司；Betaine(甜菜碱)、MgSO4购自Sigma公司。
1.2引物的设计与合成
根据登录于Genebank数据库的施马伦贝格病毒S段基因序列，应用生物学软件进行序列比对，在S段基因的保守区利用PrimerExplorerV4设计了2对引物(外引物和内引物)。荧光定量PCR所用引物和探针为Bilk等2012年发表的文章”OrgandistributionofSchmallenbergvirusRNAinmalformednewborns”中公布，所有探针、引物的合成修饰由英俊公司完成，序列见表1。
表1引物和探针序列
1.3RNA的提取及cDNA的制备
取经DEPC水处理过的EP管，加入1mLTRIzol和200μL病毒液，混匀后室温放置5min；加入200μL氯仿，用力摇晃30s，室温静置3min，4℃离心15min，得到分层液；取上层液移入干净的EP管，加入500μL异丙醇，-20℃静置30min，4℃离心15min；移去上层悬液；加入1mL75％的DEPC乙醇，涡旋振荡，4℃离心10min；去上清，空气中干燥5min；向试管中加入50μLDEPC水。参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录，得到cDNA，-20℃备用。
1.4阳性重组质粒的构建
利用针对施马伦贝格病毒S段基因的特异性引物，将cDNA在50μL体系中进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-Teasy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，进行酶切鉴定，选取阳性重组质粒进行测序，从而为检测提供阳性质粒，并利用此阳性质粒对LAMP方法进行优化。
1.5施马伦贝格病毒环介导等温扩增方法检测
经过摸索和优化反应条件后，建立如下扩增反应体系：2μLcDNA样品、5μLBstDNA聚合酶缓冲液(10×)、2μLBstDNA聚合酶(8000U/L)、5μLdNTP(10mmol/L)、3μLBetaine(5mol/L)、6μLMg-SO4(25mmol/L)、对应于S段基因的引物FIP(SEQIDNO：3)和BIP(SEQIDNO：4)各4μL、F3(SEQIDNO：1)和B3(SEQIDNO：2)各0.5μL、18μLH2O。混匀，65℃，水浴1.5h。
1.6扩增产物的检测
LAMP反应结束后，取5μL扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳；其余扩增产物采用荧光染料法同步检测，向扩增管中加入2μL50倍稀释的SYBRGreenI染料，在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。回收S段基因的阳性产物，并以此为模板进行普通PCR扩增，扩增产物送上海生工测序。
1.7施马伦贝格病毒S段基因的检测灵敏度
取阳性质粒DNA，经紫外分光光度计测定浓度，10倍系列稀释后，进行施马伦贝格病毒S段基因的灵敏度检测试验。具体试验方案参照LAMP的常规操作程序进行。
1.8特异性试验
分别以赤羽病毒、病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒和牛白血病病毒核酸作为待测样品，以所提取的施马伦贝格病毒S段基因质粒DNA为阳性对照，以经DEPC处理的水为阴性对照，检验方法的特异性。
1.9施马伦贝格病毒的荧光定量PCR检测
施马伦贝格病毒核酸的定量检测按Bilk等2012年发表的文章”OrgandistributionofSchmallenbergvirusRNAinmalformednewborns”中发布内容进行。同时，进行LAMP检测作为平行对照，对结果进行分析和比较。
实施例1
施马伦贝格病毒S段基因的扩增
取病毒液，提取病毒基因组后，参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录，得到cDNA，利用特异性引物对施马伦贝格病毒S段基因进行扩增，结果如图1所示，经扩增后得到S段基因702bp，与理论扩增值相符。
实施例2
阳性重组质粒的鉴定
将扩增后的S段基因，克隆到pGEM-Teasy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，从纯化扩增的重组菌中提取质粒，用BamHI和xhoI进行酶切鉴定，结果如图2所示，构建的S基因重组质粒经酶切后均得到与理论相符的目的条带。取构建好的阳性质粒测序，测序结果显示扩增序列与登录于Genebank数据库的施马伦贝格病毒S段基因序列一致性为100％，表明所构建的质粒确实含有目的基因片段，可以作为阳性质粒使用。
实施例3
施马伦贝格病毒LAMP方法的检测
1.1凝胶电泳结果观察
经过摸索和优化反应条件后，建立针对施马伦贝格病毒S段基因的LAMP检测方法，检测结果如图3所示，S段基因区的扩增结果中核酸电泳条带呈阶梯状分布，与理论结果相符，阴性对照未见特异性产物出现。
1.2染料法结果观察
LAMP方法扩增产物中加入2μL50倍稀释的SYBRGreenI染料，在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。图4所示，S段基因阳性扩增管在可见光下呈黄绿色，阴性对照为橘红色。图5中，S段基因阳性扩增管在紫外光下可见荧光产生，阴性对照管内无荧光产生。回收S段基因的阳性产物，进行普通PCR扩增后测序得知，扩增序列与Genebank数据库中的施马伦贝格病毒S段基因一致，表明LAMP方法特异性的扩增检测施马伦贝格病毒S段基因。
