CN114107569B - 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针。所述的引物包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述的上游引物的序列为5’‑ACGCCAACAACGGACCACAT‑3’，或与其具有至少80％同源性的序列；所述的下游引物的序列为5’‑TAGTCGCGATGCTGCTGACG‑3’，或与其具有至少80％同源性的序列；所述的探针的序列为5’‑GCGTTTGGATCTGCGCCGTG‑3’，或与其具有至少80％同源性的序列。采用本发明的引物探针进行荧光定量PCR检测牛痘病毒，具有简单快速、检测灵敏度高、准确性好、特异性强、收率高、重复性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂盒技术领域，尤其涉及一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒。
背景技术
在生物制品的生产过程中，需要使用特定方法去除或灭活部分病毒活性，从而保证该生物制备在临床使用中的安全性。为了检测病毒去除或灭活效果，需要使用一些检测方法对生物制品进行检测。痘病毒作为生物制品病毒安全性评价的一个重要指标，其标志病毒牛痘病毒的快速检测成为安全性评价中的重要环节。常规的生物制品安全评价方法中，多使用传统检测方法，例如细胞实验、动物抗体产生实验，存在操作复杂、耗时长、误差大以及成本高等问题，严重限制生物制品的生产推广。荧光定量PCR技术能够缩短实验周期，减少污染物，并且具有高灵敏度以及高特异性等优势从而渐渐推广开来，但是针对具体病毒，荧光定量PCR的实时准确的检测效果是建立在所选取的引物和探针的基础上的，因此，用于检测牛痘病毒的引物和探针成为研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够简单、快速地检测牛痘病毒的引物、探针及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针，所述的引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的序列为5’-ACGCCAACAACGGACCACAT-3’，或与其具有至少80％同源性的序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；
所述的下游引物的序列为5’-TAGTCGCGATGCTGCTGACG-3’，或与其具有至少80％同源性的序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；
所述的探针的序列为5’-GCGTTTGGATCTGCGCCGTG-3’，或与其具有至少80％同源性的序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
优选地，所述的引物扩增片段大小为180～185bp。
优选地，所述的上游引物的长度、所述的下游引物的长度和所述的探针的长度独立地为18～22bp，进一步优选为19～21bp。
优选地，所述的上游引物的GC含量为50～60％，进一步优选为52～58％，更进一步优选为54～56％。
优选地，所述的下游引物的GC含量为55～65％，进一步优选为58～64％，更进一步优选为59～61％。
优选地，所述的探针的GC含量为60～70％，进一步优选为62～68％，更进一步优选为64～66％。
优选地，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团。
优选地，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
一种快速鉴别牛痘病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的引物、探针。
优选地，所述的试剂盒还包括DNA标准品，所述的DNA标准品的序列为ACGCCAAC AACGGACCACATCCTTCTTCATCAACCGAGTTGTTAATCTTGGCTCCATACTGTACCAA TAAATTTATTCTCTCTATGACTTCATCATCTGTTCCCGAGAGATAATATAGAGGTGTTTT ATTATGTTTATCACACGCGTTTGGATCTGCGCCGTGCGTCAGCAGCATCGCGACTA。
优选地，所述试剂盒还包括扩增试剂BeyoFast Probe qPCR Mix(2×)。
一种如所述的引物、探针和/或如所述的试剂盒在检测生物制品中牛痘病毒中的应用。
一种快速鉴别牛痘病毒的方法，所述的方法为以待检测生物制品中的DNA为模板，采用引物、探针进行荧光定量PCR反应，采集荧光信号以确定所述的待检测生物制品中的牛痘病毒的含量，所述的引物、探针为所述的引物、探针。
根据实施例，荧光定量PCR的扩增试剂为BeyoFast Probe qPCR Mix(2×)，反应条件为95℃预变性2min，95℃变性15sec，60℃退火/延伸30sec，循环数40。在60℃退火延伸时检测荧光信号。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
采用本发明的引物探针进行荧光定量PCR检测，具有简单快速，检测灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高等优点。
附图说明
图1为以实施例2的样品DNA为模版得到的扩增曲线示意图；
