CN113862397A - 检测新型阿卡斑病毒s基因的荧光定量rt-pcr引物及其试剂盒 - Google Patents

检测新型阿卡斑病毒s基因的荧光定量rt-pcr引物及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT‑PCR引物，包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，发明人还建立相应的荧光定量RT‑PCR检测方法并制备相应的荧光定量RT‑PCR试剂盒。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，而且检测灵敏度高，在标准品为1.0×101～1.0×109copies/μL范围内都有较好的线性关系。本发明检测限低至1.0×101copies/μL、检测范围宽至8个数量级，可以从拷贝数低的样品中快速、高效检测新型阿卡斑病毒，满足动物疫病监测、防控的需求。此外，本发明填补了目前临床新型阿卡斑病毒荧光定量检测方法空白，具有较好的应用前景。

Description

检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试 剂盒
技术领域
本发明属于新型阿卡斑病毒检测领域，尤其涉及检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒。
背景技术
阿卡斑病毒(Akabane vrius,AKAV)是阿卡斑病(又称赤羽病)病原，该病是一种虫媒性传染病，可导致牛、羊流产、死胎、胎儿畸形，并通过垂直传播，侵害胎儿中枢神经，造成积水性无脑综合症和新生胎儿关节弯曲；主要流行于热带、亚热带及温带地区，如亚洲、非洲的部分国家和大洋洲，并在我国多省广泛流行，严重威胁动物健康，因此被列为国际动物贸易的重点检疫对象、我国二类动物疫病和我国进口牛、羊必检7种疫病之一。
AKAV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群，为分节段单股负链RNA病毒，基因组全长12kb，由S、M、L共3个基因节段构成。S基因编码核衣壳蛋白，高度保守；M基因编码病毒囊膜糖蛋白，高度变异；L基因编码具有RNA酶活性的L蛋白，变异程度仅次于M蛋白。根据S、M基因进化分析，可将全球分离到的AKAV分为4个基因型，其中基因I型可分为Ia、Ib两个亚型。
除牛、羊外，AKAV可以感染马、水牛、骆驼，还可以在猪、兔、野牛、河马、长颈鹿、大象、大羚羊甚至灵长动物等十几种家畜、野生动物中检出AKAV抗体。2016年申请人在竹鼠中分离到新型阿卡斑病毒并申请中国专利(“用于检测新型竹鼠源阿卡斑病毒的RT-PCR引物及其试剂盒”，专利号ZL201710372744.X，公开日2017.05.24)，该研究首次证实AKAV可以感染啮齿动物，而且与传统毒株相比，该毒株发生一定程度变异，临床症状也有变化，说明新型阿卡斑病毒在宿主范围和致病力上发生改变。随后，云南、广东、湖南、海南等省相继在牛、蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊中发现与新型阿卡斑病毒同源性高的AKAV毒株，说明该毒株可能已在一定范围内流行，十分有必要加强对新型阿卡斑病毒的监控。
前述专利公开了采用普通RT-PCR检测新型阿卡斑病毒，其最低检测限109copies/μL。而蚊虫中病毒拷贝数往往较低，低于传统PCR方法检测限。因此，有必要开发一种敏感性更高的新型阿卡斑病毒检测技术。
孟锦昕等研究了阿卡斑病毒荧光定量RT-PCR检测(阿卡斑病毒qRT-PCR检测方法的建立及应用[J].云南畜牧兽医，2020(4)：1-4.)，其中使用的AKAV毒株为云南分离株，与前述专利及本发明使用毒株GXLCH16-70同属Ia亚型。然而，二者NSs蛋白氨基酸序列中存在两处氨基酸位点差异，分别是S22N、F70S，这两个重要位点的差异可能影响蛋白结构，进而影响蛋白功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、快速且可定量的检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物，包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。
引物AKAVSF1和引物AKAVSR1的摩尔比为1:1。
上述荧光定量RT-PCR引物在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。
扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。
检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR试剂盒，含有引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。
引物AKAVSF1和引物AKAVSR1浓度均为10μM。
该试剂盒还包括以下试剂：RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、新型阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。
RNA提取试剂、反转录试剂分别为Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒(9767)和PrimeScript RT Master Mix(RR036Q)，荧光定量RT-PCR扩增试剂为SYBRPremix Ex Taq II(RR820A)；阳性对照为新型阿卡斑病毒S基因片段的质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。
上述荧光定量RT-PCR试剂盒在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。
扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。
针对目前新型阿卡斑病毒PCR检测存在的问题，结合新型阿卡斑病毒S基因的特点，发明人设计并制备了检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物，包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。据此，发明人还建立相应的荧光定量RT-PCR检测方法并制备相应的荧光定量RT-PCR试剂盒。实验表明，本发明具有特异、敏感、快速、简便的特点，而且检测灵敏度高，在标准品为1.0×101～1.0×109copies/μL范围内都有较好的线性关系。与前述专利相比，本发明检测限低至1.0×101copies/μL、检测范围宽至8个数量级，可以从拷贝数低的样品中快速、高效检测新型阿卡斑病毒，满足动物疫病监测、防控的需求。此外，在保证检测方法灵敏、准确的前提下，发明人基于云南分离株与毒株GXLCH16-70差异区域，成功筛选得到的引物，填补了目前临床新型阿卡斑病毒荧光定量检测方法空白，具有较好的应用前景。
附图说明
图1是新型阿卡斑病毒S基因荧光定量RT-PCR标准曲线，图中：横轴为重组质粒标准品拷贝数的对数值，纵轴为Ct值。
图2是新型阿卡斑病毒S基因荧光定量RT-PCR特异性检测结果图，图中：1-3是新型阿卡斑病毒细胞培养上清(3个重复)，4-15分别是蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌(各3个重复)。
具体实施方式
实施例1引物设计
根据Genbank的新型阿卡斑病毒GXLCH16-70毒株的S基因保守区(登录号KY381274)，用Primer 5.0等软件设计引物AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2(SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.4)，由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成，用DEPC ddH2O溶解，-20℃保存。
表1引物序列
Figure BDA0003308703350000031
实施例2荧光定量RT-PCR检测方法的建立
(1)标准品的制备
以感染新型阿卡斑病毒的Vero细胞培养提取物为模板，分别采用AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2分别扩增新型阿卡斑病毒基因组S基因129bp、135bp扩增产物(SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6)，按经典分子克隆方法，将其连接pMD-18T载体，进行克隆。抽提阳性克隆质粒pMD-AKAVS1、pMD-AKAVS2，利用分光光度计测定质粒浓度，分别制备1.0×1011copies/μL标准品，并对其10倍梯度稀释，制备1.0×100～1.0×109copies/μL的荧光定量RT-PCR标准样品。
