CN112011649B - 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112011649B CN112011649B CN202011176140.6A CN202011176140A CN112011649B CN 112011649 B CN112011649 B CN 112011649B CN 202011176140 A CN202011176140 A CN 202011176140A CN 112011649 B CN112011649 B CN 112011649B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- copies
- sequence
- probe
- primer
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 29
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 claims description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 29
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 29
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及其应用，所述上游引物的序列为cccttaaagataagattaaccc，或与其具有至少80%同源性的序列；所述下游引物的序列为ctctccaagtaacattgaag，或与其具有至少80%同源性的序列；所述探针的序列为cgttgtaccgaggctcctgc，或与其具有至少80%同源性的序列。采用本发明的引物探针进行荧光定量PCR检测，具有简单快速，检测灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物试剂盒技术领域，尤其涉及一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用。
背景技术
为了提高生物制品临床使用的安全性，生产工艺要具有一定的去除或灭活部分病毒的能力，生产过程中应有特定的去除或灭活病毒的方法，而逆转录病毒是生物制品病毒安全性评价的一类重要病毒，异嗜性小鼠白血病病毒作为逆转录病毒的标志病毒，对其进行检测的方法是安全性评价中重要组成部分，传统的检测方法如细胞实验、动物抗体产生实验，方法复杂，耗时长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够简单、快速的检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及其应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明一方面提供一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针，其包括上游引物、下游引物和探针，其中，
所述上游引物的序列为cccttaaagataagattaaccc，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性；
所述下游引物的序列为ctctccaagtaacattgaag，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性；
所述探针的序列为cgttgtaccgaggctcctgc，或与其具有至少80%同源性的序列，优选具有至少85%的同源性，进一步优选具有至少90%的同源性，更优选具有至少95%的同源性。
优选地，所述上游引物的长度、所述下游引物的长度、所述探针的长度独立地为20~22bp。
优选地，所述上游引物的GC含量为30~40%，优选为36.36%。
优选地，所述下游引物的GC含量为35~45%，优选为40.00%。
优选地，所述探针的GC含量为60~70%，优选为65.00%。
其中，GC含量是指在DNA的4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。
优选地，所述上游引物的Tm值为59.99~60.1℃，进一步优选为60℃。
优选地，所述下游引物的Tm值为59.6~59.8℃，进一步优选为59.7℃。
优选地，所述探针的Tm值为69~72℃，进一步优选为70.4℃。
优选地，所述探针的序列的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
进一步优选地，所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
本发明的第二方面是提供一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的试剂盒，其包括上述引物探针。
优选地，所述试剂盒还包括RNA标准品；其中，所述的RNA标准品的序列为cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugagggcaggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag。
优选地，所述试剂盒还包括One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、TaKaRa Ex TaqHS、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ。
本发明的第三方面是提供一种所述的引物探针或所述的试剂盒在检测异嗜性小鼠白血病病毒中的应用。
优选地，所述应用是用于检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒。
本发明的序列的书写方向自左至右为5’端到3’端。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
采用本发明的引物探针进行荧光定量PCR检测，具有简单快速，检测灵敏度高，重复性、准确性好，特异性强，回收率高的优点。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的试剂盒的应用的流程示意图；
图2为实施例1得到的扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图3为对比例1得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图4为对比例2得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图5为对比例3得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图6为对比例4得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图7为对比例5得到的线性关系扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL）；
图8为对实施例2的样品进行扩增得到的扩增曲线示意图；