实施例4
施马伦贝格病毒S段基因的检测灵敏度
取阳性质粒DNA，经紫外分光光度计测定浓度，10倍系列稀释后，进行施马伦贝格病毒S段基因的灵敏度检测试验。图6中所示施马伦贝格病毒S段基因10拷贝以上的稀释度均显示了典型的LAMP扩增带型，说明该检测方法的灵敏度可达到10个拷贝的水平。
实施例5
特异性试验
分别以赤羽病毒、病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒和牛白血病病毒核酸作为待测样品，以所提取的施马伦贝格病毒S段基因质粒DNA为阳性对照，以经DEPC处理的水为阴性对照，检验方法的特异性。结果如图7所示，阳性对照和阴性对照均成立，以施马伦贝格病毒所构建的质粒DNA呈阳性，其他试验样品呈阴性，表明试验所用引物对施马伦贝格病毒特异性良好。
实施例6
荧光定量PCR与所建立的LAMP方法的对比
分别以荧光定量PCR方法和LAMP方法检测构建好的阳性重组质粒，荧光定量PCR方法检测结果如图8所示，灵敏度达到10个拷贝水平，与所建立的LAMP方法检测灵敏度相同。
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新的核酸等温扩增技术，原理是在目的基因片段上的多个位点上设计4条或6条引物，通常只要4条引物即可完成目的基因的扩增，如果加入另外两条环引物，可以有效的加速整个反应过程，但反应体系内引物的增多也会增加引物二聚体的形成。LAMP反应结果判别方法多样，目前常用的有电泳法、荧光法、浊度法和钙黄绿素法。浊度法和钙黄绿素法是基于LAMP反应产生的大量焦磷酸盐副产物进行检测的方法，因此这2种方法均存在一定程度的背景干扰，且干扰强度随反应时间延长而增加；电泳法和荧光法利用双链嵌合染料直接检测扩增产物，因此背景更低，其中荧光法的阳性、阴性可用肉眼区分，对操作人员的技术要求低，更适合于现场快速检测。
本文采用LAMP技术建立了检测施马伦贝格病毒核酸的检测方法，通过与Bilk等文章公布的施马伦贝格病毒实时荧光RT-PCR法相比较，两种方法的检测灵敏度相当，将106复制的病毒量质粒进行10倍系列稀释后，实时RT-PCR检测和本文建立的LAMP方法检测灵敏度均为10个拷贝；从检测时间上看LAMP完成1次检测可在1.5h内完成，而实时RT-PCR法则需要3h。从所需仪器上看实时RT-PCR需要荧光定量PCR仪，而LAMP只需恒温水浴锅。
综上所述，本研究建立的施马伦贝格病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点，可在基层或小型实验基地进行，同时也可应用于现场检测、卫生评价、临床诊断等方面，为施马伦贝格病毒检测提供了一种新的技术与方法。
Claims (7)
1.一套检测施马伦贝格病毒的引物，其特征在于：通过环介导等温扩增技术检测施马伦贝格病毒的引物组，序列如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示，上述引物能够检测到至少10个拷贝的施马伦贝格病毒。
2.权利要求1所述的引物在制备用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测施马伦贝格病毒的试剂盒，包括：
(1)环介导等温扩增反应试剂，包括扩增体系中的反应缓冲液和反应酶的组成；
(2)按照比例混合的如权利要求1所述的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4引物；
(3)阳性标本对照、阴性标本对照；
(4)使用说明书。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中还包括SYBRGreenI染料，用于加入到产物中在紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒的使用步骤如下：
(1)RNA的提取及cDNA的制备
取样本，将病毒灭活后，提取RNA，然后进行反转录反应，得到cDNA，-20℃备用；
(2)施马伦贝格病毒S基因区的检测
2μLcDNA样品、5μL10×BstDNA聚合酶缓冲液、2μL8000U/LBstDNA聚合酶、5μL10mmol/LdNTP、3μL5mol/LBetaine、6μL25mmol/LMgSO4、对应于S段基因的引物如权利要求1所述的引物SEQIDNO：1、SEQIDNO：2各0.5μL、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4各4μL、18μLH2O，混匀；
(3)恒温水浴或热块扩增或任何保温材料60℃～65℃，30min～90min；
(4)扩增产物采用荧光染料法同步检测。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于能够检测到至少10个拷贝的施马伦贝格病毒。
7.如权利要求5所述的试剂盒在检测环境样本、进境奶牛血清样品中施马伦贝格病毒中的用途。
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