(2)荧光定量RT-PCR反应条件优化
对引物AKAVSF1和AKAVSR1、AKAVSF2和AKAVSR2的荧光定量RT-PCR反应条件进行优化探索，在不同引物用量(0.2μL、0.4μL、0.6μL和1.0μL)、退火温度(58℃、60℃、62℃、64℃和66℃)、添加Mg2+浓度(0μmol/L、0.5μmol/L和1μmol/L)、两步法或三步法等条件下反应，以Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等标准，确定最佳反应条件：SYBRPremix Ex Taq II 10μL、上下游引物(10μM)各0.4μL，标准品或反转录产物2μL，双蒸水补齐至20μL；反应条件：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环，敏感性、检测效果最好。
(3)荧光定量RT-PCR反应体系的建立
以各浓度标准品为模板，配置荧光定量RT-PCR反应液(表2)，置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。每浓度标准品3个平行重复。
根据标准品浓度的对数值和Ct值为坐标，分别绘制标准曲线，如图1所示，引物AKAVSF1和AKAVSR1荧光定量RT-PCR标准曲线的回归方程为y＝-3.3556x+38.072，R2＝0.9902，曲线在1.0×101～1.0×109copies/μL之间呈现良好的线性关系，扩增效率为98.61％；而引物AKAVSF2和AKAVSR2荧光定量RT-PCR标准曲线的回归方程为y＝-3.0865x+42.921，R2＝0.9954，曲线在1.0×104～1.0×109copies/μL之间呈现良好的线性关系，扩增效率为110.86％；引物AKAVSF1和AKAVSR1灵敏性较好，检测范围较宽，更适用于临床检测。
(4)检测结果的判定
根据荧光定量RT-PCR反应收集荧光信号，若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤35，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可判定待测样品中含有新型阿卡斑病毒。
同时，根据荧光定量RT-PCR的标准曲线，可以对样品中新型阿卡斑病毒进行定量测定。
表2荧光定量RT-PCR反应液组份
Figure BDA0003308703350000051
(4)荧光定量RT-PCR的评价
1)特异性试验
应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别对蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌进行检测，结果发现，蓝舌病、鹿流行性出血热、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌均不能有效扩增，只有新型阿卡斑病毒能够有效扩增(图2)。
以上试验结果表明，本发明具有较强的特异性，引物与新型阿卡斑病毒特异性结合，与其他牛源和竹鼠源病原都没有交叉反应，方法特异性好。
2)灵敏性和检测范围试验
应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别以浓度为1.0×100～1.0×109copies/μL的AKAV S基因质粒标准品为模板，测定各浓度标准品的Ct值，绘制标准曲线，用于评价本方法的灵敏度。结果发现浓度1.0×101～1.0×109copies/μL的S基因标准品为模板时，绘制的标准曲线线性关系较好，扩增效率分别为98.61％，因此确定本方法可准确检测到最低1.0×101copies/μL、最高1.0×109copies/μL的AKAV S基因。
3)重复性试验
应用建立的荧光定量RT-PCR方法，分别以浓度为1.0×101～1.0×109copies/μL的AKAV S基因质粒标准品为模板，进行3次批内和3次批间重复试验，即每个样品3个重复、并分别进行3次实验。计算每个稀释度标准品的平均Ct、标准差(SD)和变异系数(CV)，用于评价本方法的可重复性，结果见表3。每个浓度标准品的批内、批间试验Ct值的SD都在0.5以内，CV都在5％以内，说明针对新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR方法具有较好的重复性。
表3 AKAV S基因荧光定量RT-PCR检测方法重复性实验结果
Figure BDA0003308703350000061
实施例3荧光定量RT-PCR试剂盒组成及评价
(1)荧光定量RT-PCR试剂盒组成
特异性引物AKAVSF1和AKAVSR1，浓度均为10μM；
RNA提取试剂：Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒(9767)；
RNA反转录试剂：Takara的PrimeScript RT Master Mix(RR036Q)；
扩增试剂：Takara的SYBR Premix Ex Taq II(RR820A)以及Rnase-Free ddH2O；
阴阳性对照：阳性对照为实施例2中制备的标准品，即新型阿卡斑病毒S基因质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。
(2)试剂盒反应条件
根据RNA提取试剂盒说明书操作，抽提正常Ver细胞和接种新型阿卡斑病毒的Vero细胞总RNA，并去除其中基因组DNA，用实施例2中建立的荧光定量RT-PCR进行检测并分析结果。
若待测样品荧光信号超过阈值且Ct≤35，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则可判定待测样品中含有新型阿卡斑病毒。
同时，根据荧光定量RT-PCR的标准曲线，可以对样品中新型阿卡斑病毒进行定量测定。
(3)荧光定量RT-PCR试剂盒与普通RT-PCR灵敏性比较
将新型阿卡斑病毒S基因标准品稀释成1.0×101～1.0×109copies/μL，采用上述试剂盒进行检测，结果显示，试剂盒能检测1.0×101copies/μL的新型阿卡斑病毒S基因标准品，而且在1.0×101～1.0×109copies/μL范围内均有较好的线性关系，检测范围可达9个数量级。对比前述专利中新型阿卡斑病毒RT-PCR检测方法，发现RT-PCR最低只能检测到109copies/μL。这表明本发明新型阿卡斑病毒荧光定量RT-PCR试剂盒的灵敏度是RT-PCR的108倍，具有较高的灵敏性。
(4)荧光定量RT-PCR试剂盒的应用
用经过鉴定的新型阿卡斑病毒感染Vero细胞为实验组，同时以PBS接种Vero细胞为对照组，待实验组Vero细胞出现明显细胞病变后收毒。抽提实验组和对照组Vero细胞总RNA，并去除其中基因组DNA，应用上述试剂盒及实施例2中建立的荧光定量RT-PCR进行检测并分析结果。
结果发现，实验组Vero细胞中检出新型阿卡斑病毒S基因，符合预期，表明本发明的检测方法准确、可靠。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物及其试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acataagacg ccacaaccaa gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaatgcgat ggagcgtaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcctggtgc cgagatgttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagtcagctg cccatacctc 20
<210> 5
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acataagacg ccacaaccaa gtgtcgatct tacttttgca ggggtcaaat ttacagtggt 60
taataaccat tttccccagt acactgcaaa cccagtgtca gacactgcct ttacgctcca 120
tcgcatttc 129
<210> 6
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctcctggtgc cgagatgttt ctggaaactt ttgagtttta cccactggtt atcgacatgc 60
accgtgtgat aaaggacggg atggatgtta acttcatgag gaaagtctta cgccagaggt 120
atgggcagct gactg 135