图9为以第一组引物和探针对标准品进行扩增得到的扩增曲线示意图（模板浓度从右至左依次为2×10copies/μL、2×102copies/μL、2×105copies/μL、2×107copies/μL、2×109copies/μL）；
图10为实施例3的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
（1）从NCBI中找到异嗜性小鼠白血病病毒的env基因（人类免疫缺陷病毒膜蛋白基因）序列（基因库登录号为K00011.1）（SEQ ID NO.1）：
ccctctctcc aagctcactt acaggccctc caagcagtac aacgagaggt ctggaagcca
ctggccgctg cttatcagga ccagctggat cagccagtga taccacaccc cttccgtgtc
ggtgacgccg tgtgggtacg ccggcaccag actaagaact tagaaccccg ctggaaagga
ccctacaccg tcctgctgac cacccccacc gctctcaaag tagacggcat ctccgcgtgg
atacacgccg ctcacgtaaa ggcggcgaca actcctccag ccggaacagc atggaaggtt
cagcgttctc aaaacccctt aaagataaga ttaacccgtg gggcccccta atagttatgg
ggatcttggt gagggcagga gcctcggtac aacgtgacag ccctcaccag atcttcaatg
ttacttggag agttaccaac ctaatgacag gacaaacagc taacgccacc tccctcctgg
ggacgatgac agacaccttc cctaaactat attttgacct gtgtgattta gtaggagact
actgggatga cccagaaccc gatattgggg atggttgccg cactcccggg ggaagaagaa
ggacaagact gtatgacttc tatgtttgcc ccggtcatac tgtaccaata gggtgtggag
ggccgggaga gggctactgt ggcaaatggg gatgtgagac cactggacag gcatactgga
agccatcatc atcatgggac ctaatttccc ttaagcgagg aaacactcct aaggatcagg
gcccctgtta tgattcctcg gtctccagtg gcgtccaggg tgccacaccg gggggtcgat
gcaaccccct ggtcttagaa ttc。
（2）设计出如表1所示的引物和探针，对探针的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接荧光淬灭基团TAMRA；该引物和探针由基因合成公司合成。
（3）由基因合成公司直接合成设计好的RNA，其长度为117bp，序列为cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugagggcaggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag（SEQ ID NO.20），作为RNA的标准品。
（4）制作标准曲线
1）将上述RNA的标准品（X-MuLV RNA标准品）稀释至2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL，以制成不同浓度的RNA模板；
2）配制反应体系：10μL 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、0.4μL TaKaRa ExTaqHS、0.4μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ、0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.8μL探针、2μL RNA模板、无RNA酶水补足至反应体系总体积为20μL；
3）将上述反应体系按照一步法进行荧光定量PCR反应，反应条件为42℃/5min；95℃/30sec；95℃/5sec，60℃/30sec，共40个循环的逆转录反应；并在60℃退火延伸时采集荧光信号，并获得各浓度标准品的线性关系扩增曲线图，如图2所示；
4）以每一标准品浓度得到的Cq值为纵坐标，以标准品拷贝数的对数为横坐标制作标准曲线，其中，Cq值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数。线性关系y = 3.5949x + 15.88， R2 = 0.9994。
从图2可见，各浓度下的标准品的扩增结果稳定，扩增效率高，灵敏度高；获得的标准曲线的线性关系达到R2≥0.99。
以2×10copies/μL、2×102copies/μL、2×105copies/μL、2×107copies/μL、2×109copies/μL为灵敏度确认模板按照上述步骤（4）制作扩增曲线，扩增曲线如图9所示，其中2×102copies/μL的样品的Cq值≤35，而2×10copies/μL的样品的Cq值＞35，可见灵敏度达到2×102 copies/μL。并且，图9中从左至右的曲线分别对应于拷贝数为2×109copies/μL、2×107copies/μL、2×105copies/μL、2×102copies/μL以及2×10copies/μL的样品对应的扩增曲线，每个浓度样品重复检测10次，可见CV%≤5%。
对比例1
基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表2所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL。
本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图3所示，从图3可见，在模板浓度高时，检测结果不稳定，扩增效率低，线性关系差。
对比例2
基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表3所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL。
本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图4所示，从图4可见，检测结果复孔稳定性差，扩增效率低导致灵敏度不高。
对比例3
基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表4所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL。
本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图5所示，从图5可见，在模板浓度高时，检测结果不稳定，模板浓度低时检测不到，灵敏度差。
对比例4
基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表5所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL。