图2为实施例1得到的扩增曲线示意图(模板浓度从左至右依次为107copies/μL、105copies/μL、103copies/μL)；
图3为实施例1得到的扩增曲线示意图(模板浓度从左至右依次为107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL)；
图4为实施例1得到的扩增曲线示意图(模板浓度从左至右依次为101copies/μL、100copies/μL)；
图5为对比例1得到的扩增曲线示意图(模板浓度为107copies/μL，无明显扩增曲线)；
图6为对比例2得到的扩增曲线示意图(模板浓度为107copies/μL，无明显扩增曲线)；
图7为对实施例3得到的扩增曲线示意图(模板浓度为107copies/μL，结果稳定性较差)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明针对牛痘病毒DNA设计并筛选了用于荧光PCR定量检测的引物探针，并经大量实验进行验证。
根据本发明，一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针，所述的引物包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述的上游引物的序列为5’-ACGCCAACAACGGACCACAT-3’，或与其具有至少80％同源性的序列；
所述的下游引物的序列为5’-TAGTCGCGATGCTGCTGACG-3’，或与其具有至少80％同源性的序列；
所述的探针的序列为5’-GCGTTTGGATCTGCGCCGTG-3’，或与其具有至少80％同源性的序列。
根据本发明，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团。
根据本发明，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
根据本发明，所述的快速鉴别牛痘病毒的试剂盒包括所述的引物、探针和DNA标准品，所述的RNA标准品的序列为ACGCCAACAACGGACCACATCCTTCTTCATCAACCGAGTTGTTAATCTTGGCTCCATACTGTACCAATAAATTTATTCTCTCTATGACTTCATCATCTGTTCCCGAGAGATAATATAGAGGTGTTTTATTATGTTTATCACACGCGTTTGGATCTGCGCCGTGCGTCAGCAGCATCGCGACTA。
根据本发明，荧光定量PCR的扩增试剂为BeyoFast Probe qPCR Mix(2×)，反应条件为95℃预变性2min，95℃变性15sec，60℃退火/延伸30sec，循环数40。在60℃退火延伸时检测荧光信号。
采用本发明的引物探针进行荧光定量PCR检测相比现有技术具有以下优势：
1、简单快速：在病毒去除效果验证中，对牛痘病毒的检测通常使用的是细胞实验，存在感染风险，需要时间长(8天左右)，而本发明从核酸角度对牛痘病毒进行检测，从样品DNA提取开始到获得只需4小时左右。且在操作前可对样品进行适当的灭活处理，减少污染与感染的风险。
2、灵敏度高：现有的检测方法，病毒含量在少量情况下，感染细胞存在一定概率，检测不到的情况有极大概率发生，本发明检测牛痘病毒时，DNA标准品在103～107copies/μL浓度范围内，线性关系很好R2≥0.99，灵敏度达到10copies/μL。
3、重复性、准确性、特异性强：本发明的引物探针在用于检测时，重复性SD≤0.5，以DNA标准品制作标准曲线，定量样品DNA量，体系模板一致，准确性高，以牛痘病毒核酸序列设计引物和探针，特异性强。
4、回收率高：本发明从提取开始，荧光定量PCR方法回收率≥80％。
以下结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
实施例1
(1)从NCBI中找到牛痘病毒的基因序列(基因库登录号为NC_001510)。
(2)设计出如表1所示的引物和探针，对探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团TAMRA，由基因合成公司合成。
表1
(3)DNA的标准品：序列为ACGCCAACAACGGACCACATCCTTCTTCATCAACCGAGTTGTTAATCTTGGCTCCATACTGTACCAATAAATTTATTCTCTCTATGACTTCATCATCTGTTCCCGAGAGATAATATAGAGGTGTTTTATTATGTTTATCACACGCGTTTGGATCTGCGCCGTGCGTCAGCAGCATCGCGACTA(SEQ ID NO.13)，长度为183bp，由基因合成公司直接合成。
(4)制作标准曲线
a)将上述DNA的标准品稀释至1、10、102、103、104、105、106、107copies/μL，以制成不同浓度的RNA模板；
b)配制反应体系：
PCR反应体系(20μL)：
c)PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性15sec，60℃退火/延伸30sec，循环数40。在60℃退火延伸时检测荧光信号，获得各浓度标准品的线性关系扩增曲线图。
d)以每一标准品浓度得到的Cq值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数为横坐标制作标准曲线，其中，Cq值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数。线性关系y＝-3.4066x+41.698，R2＝0.9994。