Claims (10)

1.检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR引物，其特征在于包括引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的荧光定量RT-PCR引物，其特征在于所述引物AKAVSF1和引物AKAVSR1的摩尔比为1:1。
3.权利要求1所述的荧光定量RT-PCR引物在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。
5.一种检测新型阿卡斑病毒S基因的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于含有引物AKAVSF1和引物AKAVSR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.2的碱基序列。
6.根据权利要求5所述的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述引物AKAVSF1和引物AKAVSR1浓度均为10μM。
7.根据权利要求5所述的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括以下试剂：RNA提取试剂、反转录试剂、荧光定量RT-PCR扩增试剂、新型阿卡斑病毒阳性对照和阴性对照。
8.根据权利要求7所述的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于：所述RNA提取试剂、反转录试剂分别为Takara的MiniBEST Universal RNA Extraction试剂盒和PrimeScript RTMaster Mix，荧光定量RT-PCR扩增试剂为SYBR Premix Ex Taq II；所述阳性对照为新型阿卡斑病毒S基因片段的质粒，阴性对照为新型阿卡斑病毒阴性的昆明小鼠血清。
9.权利要求5所述的荧光定量RT-PCR试剂盒在扩增新型阿卡斑病毒S基因中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述扩增反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃30s、64℃30s、72℃30s共40个循环。
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