本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图6所示，从图6可见，检测结果不稳定，扩增效率低，线性关系差。
对比例5
基本与实施例1相同，不同之处仅在于引物和探针的序列不同以及采用的标准品的浓度不同，本对比例的引物和探针如表6所示，本对比例采用的标准品的浓度为2×102copies/μL、2×103copies/μL、2×104copies/μL、2×105copies/μL、2×106copies/μL、2×107copies/μL、2×108copies/μL、2×109copies/μL。
本对比例扩增得到的各浓度标准品的线性关系扩增曲线示意图如图7所示，从图7可见，无明显扩增曲线，特异性差。
结合上述PCR结果得知，实施例1的引物和探针具有较优的特异性和稳定性，以实施例1的引物和探针扩增的片段大小为117bp，基因序列位于env包膜核酸序列中，具有高度的保守性。
实施例2
（1）样品RNA提取：将Mv-1Lu细胞传代培养长满培养瓶后，经-35℃反复冻融三次，收集培养液，离心取上清液，使用PureLink™ Viral RNA/DNA Mini Kit（Invitrogen）核酸提取试剂盒，从该上清液中提取样品RNA，核酸量为10μL。
（2）以提取的样品RNA为RNA模板，以第一组引物和探针按照实施例1的反应体系和反应条件进行一步法荧光定量PCR反应，并按照实施例1的方法采集荧光信号。扩增曲线示意图如图8所示。
（3）根据实施例1以第一组引物探针对各浓度标准品进行扩增得到的标准曲线，准确定量检测样品中异嗜性小鼠白血病病毒的核酸含量。
实施例3
将Mv-1Lu细胞分别培养1天、2天、3天，并按照实施例2的方法收集培养1天、2天、3天的培养上清液提取RNA，作为样品RNA。
以实施例1稀释的浓度为2×109至2×104copies/ul的标准品作为标准品模板RNA。
采用第一组引物对和探针分别对上述样品RNA以及标准品模板RNA按照实施例1的方法进行扩增，并以培养基为阴性对照，检测结果如图10所示，其中，“○”为标准品模板RNA的检测结果，“×”为样品RNA的检测结果，培养不同天数的样品RNA分别检测多次，对多次检测结果取平均值，其中，培养1天的细胞上清检测结果Cq值＞35，268copies/μL，培养2天的细胞上清检测结果Cq值为30.23，8.80×104copies/μL，培养3天的细胞上清检测结果Cq值29.12，1.91×105copies/μL。
本发明具有以下优点：
本发明采用一步法，相较于传统的两步法，可降低污染的概率，减少检测时间，反应体系添加时，可根据反应孔数将除模板RNA外的其他成分制成预混液后分装至八连管或96孔板，以减小每孔之间的误差。
简单快速：在病毒去除效果验证中，对异嗜性小鼠白血病病毒的检测通常使用的是细胞实验，存在感染风险，所需时间长（8天左右），而本发明从核酸角度对异嗜性小鼠白血病病毒进行检测，从样品RNA提取开始到获得只需4小时左右。且在操作前可对样品进行适当的灭活处理，减少污染与感染的风险。
灵敏度高：现有的检测方法，病毒含量在少量情况下，检测不到的情况有极大概率发生，但病毒含量少仍存在一定感染风险，本发明检测异嗜性小鼠白血病病毒时，RNA标准品在103~108copies/μL浓度范围内，线性关系很好R2≥0.99，灵敏度达到2×102copies/μL。重复性好、准确性高、特异性强：本发明在用于检测时，重复性SD≤0.5，以RNA标准品制作标准曲线，定量样品RNA量，体系模板一致，准确性高，以异嗜性小鼠白血病病毒env核酸序列设计引物和探针，特异性强。
回收率高：本发明从提取开始，荧光定量PCR方法回收率≥80%。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 苏州良辰生物医药科技有限公司
<120> 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 863
<212> DNA
<213> 异嗜性小鼠白血病病毒的env基因(Murine leukemia virus NFS-Th-1xenotropic proviral pol & env genes)
<400> 1
ccctctctcc aagctcactt acaggccctc caagcagtac aacgagaggt ctggaagcca 60
ctggccgctg cttatcagga ccagctggat cagccagtga taccacaccc cttccgtgtc 120
ggtgacgccg tgtgggtacg ccggcaccag actaagaact tagaaccccg ctggaaagga 180
ccctacaccg tcctgctgac cacccccacc gctctcaaag tagacggcat ctccgcgtgg 240
atacacgccg ctcacgtaaa ggcggcgaca actcctccag ccggaacagc atggaaggtt 300
cagcgttctc aaaacccctt aaagataaga ttaacccgtg gggcccccta atagttatgg 360
ggatcttggt gagggcagga gcctcggtac aacgtgacag ccctcaccag atcttcaatg 420
ttacttggag agttaccaac ctaatgacag gacaaacagc taacgccacc tccctcctgg 480
ggacgatgac agacaccttc cctaaactat attttgacct gtgtgattta gtaggagact 540
actgggatga cccagaaccc gatattgggg atggttgccg cactcccggg ggaagaagaa 600
ggacaagact gtatgacttc tatgtttgcc ccggtcatac tgtaccaata gggtgtggag 660
ggccgggaga gggctactgt ggcaaatggg gatgtgagac cactggacag gcatactgga 720
agccatcatc atcatgggac ctaatttccc ttaagcgagg aaacactcct aaggatcagg 780
gcccctgtta tgattcctcg gtctccagtg gcgtccaggg tgccacaccg gggggtcgat 840
gcaaccccct ggtcttagaa ttc 863
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
cccttaaaga taagattaac cc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
ctctccaagt aacattgaag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
cgttgtaccg aggctcctgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
tggggatctt ggtgagggca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 6
tgtcatcgtc cccaggaggg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 7