DNA标准品为107copies/μL时重复检测10次SD为0.18；
DNA标准品为105copies/μL时重复检测10次SD为0.03；
DNA标准品为103copies/μL时重复检测10次SD为0.13。
对比例1
本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例的引物和探针如表2所示。
表2
本对比例的扩增曲线示意图如图5示，无明显扩增曲线。
对比例2
本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例的引物和探针如表3示。
表3
本对比例的扩增曲线示意图如图6，无明显扩增曲线。
对比例3
本对比例的PCR反应体系和PCR反应条件基本同实施例1，区别仅在于引物、探针的序列不同，本对比例的引物和探针如表3示。
表3
本对比例的扩增曲线示意图如图7，检测结果不稳定，扩增效率低，线性关系差。
实施例2
(1)样品DNA提取：取400μl病毒培养(离心)浓缩液，分别加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液后Votex充分混匀，15℃、13400rpm离心15min，收集上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc，充分混匀后在-20℃放置30min，然后4℃、13400rpm离心30min，弃上清，沉淀中加入500μl预冷的75％乙醇，4℃、13400rpm漂洗2次，沉淀在30℃真空干燥10min，加入10μl ddH2O合并溶解两管沉淀，-20℃保存备用。
(2)以提取的样品DNA为模板，使用实施例1的引物探针，参照实施例1的反应体系和PCR反应条件进行测试，样本扩增曲线如图1所示。
(3)根据实施例1得到的标准曲线，准确定量牛痘病毒的核酸含量。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种快速鉴别牛痘病毒的试剂，所述的试剂包括引物和探针，所述的引物包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述的上游引物的序列为5’-ACGCCAACAACGGACCACAT-3’；
所述的下游引物的序列为5’-TAGTCGCGATGCTGCTGACG-3’；
所述的探针的序列为5’-GCGTTTGGATCTGCGCCGTG-3’。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别牛痘病毒的试剂，其特征在于，所述的引物扩增片段大小为183bp。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别牛痘病毒的试剂，其特征在于，所述的探针的5’端连接有荧光报告基团，所述的探针的3’连接有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的快速鉴别牛痘病毒的试剂，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
5.一种快速鉴别牛痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的试剂。
6.根据权利要求5所述的快速鉴别牛痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括DNA标准品，所述的DNA标准品的序列为ACGCCAACAACGGACCACATCCTTCTTCATCAACCGAGTTGTTAATCTTGGCTCCATACTGTACCAATAAATTTATTCTCTCTATGACTTCATCATCTGTTCCCGAGAGATAATATAGAGGTGTTTTATTATGTTTATCACACGCGTTTGGATCTGCGCCGTGCGTCAGCAGCATCGCGACTA。
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- 2021-12-27 CN CN202111613985.1A patent/CN114107569B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2427648C1 (ru) * | 2010-04-30 | 2011-08-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентномеченых зондов для видоспецифичной экспресс-идентификации ортопоксвирусов на основе мультиплексной пцр в реальном времени |
| CN110283794A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-09-27 | 伍泽堂 | 重组溶瘤病毒以及制备方法、应用和药物 |
| CN112011649A (zh) * | 2020-10-29 | 2020-12-01 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| "正痘病毒基因结构及功能研究的几项进展";刘铮等;《病毒学报》;第29卷(第4期);第437-441页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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