gcctcggtac aacgtgacag cc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 8
ccagccggaa cagcatggaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 9
tgccctcacc aagatcccca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 10
aacccgtggg gccccctaat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 11
gaaccccgct ggaaaggacc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 12
tgccctcacc aagatcccca 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 13
tcctgctgac cacccccacc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 14
cacccccacc gctctcaaag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 15
tgccctcacc aagatcccca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 16
cgctcacgta aaggcggcga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 17
aaaggcggcg acaactcctc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 18
tgccctcacc aagatcccca 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 19
aacccgtggg gccccctaat 20
<210> 20
<211> 117
<212> RNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 20
cccuuaaaga uaagauuaac ccguggggcc cccuaauagu uauggggauc uuggugaggg 60
caggagccuc gguacaacgu gacagcccuc accagaucuu caauguuacu uggagag 117
Claims (4)
1.一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针，其特征在于，所述引物探针包括上游引物、下游引物和探针，其中，
所述上游引物的序列为cccttaaagataagattaaccc；
所述下游引物的序列为ctctccaagtaacattgaag；
所述探针的序列为cgttgtaccgaggctcctgc；
所述探针的序列的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；
所述的荧光报告基团为FAM；所述的荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。
2.一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA标准品；其中，所述的RNA标准品的序列为cccuuaaagauaagauuaacccguggggcccccuaauaguuauggggaucuuggugagggcaggagccucgguacaacgugacagcccucaccagaucuucaauguuacuuggagag。
4.一种如权利要求1所述的引物探针和/或如权利要求2或3所述的试剂盒在检测生物制品中的异嗜性小鼠白血病病毒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011176140.6A CN112011649B (zh) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011176140.6A CN112011649B (zh) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112011649A CN112011649A (zh) | 2020-12-01 |
| CN112011649B true CN112011649B (zh) | 2021-01-15 |
Family
ID=73528289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011176140.6A Active CN112011649B (zh) | 2020-10-29 | 2020-10-29 | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112011649B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107569B (zh) * | 2021-12-27 | 2024-02-09 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1411513A (zh) * | 1999-11-15 | 2003-04-16 | 迪吉株式会社 | 一种检测接受基因治疗的受治者血清中有复制能力的病毒的方法 |
| CN103140581A (zh) * | 2010-07-16 | 2013-06-05 | 托卡根公司 | 逆转录病毒检测 |
| CN102337359B (zh) * | 2011-11-02 | 2014-02-19 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠白血病病毒的引物、探针及其方法 |
| CN108531662A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-09-14 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 |
-
2020
- 2020-10-29 CN CN202011176140.6A patent/CN112011649B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1411513A (zh) * | 1999-11-15 | 2003-04-16 | 迪吉株式会社 | 一种检测接受基因治疗的受治者血清中有复制能力的病毒的方法 |
| CN103140581A (zh) * | 2010-07-16 | 2013-06-05 | 托卡根公司 | 逆转录病毒检测 |
| CN102337359B (zh) * | 2011-11-02 | 2014-02-19 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 用于检测小鼠白血病病毒的引物、探针及其方法 |
| CN108531662A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-09-14 | 苏州良辰生物医药科技有限公司 | 一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ning Tang等.Development of sensitive single-round pol or env RT-PCR assays to screen for XMRV in multiple sample types.《Journal of Virological Methods》.2011, * |
| Ryuta Sakuma等.Xenotropic murine leukemia virus-related virus is susceptible to AZT.《Virology》.2009, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112011649A (zh) | 2020-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107354239B (zh) | 一种检测eb病毒的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 | |
| CN109234456B (zh) | 一种可同时检测6种呼吸道病原体的试剂盒及其应用 | |
| CN105112564A (zh) | 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒 | |
| CN112063764A (zh) | 一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光rt-pcr引物探针组合物及试剂盒 | |
| CN112011649B (zh) | 一种用于检测异嗜性小鼠白血病病毒的引物探针、试剂盒及应用 | |
| CN112011648B (zh) | 一种检测生物制品中异嗜性小鼠白血病病毒的方法 | |
| CN111471776A (zh) | 虾肝肠胞虫检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN109207640B (zh) | 一种检测多种呼吸道病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用 | |
| CN101812538B (zh) | 一种检测肠道病毒71型的荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| CN113897422A (zh) | 一种用于检测致病毛霉菌的多重pcr引物探针组和试剂盒 | |
| CN116790823B (zh) | 同步检测htlv-1和htlv-2的双重定量rt-pcr检测组合物、试剂盒和方法 | |
| CN106048014B (zh) | 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针 | |
| CN108300804B (zh) | 用于HBV miR-3荧光定量PCR检测的材料及方法 | |
| CN114317821B (zh) | 一种快速检测大鼠白血病病毒的方法 | |
| CN113186353A (zh) | 针对c型逆转录病毒的数字pcr检测用引物及检测方法 | |
| CN114107569B (zh) | 一种快速鉴别牛痘病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN109576394B (zh) | 一种检测Nebovirus的SYBR Green荧光定量RT-PCR引物及应用 | |
| CN106755567B (zh) | 猴srv病毒实时荧光定量pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN113322353B (zh) | 一种检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒的rpa试剂盒 | |
| CN111206117A (zh) | 一种检测人类免疫缺陷病毒的试剂盒 | |
| CN117568493B (zh) | 一种用于鉴定昆虫细胞系的试剂及试剂盒 | |
| CN110714083B (zh) | 一种hela细胞污染检测方法 | |
| CN115323076B (zh) | 一种检测猴d型逆转录病毒的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109504807B (zh) | 用于检测4型疱疹病毒的核酸序列组合及其应用 | |
| CN117403009B (zh) | 一种用于联合检测四种牛源性rna病毒的试剂及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20201201 Assignee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Assignor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Contract record no.: X2023320010004 Denomination of invention: A primer probe, kit and application for detecting heterophilic mouse leukemia virus Granted publication date: 20210115 License type: Exclusive License Record date: 20230106 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A primer probe, kit and application for detecting heterophilic mouse leukemia virus Effective date of registration: 20230109 Granted publication date: 20210115 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Assignor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Contract record no.: X2023320010004 Date of cancellation: 20240203 |
|
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20210115 Pledgee: Jiangsu Jinmao Finance Leasing Co.,Ltd. Pledgor: LIANGCHEN BIO (SUZHOU) Corp. Registration number: Y2023320010019 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |