CN103140581A - 逆转录病毒检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测生物样品中病毒感染或污染的方法或组合物。

Description

逆转录病毒检测
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119要求对2010年7月16日递交的美国临时申请号61/365,297、2010年9月27日递交的美国临时申请号61/386,941以及2010年10月8日递交的美国临时申请号61/391,360的优先权，这些临时申请的公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于检测受试者或样品中的逆转录病毒的方法和组合物。
背景技术
异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)是最近发现的类似于异嗜性MLV的人γ逆转录病毒，但是其与异嗜性MLV在其包膜的序列是有区别的((Urisman等，PLOS pathogens2(3)：e25，2006；和Dong等，PNAS 104：1655，2007)。所有到目前为止检验的分离体均是彼此高度同源的(＞98％的序列同一性)，并使得与异嗜性MLV有区别。该序列保守的原因目前还不清楚。原始的感染克隆称为XMRV VP62(GenBank登录号EF185282)。
最初描述XMRV与前列腺癌有关，并提出进一步的相关(R.Schlaberg等，PNAS 2009，doi_10.1073_pnas.0906922106)，6-23％的前列腺癌患者检测呈阳性。另外，V.C.Lombardi等(Science 2009 doi10.1126/science.1179052)证明可能与慢性疲劳综合征相关，与3.7％的正常者相比，67％的患者检测呈阳性。来自研究者的在美国一般人群中的患病率的总体估计在2-4％的范围内。不过，在欧洲最近的几项研究都没有以相似的频率或相似的相关检测到XMRV(Fischer等，Journalof Clinical Virology 43：277-2832008；Hohn等，Retrovirology 6：92 2009；FJM vanKuppeveld等，BMJ 340：c1018，2010)。在德国的一项研究中，Fischer等发现105名前列腺癌患者中有1名以及70名对照受试者中有1名是XMRV阳性。Hohn等在德国筛查了589名前列腺癌患者，没有检测到一个阳性的。在荷兰，VanKuppeveld等在32名慢性疲劳综合征患者中或在42名匹配的对照者中也没有检测到任何DNA或RNA阳性。最近的来自Fischer等的另一篇文章(Emerg InfectDis.2010)显示，在德国的一项研究中，来自162名免疫抑制患者的痰的RNA约10％阳性，以及168名正常患者的痰RNA 2-3％阳性。这些测定看起来并没有不同，并且对差异并没有提供解释。
结果的不一致对目前测试方法的可靠性提出了质疑，特别是DNA扩增。根据Lombardi等的引领，所有研究者迄今用基于XMRV序列的引物应用巢式PCR，之后样品在凝胶上跑胶和寻找可见带(visible band)。已知该方法在灵敏度上是可变的，取决于核酸样品的质量。还描述了XMRV RNA的检测主要使用基于Urisman等，2006的Dong等的方法，PNAS 2007。在该测定中，RNA从组织和/或血液制备，逆转录为cDNA，以及通过使用XMRV特异性引物的QPCR检测cDNA。如所注意到的，这导致了不一致的结果(Enserink等，Science 329：18-19，2010)。对这些测试已声称不同的灵敏度，但是不可能验证这些中的任一个，并且这些测定看起来被不完全地表征。
最近已经开发了对人血液中XMRV的基于PCR的诊断筛选测定法(www[.]vipdx.com)，该测定法使用巢式PCR和扩增产物的凝胶检测(Lombardi等)，对于该巢式DNA PCR有约600个前病毒拷贝/测试的估计灵敏度。另外，Lombardi等的报道没有证明gag和env检测的完全一致，观察到在一些受试者中gag阳性和env阴性。这归因于在测定中的可变性。在所有目前开发的测定法中，已极小心地使用将区分MLV和XMRV的引物，以使得仅检测XMRV。因此，非常需要用于来自志愿者或患者的可得样品中的XMRV DNA和RNA的可靠且经过验证的测定法，以确定阳性的真实频率以及是否与疾病相关。另外，可靠的血液筛选测定是不可获得的。最近的数据表明在许多情况下XMRV的检测由人为产物(artifact)(Paprotka T.，Science，333，97-101，2011)或小鼠DNA的污染(Robinson MJ.等，Retrovirology，7：108 doi：10.1186/1742-4690-7-108，2010)引起的。
此外，基于MLV的基因治疗载体正被使用，包括基于复制型MLV的载体。例如，已经使用基于双嗜性MLV且携带额外的胞嘧啶脱氨酶基因的复制性逆转录病毒作为癌症治疗剂，所述癌症包括导致多形性成胶质细胞瘤(GBM)的原发性脑癌(Tai等，Mol.Ther.，12：842-851 2005；
http:(//)oba.od.nih.gov/oba/RAC/meetings/Jun2009/976_Aghi.pdf；
WO2010036986)。Tocagen公司(San Diego，CA)正在开发示例性载体，称为Toca511(临床试验.政府试验#NCT01156584)。Toca511给药后，给予患者5-氟胞嘧啶，其原位转化为有效的抗癌化合物5-氟尿嘧啶。由于病毒通常仅能在肿瘤中复制，这导致非常特异的抗癌效果。为了确定在肿瘤外是否存在复制，为了安全和/或与效力的相关性，需要检测血液中前病毒DNA和血浆中MLV RNA的测定法。FDA目前要求对经历使用整合型病毒载体进行此类研究性治疗的患者进行治疗后15年的随访(行业指南-基于逆转录病毒载体的基因治疗产品中和在使用逆转录病毒载体的临床试验中的患者随访过程中，测试复制型逆转录病毒的补充指导意见：FDA生物制品评价和研究中心，2006年11月；
http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/CellularandGeneTherapy/ucm072961.htm)。这需要测定法来完成，用于一般性的病毒性疾病以及特别是逆转录病毒性疾病的疾病风险和疾病进展的普遍接受的标记是是随着时间血液或血细胞中的病毒水平(Gurunathan S，Habib RE等，Vaccine.2009；27：1997-2015；Low A.，Okeoma CM.等，Virology 2009；385：455-463)。另一方面，在肿瘤中病毒的复制可能漏到外周和血流中，因此监测血液中作为DNA或RNA的病毒序列的出现和水平的测定可用于确定是否有有效的治疗以及是否需要修改治疗方案，例如再给予该病毒载体或使用将有利于病毒在肿瘤中复制的辅助剂(如类固醇)。
发明内容
本发明提供用于样品、组织或受试者中MLV相关多核苷酸的扩增和检测的寡核苷酸引物和探针。在一个实施方案中，本发明提供能够扩增多株MLV和XMRV的引物以及能够检测MLV或XMRV之一或两者的探针。在另一实施方案中，本发明提供引物和探针，用于监测经历用表达异源基因如胞嘧啶脱氨酶的复制型逆转录病毒治疗的受试者。在该实施方案中，使用“伴随”诊断以确保用于该治疗的载体的效果、表达、传播和长期感染。
因此，本发明提供分离的寡核苷酸，其由选自以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或表1或2中所列的任何序列和与任何前述序列至少95％相同且能与MLV相关的多核苷酸杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中，引物和探针可以与前述序列或表1或2中列出的序列在5′和/或3′端有1-10个核苷酸的不同。在另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：1和2以及与SEQ ID NO：1和2至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：4和5以及与SEQ ID NO：4和5至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：7和8以及与SEQ ID NO：7和8至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：10和11以及与SEQ ID NO：10和11至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：13和14以及与SEQID NO：13和14至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：16和17以及与SEQ ID NO：16和17至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，引物对由SEQ ID NO：19和20以及与SEQ ID NO：19和20至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成。在再另一个实施方案中，所述寡核苷酸包含选自XMRV和MLV之间同源区域的引物。
本发明还提供确定在将要经历或正在经历使用MLV相关病毒进行逆转录病毒基因递送治疗的受试者中病毒含量的方法，该方法包括：从所述受试者获得样品；在适合核酸扩增的条件下使所述样品与上述的一个或多个引物对接触，以获得扩增产物；使所述样品接触与扩增产物杂交的一个或多个探针；检测杂交产物；指示受试者具有包含MLV相关病毒的病毒含量。在一个实施方案中，所述MLV相关病毒是用于基因递送的重组逆转录病毒载体。在另一个实施方案中，所述MLV相关病毒是XMRV病毒。在再另一个实施方案中，在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之前进行所述方法。在再另一个实施方案中，在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之后进行所述方法。
MLV相关病毒包含5’LTR、gag基因、pol基因、env基因、与要递送的异源多核苷酸连接的env基因调节域3′和3’LTR以及在5’LTR中用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。在另一实施方案中，所述调节域是内部核糖体进入位点(IRES)。在再另一个实施方案中，所述异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。在实施方式和以上描述中，该方法监测MLV相关逆转录病毒载体的传播。在另一个实施方案中，该方法在病程年(course year)期间定期进行。
本发明还提供用于检测样品中病毒剂存在的方法，该方法包括：使用定量聚合酶链反应或其它扩增方法测量样品中多核苷酸的量，所述定量聚合酶链反应或其它扩增方法包括使用选自以下组成的组的寡核苷酸引物/探针组合：(i)SEQ ID NO：1、2和3；(ii)SEQ ID NO：4、5和6；(iii)SEQ ID NO：7、8和9；(iv)SEQ ID NO：10、11和12；和(v)根据权利要求9的引物对和与XMRV和MLV两者具有至少95％同一性的相应探针。在一个实施方案中，所述多核苷酸是DNA或RNA。
在以上各种实施方案中，通过定量聚合酶链反应例如RT-qPCR进行定量和扩增。在上述方法的任何一个中，该测量检测病毒剂相关核酸的单个拷贝。在前述实施方案的任何一个中，所述样品可以是哺乳动物组织(例如血液)。在前述实施方案的任何一个中，要检测的病毒剂可以是基因治疗载体。在一个实施方案中，所述基因治疗载体是复制型载体。在另一个实施方案中，在包括基因治疗载体治疗的治疗方案之前进行所述方法。在再另一个实施方案中，在包括基因治疗载体的治疗方案之后对受试者进行所述方法。可进行所述方法以监测受试者中包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。在再另一个实施方案中，所述基因治疗载体包括复制型MLV载体。在再另一个实施方案中，在包括基因治疗载体的治疗方案之前进行所述方法。在一个实施方案中，在包括基因治疗载体的治疗方案之后进行所述方法。在再另一个实施方案中，可进行所述方法以监测包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。
本发明还提供用于进行前述方法中任何一个且包含本发明公开的寡核苷酸组合物(例如SEQ ID NO：1-21，表1和2)中任何一个的试剂盒。
本发明还提供用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的＜100拷贝的MLV相关DNA的方法。本发明还提供用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的＜100拷贝的MLV相关RNA的方法。
本发明还提供检测MLV和XMRV两者以及它们的变体的方法。在其它实施方案中，所述方法仅检测MLV相关的病毒，而不检测XMRV。在某些实施方案中，所述方法检测XMRV gag和MLV gag。在再另一个实施方案中，所述方法检测XMRV pol和MLV pol。本发明提供检测XMRV Env和MLV Env的方法。本发明还提供用于检测来自哺乳动物宿主的血浆或血清中XMRV或MLV相关病毒的方法。
本发明提供选择性检测人中MLV相关病毒而不检测XMRV的方法，该方法包括使用选自以下组成的组的引物：SEQ ID NO：10和11；SEQ ID NO：13和14；SEQ ID NO：16和17；SEQ ID NO：19和20；与前述序列至少95％相同的序列；及它们的组合，使用本文所述的方法。
本发明还提供确定人受试者是否有患前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险的方法，所述方法包括使用如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的引物对和探针或如表1或2所述的引物/探针扩增来自受试者的样品中的多核苷酸，其中扩增产物的存在指示前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险。
本发明还提供针对MLV、MLV变体或XMRV感染筛选血液供给或组织库的方法，所述方法包括利用如SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13、14所述的引物或表1或2中的任何引物针对血液供给和组织库进行扩增反应，和检测扩增产物。
本发明涉及可在人组织血液或血清中存在的异嗜性鼠白血病病毒相关病毒(XMRV)或与鼠白血病病毒相关的其它逆转录病毒的检测。特别地，本发明涉及敏感可靠的定量PCR测定，用于检测来自人和动物受试者血液DNA中XMRV前病毒，以及通过反转录(RT)和聚合酶链反应用于敏感且可靠地检测来自人和动物受试者血浆或血清的XMRV RNA(可能来自病毒颗粒)。在一个实施方案中，定量测定是使用基于XMRV病毒基因组构建的引物和探针的测定法。与使用XMRV特异性引物/探针组和避免与MLV同源的引物/探针组的其他技术相反，本发明构建基于PCR的测定法，其通过使用MLV特异性qPCR引物和探针检测人样品中可以是或不是XMRV的MLV相关病毒，该测定法还检测XMRV。这些测定法可与用于与XMRV不同源的MLV序列的测定法组合以确定在用复制型逆转录病毒治疗的患者中是否发生了重组，所述患者还可以是XMRV阳性的。本发明还涉及包含用于检测XMRV和MLV相关病毒的核酸分子的诊断试剂盒。此外，为了当监测用MLV相关载体治疗的患者时，检测MLV载体，本发明还公开了检测由MLV载体携带的转基因的诊断试剂盒。
本发明的一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明中阐述。从所述说明和附图及权利要求，其它特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
图1显示在pUC57-XMRV gag质粒DNA中的XMRV gag标准。插入相应于XMRV VP62克隆序列(NC_007815)的核苷酸628至764。衍生的序列由BioBasic公司合成，并在BamHI和ApaI位点之间的Sma I位点插入pUC57骨架(backone)中。
图2显示在pET28b-XMRV env质粒DNA中的XMRV env标准序列。插入相应于XMRV VP62克隆序列(NC_007815)的核苷酸6252至6391。衍生的序列由BioBasic公司合成，并在BssHI和HpaI位点之间的EcoRV位点插入pET28b+骨架中。
图3显示在pAZ3-emd质粒DNA中的MLV pol1和pol2标准序列，该pAZ3-emd质粒DNA编码亲嗜性莫洛尼MLV gag-pol、双嗜性env和env下游的IRES-GFP emd盒(Logg等.J.Virol.75：6989-6998，2001)。
图4显示用于治疗GBM患者的Toca511(前病毒形式)和XMRV前病毒(VP62，NCBI参考序列NC_007815.1)序列的比较，注意LTR、gag、pol和包膜区域的全部同源性。还显示pol1和pol2扩增子区域。在pAZ3-emd质粒DNA中的MLV pol1和pol2标准序列。
图5显示XMRV序列(VP62，NCBI ref.NC_007815.1，目标序列(Sbjct))和MoMLV(NCBI参考NC_001501.1，待查序列(query))的BLAST核酸序列比较，显示完全同源的20个或更多个核苷酸序列(下划线/高亮显示)。
图6显示在1E0至1E7的pUC57-XMRV gag质粒DNA扩增曲线中的XMRVgag标准。
图7显示在1E0至1E7的pET28b-XMRV env质粒DNA扩增曲线中的XMRV env标准。
图8A-C显示a)1阶段qPCR方案：用XMRV gag引物/探针组靶向的pUC57-XMRV gag质粒标准。用XMRV gag引物靶向TE中的pUC57-XMRV gag质粒DNA，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差；b)显示1阶段qPCR方案：用XMRV gag引物/探针组靶向的对照。用XMRV gag引物/探针组靶向22Rv1 gDNA阳性对照、未感染
Figure BDA00002925186900081
人血液gDNA阴性对照和NTC，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出”；c)显示1阶段qPCR方案：用XMRV gag引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂(neat)人血液gDNA中掺入8个对数(log)浓度的pUC57-XMRV gag质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV gag引物/探针组靶向样品，并进行1阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝/反应和输入拷贝/反应的％回收率(％回收率通过使用以下公式确定：检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应再乘以100)。
图9A-C显示a)1阶段qPCR方案：用XMRV env引物/探针组靶向的pET28b-XMRV env质粒标准。用XMRV env引物靶向在TE中的pET28b-XMRVenv质粒DNA，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差；b)显示1阶段qPCR方案：用XMRV env引物/探针组靶向对照。用XMRV env引物/探针组靶向22Rv1 gDNA阳性对照、未感染人血液gDNA阴性对照和NTC，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出”；c)显示1阶段qPCR方案：用XMRV env引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂人血液gDNA中掺入8个对数浓度的pET28b-XMRV env质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV env引物/探针组靶向样品，并进行1阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝/反应和输入拷贝/反应的％回收率(％回收率通过使用以下公式确定：检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应乘以100)。
图10A-C显示a)1阶段qPCR方案：用XMRV pol2引物/探针组靶向的pAZ3-emd pol2质粒标准。用XMRV pol2引物靶向TE中的pAZ3-emd pol2质粒DNA，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct和标准差；b)显示1阶段qPCR方案：用XMRV pol2引物/探针组靶向对照。用XMRV pol2引物/探针组靶向22Rv1 gDNA阳性对照和未感染人血液gDNA阴性对照，并进行1阶段qPCR方案。计算平均Ct、标准差和拷贝数/反应。“ND”意思是“未检出”；c)显示1阶段qPCR方案：用XMRV pol2引物/探针组靶向的掺入的人血液gDNA。未掺杂人血液gDNA中掺入8个对数浓度的pAZ3-emd pol2质粒DNA(1E0至1E8个拷贝/反应)。用XMRV pol2引物/探针组靶向样品，并进行1阶段qPCR方案。确定平均Ct、标准差、拷贝数/反应和输入拷贝/反应的％回收率(％回收率通过使用以下公式确定：检测到的拷贝/反应除以输入拷贝/反应乘以100)。
图11A-B显示a)0阶段比1阶段qPCR方案：pUC57 XMRV gag标准。进行0阶段和1阶段qPCR方案，使用XMRV gag引物靶向pUC57 XMRV gag质粒。‘pUC57 XMRV gag’指掺入单个qPCR反应中的pUC57 XMRV gag拷贝数；b)显示0阶段对比1阶段qPCR方案：pUC57 XMRV gag掺入物到CA人血液gDNA中。进行0阶段和1阶段qPCR方案，靶向pUC57 XMRV gag掺入物到CA人血液gDNA中，并使用XMRV gag引物。‘pUC57 XMRV gag/001 gDNA’指在单个qPCR反应中掺入到供体001 gDNA中的pUC57 XMRV gag拷贝数，′001′指′供体#001′，′ND′意思是‘未检出’。
图12A-B)显示a)0阶段对比1阶段qPCR方案：pET28b XMRV env标准。进行0阶段和1阶段qPCR方案，使用XMRV env引物靶向pET28b XMRV env质粒。‘pET28b XMRV env’指掺入到单个qPCR反应中的pET28b XMRV env拷贝数；b)显示0阶段对比1阶段qPCR方案：pET28b XMRV env掺入物到001人血液gDNA中。进行0阶段和1阶段qPCR方案，靶向pET28b XMRV env掺入物到001人血液gDNA中，并使用XMRV env引物。‘pET28b XMRV env/001gDNA’指在单个qPCR反应中掺入供体001gDNA中的pET28b XMRV env拷贝数，′001′指′供体#001′，′ND′意思是‘未检出’。
图13A-B显示0阶段对比1阶段qPCR方案：pAZ3-emd pol2标准。进行0阶段和1阶段qPCR方案，使用XMRV pol2引物靶向pAZ3-emd pol2质粒。‘pAZ3-emd pol2’指掺入到单个qPCR反应中的pAZ3-emd pol2拷贝数；′ND′意思是‘未检出’；b)显示0阶段比1阶段qPCR方案：pAZ3-emd pol2掺入物到001人血液gDNA中。进行0阶段和1阶段qPCR方案，将pAZ3-emd pol2掺入物(spike in)靶向入001人血液gDNA中，并使用XMRV pol2引物。‘pAZ3-emdpol2/001 gDNA’指在单个qPCR反应中掺入供体001gDNA中的pAZ3-emd pol2拷贝数，′001′指′供体#001′，′ND′意思是‘未检出’。
图14显示使用MLV和ENV2引物组从被MLV感染的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)中检测MLV。将Paz3-emd掺入物加入到100ng冻存的新鲜肿瘤样品中或加入到100ng FFPE DNA肿瘤样品中。使用MLV和ENV2引物组进行qPCR。
图15显示通过RTPCR使用XMRV特异性引物组XMRV gag、XMRV pol2、XMRV env检测全血中XMRV。
图16A-B显示使用本文描述的用于全血DNA中的前病毒DNA(MLVLTR引物和探针)、用于血浆中的病毒RNA(通过env RT-PCR)以及用于血浆中的抗病毒抗体反应的测定法监测患者随着时间的结果。这些受试者(复发性多形性成胶质细胞瘤(GBM)患者)通过颅内注射2.6x103TU/g脑的编码修饰的酵母胞嘧啶脱氨酶的T5.0002双嗜性MLV逆转录病毒(WO2010036986、WO2010045002)治疗，之后给予约130mg/kg/日的5-氟胞嘧啶疗程。(A)患者101；(B)患者102。
具体实施方式
此外，除非另有说明，使用“或”是指“和/或”。类似地，“包含”、“包括”和“含有”是可互换的，而无意于是限制性的。
还应理解，对于各种实施方案的描述使用术语“包含”时，本领域技术人员应理解，在一些特定的情况下，实施方案或者可使用语言“基本由......组成”或“由......组成”进行描述。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所描述的那些的方法和试剂可用于实践所公开的方法和组合物，现说明示例性的方法和材料。
如本文及所附的权利要求书中所用，除非上下文清楚地另有规定，“一”和“该”包括复数对象。因此，例如，提及“一寡核苷酸”包括多个此类寡核苷酸，而提及“该多核苷酸”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个多聚核苷酸，等等。
通过核酸扩增技术在人或动物组织、血液或血浆/血清中检测XMRV或MLV相关的逆转录病毒用于确定前列腺癌及其风险、慢性疲劳系统及其风险、血液供应和组织捐赠材料的污染以及追踪受试者状态，所述受试者接受使用包含异源基因序列的MLV衍生治疗性病毒例如基于双嗜性MLV的工程化逆转录复制(replicatog)病毒(例如Toca511)的治疗。例如，本发明的方法和组合物可用于监测使用包含与MLV基本上相同的序列的逆转录病毒载体的治疗，以确定在治疗载体和XMRV或其它MLV相关的自然感染之间是否发生重组，以及用于确定受试者是否携带XMRV或其它MLV相关的自然存在病毒。所述测定法还可用于筛选血液供应以排除XMRV或其它MLV相关逆转录病毒阳性的受试者。所述测定法还可用于确定随时间MLV相关病毒的水平，并提供何时开始给予抗逆转录病毒治疗是有用的信息，该抗逆转录病毒治疗对于抗MLV也是有活性的，例如AZT(Sakuma等，Virology，2009；Powell等，J.Virol.，73：8813-8816，1999；G.B.Beck-Engeser，PNAS，2009)。所述测定法当与组织病理学样品一起使用时可用于确定患者储存样品中XMRV或其它MLV相关逆转录病毒的存在与否，或用于确定XMRV或MLV相关病毒的流行病学。所述测定法还可用于监测已被给予基于复制MLV载体的治疗性载体的患者。这些测量可用于跟踪随着时间的推移治疗的安全性(例如，至15年及以上)，这是因为基因组DNA中持续高水平(大于30,000、100,000或300,000拷贝/微克)的MLV或大于30,000、100,000或300,000RNA拷贝/ml血浆)或随时间增加水平的这些，可作为信号来更加密切监测可能是使用包含MLV或MLV相关序列的基因治疗载体治疗继发的疾病如白血病，或来开始抗逆转录病毒治疗。不过，由于“溢出”到循环系统的可能性，还可以使用这些测量判断靶组织中MLV或MLV相关载体复制的程度(即成功治疗的效力或易感性)。这些测定法用于临床监测的其它应用对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
可监测的工程化逆转录病毒载体包括下述的那些：
RCR载体-pAC-yCD2
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg
ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc
gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa
gcagagctgg tttagtgaac cggcgccagt cctccgattg actgagtcgc ccgggtaccc gtgtatccaa
taaaccctct tgcagttgca tccgacttgt ggtctcgctg ttccttggga gggtctcctc tgagtgattg
actacccgtc agcgggggtc tttcatttgg gggctcgtcc gggatcggga gacccctgcc cagggaccac
cgacccacca ccgggaggta agctggccag caacttatct gtgtctgtcc gattgtctag tgtctatgac
tgattttatg cgcctgcgtc ggtactagtt agctaactag ctctgtatct ggcggacccg tggtggaact
gacgagttcg gaacacccgg ccgcaaccct gggagacgtc ccagggactt cgggggccgt ttttgtggcc
cgacctgagt ccaaaaatcc cgatcgtttt ggactctttg gtgcaccccc cttagaggag ggatatgtgg
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ttgtctgaga atatgggcca gactgttacc actcccttaa gtttgacctt aggtcactgg aaagatgtcg
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gccaaccttt aacgtcggat ggccgcgaga cggcaccttt aaccgagacc tcatcaccca ggttaagatc
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cttttgaccc ccctccctgg gtcaagccct ttgtacaccc taagcctccg cctcctcttc ctccatccgc
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tctctaggcg ccaaacctaa acctcaagtt ctttctgaca gtggggggcc gctcatcgac ctacttacag
aagacccccc gccttatagg gacccaagac cacccccttc cgacagggac ggaaatggtg gagaagcgac
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gccgactcca ctacctcgca ggcattcccc ctccgcgcag gaggaaacgg acagcttcaa tactggccgt
tctcctcttc tgacctttac aactggaaaa ataataaccc ttctttttct gaagatccag gtaaactgac
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ctgctgaccg gagaagaaaa acaacgggtg ctcttagagg ctagaaaggc ggtgcggggc gatgatgggc
gccccactca actgcccaat gaagtcgatg ccgcttttcc cctcgagcgc ccagactggg attacaccac
ccaggcaggt aggaaccacc tagtccacta tcgccagttg ctcctagcgg gtctccaaaa cgcgggcaga
agccccacca atttggccaa ggtaaaagga ataacacaag ggcccaatga gtctccctcg gccttcctag
agagacttaa ggaagcctat cgcaggtaca ctccttatga ccctgaggac ccagggcaag aaactaatgt
gtctatgtct ttcatttggc agtctgcccc agacattggg agaaagttag agaggttaga agatttaaaa
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gagaggaacg tatcaggaga gaaacagagg aaaaagaaga acgccgtagg acagaggatg agcagaaaga
gaaagaaaga gatcgtagga gacatagaga gatgagcaag ctattggcca ctgtcgttag tggacagaaa
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cctgacccta gatgactagg gaggtcaggg tcaggagccc ccccctgaac ccaggataac cctcaaagtc
ggggggcaac ccgtcacctt cctggtagat actggggccc aacactccgt gctgacccaa aatcctggac
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gaccaatggg gcagcccctg caagtgttga ccctaaatat agaagatgag catcggctac atgagacctc
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ggcatgggac tggcagttcg ccaagctcct ctgatcatac ctctgaaagc aacctctacc cccgtgtcca
taaaacaata ccccatgtca caagaagcca gactggggat caagccccac atacagagac tgttggacca
gggaatactg gtaccctgcc agtccccctg gaacacgccc ctgctacccg ttaagaaacc agggactaat
gattataggc ctgtccagga tctgagagaa gtcaacaagc gggtggaaga catccacccc accgtgccca
acccttacaa cctcttgagc gggctcccac cgtcccacca gtggtacact gtgcttgatt taaaggatgc
ctttttctgc ctgagactcc accccaccag tcagcctctc ttcgcctttg agtggagaga tccagagatg
ggaatctcag gacaattgac ctggaccaga ctcccacagg gtttcaaaaa cagtcccacc ctgtttgatg
aggcactgca cagagaccta gcagacttcc ggatccagca cccagacttg atcctgctac agtacgtgga
tgacttactg ctggccgcca cttctgagct agactgccaa caaggtactc gggccctgtt acaaacccta
gggaacctcg ggtatcgggc ctcggccaag aaagcccaaa tttgccagaa acaggtcaag tatctggggt
atcttctaaa agagggtcag agatggctga ctgaggccag aaaagagact gtgatggggc agcctactcc
gaagacccct cgacaactaa gggagttcct agggacggca ggcttctgtc gcctctggat ccctgggttt
gcagaaatgg cagccccctt gtaccctctc accaaaacgg ggactctgtt taattggggc ccagaccaac
aaaaggccta tcaagaaatc aagcaagctc ttctaactgc cccagccctg gggttgccag atttgactaa
gccctttgaa ctctttgtcg acgagaagca gggctacgcc aaaggtgtcc taacgcaaaa actgggacct
tggcgtcggc cggtggccta cctgtccaaa aagctagacc cagtagcagc tgggtggccc ccttgcctac
ggatggtagc agccattgcc gtactgacaa aggatgcagg caagctaacc atgggacagc cactagtcat
tctggccccc catgcagtag aggcactagt caaacaaccc cccgaccgct ggctttccaa cgcccggatg
actcactatc aggccttgct tttggacacg gaccgggtcc agttcggacc ggtggtagcc ctgaacccgg
ctacgctgct cccactgcct gaggaagggc tgcaacacaa ctgccttgat atcctggccg aagcccacgg
aacccgaccc gacctaacgg accagccgct cccagacgcc gaccacacct ggtacacgga tggaagcagt
ctcttacaag agggacagcg taaggcggga gctgcggtga ccaccgagac cgaggtaatc tgggctaaag
ccctgccagc cgggacatcc gctcagcggg ctgaactgat agcactcacc caggccctaa agatggcaga
aggtaagaag ctaaatgttt atactgatag ccgttatgct tttgctactg cccatatcca tggagaaata
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cgaggctaga ggcaaccgga tggctgacca agcggcccga aaggcagcca tcacagagac tccagacacc
tctaccctcc tcatagaaaa ttcatcaccc tacacctcag aacattttca ttacacagtg actgatataa
aggacctaac caagttgggg gccatttatg ataaaacaaa gaagtattgg gtctaccaag gaaaacctgt
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ccgcagggag acagcggacc cggacttttg acttttacgt gtgccctggg cataccgtaa agtcggggtg
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accacagatt attgtgtatt agttgaactc tggcccagag taatttacca ctcccccgat tatatgtatg
gtcagcttga acagcgtacc aaatataaaa gagagccagt atcattgacc ctggcccttc tactaggagg
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actgatctta ctctttggac cttgcattct caatcgattg gtccaatttg ttaaagacag gatctcagtg
gtccaggctc tggttttgac tcagcaatat caccagctaa aacccataga gtacgagcca tgaacgcgtt
actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt
cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc
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aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt
tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc
cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac
gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga ttataaatgg tgaccggcgg
catggcctcc aagtgggatc aaaagggcat ggatatcgct tacgaggagg ccctgctggg ctacaaggag
ggcggcgtgc ctatcggcgg ctgtctgatc aacaacaagg acggcagtgt gctgggcagg ggccacaaca
tgaggttcca gaagggctcc gccaccctgc acggcgagat ctccaccctg gagaactgtg gcaggctgga
gggcaaggtg tacaaggaca ccaccctgta caccaccctg tccccttgtg acatgtgtac cggcgctatc
atcatgtacg gcatccctag gtgtgtgatc ggcgagaacg tgaacttcaa gtccaagggc gagaagtacc
tgcaaaccag gggccacgag gtggtggttg ttgacgatga gaggtgtaag aagctgatga agcagttcat
cgacgagagg cctcaggact ggttcgagga tatcggcgag taagcggccg cagataaaat aaaagatttt
atttagtctc cagaaaaagg ggggaatgaa agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg
ccattttgca aggcatggaa aaatacataa ctgagaatag agaagttcag atcaaggtca ggaacagatg
gaacagctga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac
agatggaaca gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca
agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt
gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag ttcgcttctc gcttctgttc
gcgcgcttct gctccccgag ctcaataaaa gagcccacaa cccctcactc ggggcgccag tcctccgatt
gactgagtcg cccgggtacc cgtgtatcca ataaaccctc ttgcagttgc atccgacttg tggtctcgct
gttccttggg agggtctcct ctgagtgatt gactacccgt cagcgggggt ctttcattac atgtgagcaa
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt
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RCR载体-pAC-yCD
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本发明公开用于检测靶分子例如包含病毒RNA或DNA的靶核酸的测定法，该测定法使用多种核酸扩增技术，包括例如NAAT(J.D.Fox，J.Clin.Virol.40Suppl.1S15-S23，2007)、PCR、RT-PCR、qPCR及使用“降落”修改以提高对单拷贝/测定灵敏度的RT-qPCR；基于RNA转录的测定(例如类似于HIV-1 Aptiva测定，参见http:(//)www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisease/ucm149922.htm)；“支链DNA”系统(参见例如Anastassopoulou等，Journal ofVirological Methods，91：67-74，2001)；以及本领域技术人员已知的NAAT的进一步变化。本发明还公开了针对从组织学固定的样品中提取的核酸样品使用NAAT的方法。
在许多实施方案中可使用本发明提供的测定法以检测序列特异性核酸。本发明公开了使用扩增(例如PCR)和RNA/DNA异源双链体酶促降解的测定法的不同实施方案。
总体上，本发明提供确定受试者或样品中MLV相关病毒多核苷酸的方法。本发明利用与MLV相关病毒的保守区具有同一性的引物和探针的组合。使用引物用于扩增样品中的靶多核苷酸，然后使用探针使扩增产物可视化或检测扩增产物。通常，探针被可检测地标记用于检测(例如荧光标记、发光标记、酶结合、放射性核素标记等)。本发明的一个优点是可使用引物对扩增样品中的MLV相关多核苷酸，如MLV、XMRV或MLV和XMRV多核苷酸。这对于检测XMRV及其天然存在的变体以及用于检测MLV及其天然存在的变体(包括重组工程化的MLV载体)是有利的。
例如，可使用本文所确定的引物和探针组合，通过使用与MLV具有同源性的引物对(例如XMRV病毒序列和MLV病毒序列之间具有至少95％序列同一性的引物对)和XMRV特异性探针序列(例如仅在高严谨条件下与扩增产物杂交的探针)，来鉴定或检测样品、组织或受试者中的XMRV。XMRV和MLV之间具有此类同源性的引物在图5和表2中确定。
该通用方法的一个功用是筛选针对感染的血液和组织供应。已提示XMRV与前列腺癌和慢性疲劳综合征有关。在另一个功用中，可在接受重组逆转录病毒载体治疗之前筛选受试者。通过鉴定可能在组织中具有循环病毒多核苷酸的受试者，可控制固有病毒多核苷酸和治疗性病毒多核苷酸之间的重组风险。
在另一个通用实施例中，可使用本文所确定的引物和探针组合，通过使用与MLV具有同源性的引物对(例如XMRV病毒序列和MLV病毒序列之间具有至少95％序列同一性的引物对)和MLV特异性探针序列(例如仅在高严谨条件下与扩增产物杂交的探针)以鉴定或检测样品、组织或受试者中的MLV或MLV相关多核苷酸。
在本文描述的通用性方法的另一个实施方案中，所述方法提供用于在递送复制型MLV相关病毒载体之后监测患者的有用的诊断。该方法可用于递送载体之后基于常规(例如每周、每月、每年)以治疗医生认为必要长的时间监测受试者。
如本文所用的“MLV相关病毒”指包含MLV病毒的一般性结构(例如LTR-gag-pol-env-LTR)并与以下以确定登录号所列序列(通过引用以其整体合并入本文)中的任何一个具有至少60％同一性的逆转录病毒：
异嗜性鼠白血病病毒分离株LAPC4，全基因组(8,657bp线性DNA，JF908816.1GI：336462519)；异嗜性鼠白血病病毒分离株VCaP，全基因组(8,657bp线性DNA，JF908815.1GI：336462515)；鼠白血病病毒N417，全基因组(8,189bp线性RNA，HQ246218.1 GI：313762331)；莫洛尼鼠白血病病毒神经致病性(neuropathogenic)变体ts1-92b，全基因组(8,332bp线性DNA，AF462057.1GI：18448741)；DG-75鼠白血病病毒，全基因组(8,207bp线性RNA，AF221065.1GI：11078528)；劳舍尔鼠白血病病毒，全基因组(8,282bp线性DNA，NC_001819.1GI：9629514)；鼠白血病病毒SL3-3，全基因组(8,377bp线性RNA，AF169256.1GI：5881088)；鼠白血病病毒株SRS 19-6全基因组(8,256bp线性DNA，AF019230.1GI：4071074)；印度侏儒小鼠(Mus dunni)内源性病毒全基因组(8,655bp线性DNA，AF053745.1GI：3309122)；莫洛尼鼠白血病病毒，全基因组(8,332bp线性RNA，AF033811.1GI：2801468)；鼠C型逆转录病毒，全基因组(8,135bp线性DNA，NC_001702.1GI：9628654)；劳舍尔鼠白血病病毒，全基因组(8,282bp线性DNA，U94692.1GI：2228757)；鼠白血病病毒分离株NeRV，全基因组(8,273bp线性RNA，DQ366149.1GI：86651892)；鼠白血病病毒血清型HEMV前病毒，全基因组(8,546bp线性DNA，AY818896.1GI：55979252)；鼠白血病病毒株BM5eco，全基因组(8,281bp线性DNA，AY252102.1GI：30908470)；鼠白血病病毒MCF1233，全基因组(8,196bp线性DNA，U13766.1GI：535516)；MuLV(株RadLV/VL3(T+L+))RNA，全基因组(8,394bp线性RNA，K03363.1GI：332032)；雪貂细胞灶形成247MuLV env基因，3′端和LTR(1,164bp线性RNA，J02249.1GI：332023)；Friend鼠白血病病毒，全基因组(8,282bp线性RNA，M93134.1GI：331898)；Friend鼠白血病病毒，全基因组(8,323bp线性RNA，NC_001362.1GI：9626096)；Friend鼠白血病病毒(F-MuLV)全RNA基因组(8,359bp线性RNA，X02794.1GI：61544)；原鸡(Gallus gallus)MLV相关内源性逆转录病毒，全基因组(9,133bp线性DNA，DQ280312.2GI：169805278)；Friend鼠白血病病毒基因组RNA，全基因组，克隆：A8(8,358bp线性RNA，D88386.1GI：2351211)；PreXMRV-1前病毒，全基因组(8,197bp线性DNA；NC_007815.2GI：339276104)；异嗜性MuLV相关病毒RKO，全基因组(8,172bp线性DNA，JF274252.1GI：338191621)；XMRV全前病毒基因组，分离株S-162(8,562bp线性DNA，FR872816.1GI：336087897)；PreXMRV2全前病毒基因组(8,193bp线性DNA，FR871850.1GI：334849718)；异嗜性MuLV相关病毒22Rv1/CWR-R1全前病毒基因组(8,185bp线性DNA，FN692043.2GI：334717372)；异嗜性MuLV相关病毒分离株xmlv15，全基因组(8,176bp线性RNA，HQ154630.1GI：320091412)；PreXMRV-1全前病毒基因组(8,197bp线性DNA，FR871849.1GI：334849715)；异嗜性MuLV相关病毒VP62，全基因组(8,185bp线性RNA，DQ399707.1GI：88765817)；异嗜性MuLV相关病毒VP42，全基因组(8,185bp线性RNA，DQ241302.1GI：82582299)；异嗜性MuLV相关病毒VP35，全基因组(8,185bp线性RNA，DQ241301.1GI：82582295)；异嗜性MuLV相关病毒VP62，全基因组(8,165bp线性RNA，EF185282.1GI：121104176)；具有杂合双嗜性/莫洛尼鼠白血病病毒的质粒pAMS，全序列(11,328bp环状DNA，AF010170.1GI：2281586)；双嗜性鼠白血病病毒株1313，全基因组(8,217bp线性DNA，AF411814.1GI：28892668)；Toca511，包含编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的重组复制型MLV(参见例如PCT/US2009/058512的SEQ ID NO：19、20和22，该申请通过引用并入本文)。
可使用许多不同的比对程序确定前述MLV相关基因组的任何组合之间同一性的区域。通过使用BLAST算法或其它类似的算法确定与前述序列具有同源性/同一性的序列，将容易地确定其它基因组。
在一些实施方案中，本发明涉及检测样品中包括XMRV在内的MLV相关病毒的方法，该方法包括使所述样品与核酸序列接触，该核酸序列在检测核酸序列和XMRV核酸序列之间的杂交复合体能够发生的条件下与XMRV核酸序列的全部或部分杂交。在相关的实施方案中，XMRV特异性引物与SEQ ID NO：1和2具有95％或更高的同一性，而探针与SEQ ID NO：3(XMRV gag)具有95％或更高的同一性。在进一步的相关实施方案中，XMRV特异性引物与SEQ ID NO：4和5具有95％或高的同一性，而探针与SEQ ID NO：6(XMRV env)具有95％或更高的同一性。在又一个实施方案中，该方法使用引物和探针的组合(例如SEQID NO：1、2、4和5，以及包含SEQ ID NO：3和6的探针)。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过使用不是XMRV特异性的而是XMRV和其它MLV相关株之间共有的引物和探针来检测样品中XMRV或其它MLV相关核酸的方法。在相关的实施方案中，MLV/XMRV特异性引物是SEQ IDNO：7和8，而探针是SEQ ID NO：9(Pol2引物和探针；其它引物和探针如以下表1、2、3和4所示)。在进一步的相关实施方案中，MLV/XMRV特异性引物是SEQ ID NO：10和11，而探针是SEQ ID NO：12(pol1引物和探针)。在进一步的相关实施方案中，可以确定XMRV和MLV共有的其它序列(参见XMRV和MLV两个基因组BLAST序列比较，图5，其中20或更多个碱基的完美序列同源性被下划线/高亮显示)。可以使用这些同源序列(或降至15个碱基的较短的同源性延伸)以选择引物和探针。或者，可使用比较序列并提示共有引物和探针的程序来选择引物和探针。通常设计此类程序以寻找不同物种中的相关基因，并能用于设计用于具有显著但不完全同源性的分子例如MLV和XMRV的QPCR试剂。所述程序的实例是Primaclade
http:(//)www.umsl.edu/services/kellogg/primaclade/FAQ.html.。
寡核苷酸探针或引物指8至2000个核苷酸长度的核酸分子，或具体指约6至1000个核苷酸长度。更具体地，这些寡核苷酸的长度可以在约8、10、15、20或30至100个核苷酸范围，但通常将是约10至50个(例如15至30个核苷酸)。在特定条件下本发明的测定中的寡核苷酸的适当长度可以由本领域技术人员经验性地确定。如本文所用，与参考序列具有至少95％同一性的引物和探针指所述序列包括长度上与参考序列是相同数目的核苷酸但与参考序列在核苷酸上具有5％不同的序列。此外，与参考序列具有至少95％同一性所组成且在所述寡核苷酸的5′和/或3′末端具有1-10个添加或缺失的核苷酸的引物和探针指序列在长度上与参考序列有1至多达20个核苷酸不同且在同一性上也有5％或更低的不同。因此，本文公开的任何引物和探针由参考序列(例如SEQ ID NO：1-21或列于表1和2中的序列)组成；可以由与参考序列(例如SEQ ID NO：1-21或列于表1和2中的序列)具有95％或更高同一性的序列所组成；或者可以由至少95％相同且在参考序列(例如SEQ ID NO：1-21或列于表1和2中的序列)的5′和/或3′末端具有添加的1-20个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)核苷酸的序列所组成。
寡核苷酸引物和探针可以通过包括直接化学合成在内的任何合适的方法制备，可获得许多具有衍生的寡核苷酸的探针系统以杂交和检测扩增产物，通常通过结合探针靶标的荧光变化来检测。寡核苷酸引物和探针可以包含常规核苷酸以及各种类似物中的任何一个。例如，如本文所用，术语“核苷酸”指包含连接到糖如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物的C-1′碳上的核苷酸碱基的化合物。术语核苷酸还包含核苷酸类似物。糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖包括但不限于其中一个或多个碳原子例如2′-碳原子被一个或多个相同或不同的Cl、F、--R、--OR、--NR2或卤素基团所取代的核糖，其中各R独立地为H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。示例性的的核糖包括但不限于2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′，3′-二脱氢核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯代核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖和2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脱氧核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′-卤代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖以及2′-烷基核糖例如2′-O-甲基，4′-α-异头核苷酸、1′-α-异头核苷酸、2′-4′-和3′-4′连接及其它“锚定”或“LNA”、二环糖修饰(参见例如PCT申请公开号WO98/22489；WO98/39352；以及WO99/14226)。
在核糖2′-或3′-位上的修饰包括但不限于氢、羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氨基、烷基氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不限于天然D型旋光异构体以及L型旋光异构体形式(参见例如Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.21：4159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.112：7435；Urata，(1993)Nucleic AcidsSymposium Ser.No.29：69-70)。当核苷酸碱基是嘌呤，例如A或G时，则核糖连接到核苷酸碱基的N9-位。当核苷酸碱基是嘧啶，例如C、T或U，则戊糖连接到核苷酸碱基的N1-位，除外假尿嘧啶核苷，在假尿嘧啶核苷中戊糖连接到尿嘧啶核苷酸碱基的C5位(参见例如Kornberg和Baker，(1992)DNA Replication，第二版，Freeman，San Francisco，Calif.)。探针的3′末端可用捕获或可检测的标记物官能化以协助靶多核苷酸或多态性的检测。
通过掺入可检测的标记物可标记本发明的任何寡核苷酸或核酸，该可检测的标记物通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可测量。例如，所述标记物可包括放射性物质(例如32P、35S、3H、125I)、荧光染料(例如5-溴脱氧尿苷(5-bromodesoxyuridin)、荧光素、乙酰氨基芴、地高辛)，分子淬灭剂(例如黑洞、分子信标)、生物素、纳米粒子以及本领域技术人员已知的其它物质。所述寡核苷酸通常在其3′和/或5′末端标记。
探针指能够可检测地区分基因表达变化或能够区分结构不同的靶分子的分子。可通过各种不同的方法完成检测，其取决于所用的探针的类型和靶分子的类型。因此，例如，检测可以基于靶分子的活性水平的差异，但是通常基于特异性结合的检测。所述特异性结合的实例包括核酸探针杂交。因此，例如，探针可以包括核酸杂交探针(包括可用于多核苷酸扩增和/或检测的引物)。因此，在一个实施方案中，至少一个靶多核苷酸的存在与否的检测涉及使生物样品与探针或引物对接触。典型地，当探针/引物与生物样品中含有互补序列的一种形式的靶多核苷酸杂交时，该寡核苷酸探针或引物对使用杂交选择性条件进行杂交。所述寡核苷酸探针可以包括一个或多个核酸类似物、标记物或其它取代基或部分，只要保留碱基配对功能。
本发明提供用于鉴定和定量给定样品中给定核酸序列的量(通常低至每个样品单拷贝)的方法和系统。此外，本发明的方法和系统提供用于区别/鉴定相关基因组序列的序列特异性检测，并且当正确靶序列存在时提供可检测信号。本发明提供本发明的各种实施方案。
本领域已知的方法可用于定量地测量存在于样品中的核酸的量。所述方法的实例包括定量聚合酶链反应(qPCR)和如上所述的其它NAAT技术。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测特定病毒多核苷酸的方法。所述方法可以包括使用引物、探针、酶以及其它试剂用于制备、检测和定量病毒多核苷酸(例如通过PCR、RNA印迹等)。SEQ ID NO：1-12中列出的引物特别适合用于基于病毒多核苷酸使用RT-PCR进行分型(profiling)。表2中提供其它引物(正义和反义)和探针。本领域技术人员可以在表2中容易地确定用于检测MLV、MLV相关或XMRV病毒序列的引物/探针组合。虽然本发明提供特定的引物和探针，但是本领域技术人员将容易地认识到，基于本发明提供的多核苷酸序列能够产生其它探针和引物(另参见，例如图5)。参照本文例举的引物和探针，设计了一系列引物扩增鼠逆转录病毒(MLV)基因组的部分。相应地设计、选择并测试了SEQ ID NO：1-12中列出的引物/探针组(参见实施例)。尽管设想了许多用于检测扩增子的检测方案，如将在下面更详细地讨论，但是用于检测多核苷酸扩增子的一种方法是荧光光谱，因此期望适合于荧光光谱的标记物用于检测多核苷酸。在相关形式的检测中，没有使用杂交探针而是直接使用结合DNA且在不同于该游离试剂的波长下发荧光的荧光团检测扩增子多核苷酸。该荧光标记物的实例是SYBR Green，不过许多相关的荧光分子是已知的，包括但不限于DAPI、Cy3、Cy3.5、Cy5、CyS.5、Cy7、伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白。
在本发明的一个实施方案中，使用寡核苷酸引物对扩增对应于鼠逆转录病毒的pol基因的多核苷酸。使用包含SEQ ID NO：7和8(分别为正向引物和反向引物)的引物扩增pol基因的区域。然后可使用探针(SEQ ID NO：9)检测扩增的区域，该探针与扩增的多核苷酸特异性地杂交。可用如本文所述的许多可检测标记物标记探针。
前述引物(SEQ ID NO：7、8和10、11)及适当的探针(分别为SEQ ID NO：9和12)可用于检测例如鼠白血病病毒(MLV)和异嗜性鼠逆转录病毒(XMRV)的存在。如本文其它地方所描述的，鉴定MLV和/或XMRV的存在对于确定治疗性基因递送和癌症治疗方案是有用的。
在本发明的另一个实施方案中，使用寡核苷酸引物对扩增对应于XMRV的gag基因的多核苷酸。使用包含SEQ ID NO：1和2(分别为正向引物和反向引物)的引物扩增XMRV的gag基因的区域。然后可使用探针(SEQ ID NO：3)检测扩增的区域，该探针与扩增的多核苷酸特异性地杂交。可用如本文所述的许多可检测标记物标记探针。该引物和探针组合对于特异性鉴定XMRV感染或污染的存在是有用的。
在本发明的另一个实施方案中，使用寡核苷酸引物对扩增对应于MLV载体的LTR的多核苷酸。使用包含SEQ ID NO：16和17(分别为正向引物和反向引物)的引物扩增MLV载体(例如Toca511)的LTR的区域。然后可使用探针(SEQ IDNO：18)检测扩增的区域，该探针与扩增的多核苷酸特异性地杂交。可用如本文所述的许多可检测标记物标记探针。该引物和探针组合对于在基因递送监测期间特异性鉴定逆转录病毒载体的存在是有用的。
在本发明的另一个实施方案中，使用寡核苷酸引物对扩增对应于编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的多核苷酸。使用包含SEQ ID NO：19和20(分别为正向引物和反向引物)的引物扩增使用MLV载体(例如Toca511)递送的胞嘧啶脱氨酶的区域。然后可使用探针(SEQ ID NO：21)检测扩增的区域，该探针与扩增的多核苷酸特异性地杂交。可用如本文所述的许多可检测标记物标记探针。该引物和探针组合对于在基因递送监测期间特异性鉴定逆转录病毒载体的存在是有用的。
可使用引物(SEQ ID NO：1和2)和探针(SEQ ID NO：3)检测XMRV的存在。如本文其它地方描述的，鉴定XMRV的存在对于确定治疗性基因递送、癌症治疗方案和血液供应筛查是有用。
在本发明的另一个实施方案中，使用寡核苷酸引物对扩增对应于XMRV的env基因的多核苷酸。使用包含SEQ ID NO：4和5(分别为正向引物和反向引物)的引物扩增XMRV的env基因的区域。然后可使用探针(SEQ ID NO：6)检测扩增的区域，该探针与扩增的多核苷酸特异性地杂交。可用如本文所述的许多可检测标记物标记探针。该引物和探针组合对于特异性鉴定XMRV感染或污染的存在是有用的。
可使用前述引物(SEQ ID NO：4和5)和探针(SEQ ID NO：6)检测XMRV的存在。如本文其它地方描述的，鉴定XMRV的存在对于确定治疗性基因递送、癌症治疗方案和筛查血液供应是有用。
可以将本发明的寡核苷酸引物和探针中的任何一个固定在固相支持物上。固相支持物是本领域技术人员已知的，包括反应盘的孔壁、试管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝化纤维素条、膜、微粒如胶乳颗粒、玻璃等。固相支持物不是关键的，可由本领域技术人员选择。因此，胶乳颗粒、微粒、磁或非磁珠、膜、塑料管、微量滴定孔壁、玻璃或硅芯片等都是合适的实例。将寡核苷酸固定在固相上的的合适方法包括离子、疏水、共价相互作用等。可根据其吸引和固定捕获试剂的内在能力选择固相支持物。本发明的寡核苷酸探针或引物可以对于单个固相支持物单独地或以本发明约2-10,000个不同寡核苷酸的组附着或固定在固相支持物上。
可使用包含本发明的多个寡核苷酸引物或探针的基片用于检测或扩增靶序列。本发明的寡核苷酸探针和引物可附着在固相支持物上的连续区域中或随机位置上。或者，本发明的寡核苷酸可以以有序阵列附着，其中各寡核苷酸附着到固相支持物的不同区域，其与任何其它寡核苷酸的附着点不重叠。通常，这样的寡核苷酸阵列是“可寻址的”，使得不同的位置被记录，并且可作为测定方法的一部分被读取。在阵列上的寡核苷酸位置的知识使“可寻址”阵列可用于杂交测定。例如，寡核苷酸探针可用于寡核苷酸芯片，例如Affymetrix公司销售以及U.S专利号5,143,854、PCT公开WO90/15070和92/10092中描述的那些，这些公开内容通过引用并入本文。使用机械合成方法或包括光刻方法和固相寡核苷酸合成组合的光引导合成方法可制备这些阵列。
通过常称为“超大规模固定聚合物合成”的技术的开发使得固相支持物上寡核苷酸阵列的固定成为可能，在超大规模固定聚合物合成技术中，探针以高密度阵列固定在芯片的固相表面上(参见例如U.S.专利号5,143,854；和5,412,087和PCT公开WO90/15070、WO92/10092和WO95/11995，这些专利文献的每一篇都通过引用并入本文)，其描述了通过技术如光引导合成技术形成寡核苷酸阵列的方法。
在另一个实施方案中，使用与靶基因(例如酵母胞嘧啶脱氨酶(CD)或优化用于在人细胞中表达的CD版本)序列互补的寡核苷酸的阵列确定靶标身份，测定其量等。
还可使用杂交技术鉴别受试者或样品中病毒多核苷酸，从而确定或预测交叉反应性、重组的机会或使用包含重组MLV载体的基因递送载体的治疗方案。杂交反应可以以固相支持物(例如膜或芯片)形式进行，其中例如探针(例如SEQID NO：3、6和/或9)固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，并探测获得的核酸扩增制备物，所述制备物例如从使用包含本发明的SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13和/或14的引物的PCR获得。可以使用任何已知的杂交形式，包括DNA印迹、狭缝印迹、“反向”斑点印迹、溶液杂交、基于固相支持物的夹心杂交、基于珠的杂交形式、基于硅芯片的杂交形式以及基于微量滴定孔基的杂交形式。
寡核苷酸探针与靶多核苷酸的杂交可以以两实体都在溶液中进行，或者当寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定于固相支持物时可以进行所述杂交。例如，可以通过抗体-抗原相互作用、聚-L-赖氨酸、链霉亲和物素或抗生物素蛋白-生物素、盐桥、疏水相互作用，化学键、UV交联烘烤(cross-linking baking)等介导附着于固相支持物。可以在固相支持物上直接合成寡核苷酸或者在合成之后附着到固相支持物上。可以处理、包埋或衍生化固相支持物以有助于特定寡核苷酸的固定。
基于寡核苷酸阵列的杂交测定依靠于短寡核苷酸与完全匹配和不匹配的靶变体的杂交稳定性的差异。每个DNA芯片可以包含排布成网格状图案的数千至数百万个单个的合成DNA探针并微型化成一角硬币(dime)或更小的尺寸。此类芯片可以包含代表野生型和变体序列两者的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可设计为与多核苷酸的靶区域特异性地杂交。如本文所用，特异性杂交指寡核苷酸在某些杂交条件下与靶区域形成反向平行双链结构，而在相同的杂交条件下当与不同的靶多核苷酸或该多核苷酸中的另一区域或与缺少期望部位的多核苷酸孵育时则不能形成所述结构。通常，寡核苷酸在常规的高严格条件下与靶区域特异性杂交。
如果分子之一的每一个核苷酸与另一个分子的相应位置的核苷酸互补，则说核酸分子如寡核苷酸或多核苷酸是另一个核酸分子的“完美”或“完全”互补。如果在常规的低严谨条件下核酸分子与另一分子杂交，足以稳地定保持双链形式，则该核酸分子与另一分子“实质上互补”。常规的杂交条件例如在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)中和在Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，APractical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)中描述。尽管在大多数测定中使用完美互补寡核苷酸检测靶多核苷酸或多态性，但是与完全互补的偏离被考虑在内，其中该偏离不妨碍分子与靶区域特异性地杂交。例如，寡核苷酸引物可以在其5′或3′末端有非互补片段，该引物的其余部分与靶区域互补。本领域技术人员熟悉影响杂交的参数，如温度、探针或引物的长度和组成、缓冲液组成以及盐浓度，并可以容易地调整这些参数以实现核酸与靶序列的特异杂交。
本发明可使用多种杂交条件，包括高、中和低严谨条件，例如参见Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，1989，以及Short Protocols，Molecular Biology，编辑Ausubel等，这些文献用过引用并入本文。严谨条件是序列依赖性的，在不同的情况下将是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导在Tijssen，Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中找到。一般而言，严谨条件选择为在规定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm是(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶互补的探针的50％与靶序列平衡杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm时50％的探针平衡地被占用)的温度。严谨条件将是其中在pH7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃和对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少约60℃的那些条件。严谨条件还可以通过加入螺旋去稳定剂如甲酰胺来实现。如本领域已知的，当使用非离子型骨架即PNA时，杂交条件还可以改变。此外，靶结合后可以加入交联剂以交联，即共价连接，杂交复合物的两条链。
本发明的方法和组合物分别对于诊断或确定样品或受试者中污染或感染的存在是有用的。这些测试可以使用从血液、细胞、活组织检查、组织刮屑、组织培养或其它细胞材料收集的DNA或RNA样品进行。如本领域技术人员将理解的，靶多核苷酸可以从样品获得，所述样品包括但不限于几乎任何生物体的体液(例如血液、尿、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物，汗液和精液)，对于本发明的方法哺乳动物样品是常见的，而人样品是典型的。所述样品可以包含单个细胞，包括原代细胞(包括细菌)和细胞系，包括但不限于所有类型的肿瘤细胞(尤其是黑色素瘤、骨髓性白血病、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌，前列腺癌、胰腺癌和睾丸癌)；心肌细胞；内皮细胞；上皮细胞；淋巴细胞(T细胞和B细胞)；肥大细胞；嗜酸性粒细胞；血管内膜细胞；肝细胞；包括单核白细胞的白细胞；干细胞，如造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、肺干细胞、肾干细胞、肝干细胞和肌细胞干细胞；破骨细胞；软骨细胞和其它结缔组织细胞；角质细胞；黑色素细胞；肝细胞；肾细胞；以及脂肪细胞。适宜的细胞还包括已知的研究性细胞，包括但不限于Jurkat T细胞、NIH3T3细胞、CHO、Cos、923、HeLa、SiHa、WI-38、Weri-1、MG-63等(参见ATCC细胞系目录，其在此通过引用明确并入本文)。
扩增和鉴别由MLV或XMRV引起的病毒感染或污染的其它方法将在本领域中认识到，并可以与本文确定的引物和探针组合使用。例如，本领域技术人员将认识到支链DNA、杂交捕获测定、PCR(包括RT-PCR、巢式PCR、多重PCR、实时PCR)、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增、链置换扩增、连接酶链反应、裂解酶-侵略者(Cleavase-invader)技术和循环探针技术可以与本发明的寡核苷酸一起使用。
可以使用任何寡核苷酸定向扩增方法，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)(美国专利号4,965,188)、连接酶链反应(LCR)(Barany等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：189-93(1991)；WO90/01069)和寡核苷酸连接测定(OLA)(Landegren等，Science241：1077-80(1988))扩增靶多核苷酸(例如病毒多核苷酸或基因)。可以使用其它已知的核酸扩增程序扩增靶区域，这些扩增程序包括基于转录的扩增系统(美国专利号5,130,238；欧洲专利号EP329,822；美国专利号5,169,766；WO89/06700)和等温方法(Walker等Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392-6(1992))。
可使用连接酶链反应(LCR)技术，其特别可用于检测类似的多核苷酸间的单个或多个(例如1、2、3、4或5)核苷酸差异。仅在寡核苷酸碱基正确配对时才发生LCR。采用耐高温Taq连接酶用于连接扩增的连接酶链反应(LCR)对探查基因的基因座是有用的。LCR不同于PCR，因为其扩增探针分子而不是通过核苷酸的聚合产生扩增子。两个探针用于每一个DNA链，并连接在一起形成单个探针。LCR使用DNA聚合酶和DNA连接酶两者以驱动反应。像PCR一样，LCR需要热循环仪驱动反应且每个循环产生双倍的靶核酸分子。LCR能够比PCR具有更大的特异性。升高的反应温度使连接反应以高严谨性进行。在发生错配的情况下，则不能完成连接。例如，基于靶多核苷酸的探针以两段合成，并与模板退火，在两个引物片段的边界处可能有差异。如果该两个引物与模板序列准确配对，则连接酶连接它们。
在一个实施方案中，两个杂交探针各以靶特定部分设计。第一杂交探针设计为与靶多核苷酸(例如多聚核苷酸片段)的第一靶域基本上互补，而第二杂交探针与靶多核苷酸(例如多核苷酸片段)的第二靶域基本上互补。一般而言，杂交探针的各靶特异性序列至少约5个核苷酸长，典型的为约15至30个的序列，特别常见的为20个的序列。在一个实施方案中，所述第一和第二靶域直接相邻，例如它们没有插入性核苷酸。在该实施方案中，至少第一杂交探针与第一靶域杂交并且第二杂交探针与第二靶域杂交。如果在该结合处存在完美互补，则形成连接结构，使得两个探针可以连接在一起形成连接的探针。如果(由于错配)不存在该互补，则没有连接结构形成，探针没有连接在一起至可感知的程度。这可以使用热循环完成，以使得连接的探针变性离开靶多核苷酸，从而使得其可以作为进一步反应的模板。如果加入dNTPs和聚合酶，该方法还可以使用三个杂交探针或由一个或多个核苷酸分开的杂交探针完成(这有时称为“遗传位点”分析)。
可使用定量PCR和数字PCR测量样品中多核苷酸的水平。可使用数字聚合酶链反应(数字PCR、dPCR或dePCR)直接定量和克隆扩增核酸包括DNA、cDNA或RNA。数字PCR通过核酸分子和DNA聚合酶的温度循环扩增核酸。该反应通常在乳液的分散相中进行，在PCR扩增前，在许多单独的室或区域内捕获存在于样品中的各单个核酸分子。含有可检测水平的PCR终产物的室的计数是绝对核酸量的直接测量。
定量聚合酶链反应(qPCR)是聚合酶链反应的修改，实时定量PCR通过使用荧光标记物或其它可检测的标记物可用于测量每个PCR循环后的DNA的量。定量PCR方法利用加入系列稀释的竞争者RNA(用于反转录PCR)或DNA或共扩增内标参照来确保扩增在指数生长期停止。
PCR的修改和PCR技术在本领域中是常规的，并有可用于PCR扩增的可商业获得的试剂盒。
本发明的探针或引物可以与可检测的标记物联合。信号组分可以包括可被光学、电子、放射性等检测的任何标记物。核酸类似物可作为信号组分。“标记物”或“可检测的标记物”是指允许检测的部分(moiety)。在一个实施方案中，检测标记物是主要标记物。主要标记物是可以直接检测到的标记物，例如荧光团。一般地，标记物分为三类：a)同位素标记物，其可以是放射性的或重同位素；b)磁、电、热学标记物；和c)有色或发光染料。常见的标记物包括发色团或荧光体，但通常是荧光染料。用于本发明的合适染料包括但并不限于荧光镧系元素(lanthamide)配合物，包括铕和铽的那些、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、量子点(又称为“纳米晶体“)、芘、孔雀石绿(Malacite green)、茋、荧光黄、瀑布蓝TM(Cascade BlueTM)、德克萨斯红、菁染料(Cy3、Cy5等)、Alexa染料、藻红蛋白(phycoerythin)、氟硼荧(bodipy)以及在Richard P.Haugland的第6版Molecular Probes Handbook中描述的其它染料，该手册通过引用明确地并入本文。
此类可检测标记物可以是放射性标记物或可以是发光、荧光的酶标记物。间接检测方法通常包含半抗原或配体例如地高辛(DIG)或生物素共价标记的探针。在一个实施方案中，在杂交步骤之后，通过抗体-酶复合物或链霉亲和素-酶复合物检测靶-探针双螺旋。通常用于DNA诊断的酶是辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。直接检测方法包括荧光体标记的寡核苷酸、镧系元素螯合物标记的寡核苷酸或寡核苷酸-酶缀合物的使用。荧光团标记物的实例是荧光素、罗丹明和酞菁染料。
应理解本发明的实施方案包括具有荧光染料分子、荧光化合物或其它荧光部分的探针。染料分子可发荧光，或者当通过施用合适的激发能量(例如合适波长的电磁能量)激发时被诱导发荧光，并且还可以吸收另一个染料分子或荧光部分所发出的电磁能量(“淬灭”)。在本发明的实践中可以使用任何合适的荧光染料分子、化合物或部分。例如，合适的荧光染料、化合物以及其它荧光部分包括荧光素、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，4′，1，4，-四氯荧光素(TET)、2′，4′，5′，7′，1，4-六氯荧光素(HEX)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2′-氯-5′-氟-7′，8′-稠合苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(NED)和2′-氯-7′-苯基-1，4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)、花菁染料(例如Cy3、Cy5、Cy9、硝基噻唑蓝(NTB))、Cys3、FAM.TM.、四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四丙醇-6-羧基罗丹明(tetrapropano-6-carboxyrhodamine，ROX)、二吡咯亚甲基氟化硼(氟硼荧)、二氯荧光素、二氯罗丹明、荧光素氨基硫脲(FTC)、磺基罗丹明101酸氯(得克萨斯红)、藻红蛋白、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、indopyras染料、芘氧基三磺酸(瀑布蓝)、514羧酸(俄勒冈绿)、曙红、赤藓红、吡啶基
Figure BDA00002925186900371
唑、苯并
Figure BDA00002925186900372
二唑、氨基萘(aminonapthalene)、芘、马来酰亚胺、香豆素、4-氟-7-硝基苯并呋咱(NBD)、4-氨基-N-[3-(乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺基-3，6-二磺酸盐)(荧光黄)、DABCYL、DABSYL、蒽醌、孔雀石绿、硝基噻唑和硝基咪唑化合物、碘化丙啶、卟啉、镧系元素穴状化合物、镧系元素螯合物、它们的衍生物和类似物(例如荧光素染料的5-羧基异构体)以及其它荧光染料和荧光分子和化合物。
根据本发明的方法的寡核苷酸可以标记在探针的至少一个亚基的5′末端或3′末端。在实施方案中，寡核苷酸可以标记在5′末端和3′末端两者。或者，探针的至少一个亚基可以被内部标记，具有至少一个内部标记物，并且在实施方案中，具有多于一个的内部标记物。在实施方案中，寡核苷酸可以在末端标记并且可以内部标记。使用本领域中也是众所周知的技术合成寡核苷酸本身。用于制备特定序列的寡核苷酸的方法是本领域中已知的，包括例如合适序列的克隆和限制性消化分析以及直接化学合成，包括例如Narang等，1979，Methods inEnzymology，68：190描述的磷酸三酯法，Brown等，1979，Methods in Enzymology，68：109公开的磷酸二酯法，Beaucage等，1981，Tetrahedron Letters，22：1859中公开的二乙基氨基磷酸酯法，以及美国专利号4,458,066公开的固相支持物方法，或者通过使用商业的自动寡核苷酸合成仪的其它化学方法。还可以包括改性连接(linkage)例如硫代磷酸酯。
本发明方法考虑的检测模式的实例包括但不限于光谱技术如荧光和UV-Vis光谱、闪烁计数和质谱。与这些检测模式互补的，在这些方法中使用的用于检测和定量目的的标记物的实例包括但不限于发色团标记物、闪烁标记物和质量标记物。使用这些方法测量的多核苷酸和多肽的表达水平可针对用于靶确定目的而建立的对照进行归一化。
标记物检测将基于在特定测定中使用的标记物类型。这些检测方法在本领域中是已知的。例如，放射性同位素检测可以通过放射自显影、闪烁计数或荧光成像来进行。对于半抗原或生物素标记物，检测使用与报告酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶结合的抗体或链霉亲和素进行，然后通过酶促方法来检测该报告酶。对于荧光团或镧系元素螯合物的标记物，可用具有或不具有时间分辨模式的分光荧光计或使用自动酶标仪(microtitre plate reader)来测量荧光信号。使用酶标记物时，通过颜色或染料沉积(对硝基苯磷酸盐或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/氮蓝四唑用于碱性磷酸酶以及3，3′-二氨基联苯胺-NiCl2用于辣根过氧化物酶)、荧光(例如4-甲基伞形酮磷酸盐用于碱性磷酸酶)或化学发光(碱性磷酸酶二氧杂环丁烷底物，来自Lumigen Inc.，Detroit Mich的LumiPhos530或来自Tropix，Inc的AMPPD和CSPD)来检测。可以使用X射线或偏振光胶片(polaroid film)或通过使用单光子计数发光计进行化学发光检测。
本文公开的方法、组合物、系统和装置用于鉴定和定量样品中，例如包含可以是无关多核苷酸的一个或多个靶序列的序列池中，靶DNA或RNA多核苷酸。可通过将所述测定中获得的总信号(荧光或其他)与已知多核苷酸靶浓度的标准曲线比较来实现特定核酸样品的定量。应用的特定实例包括病原性病毒的检测，其通过检测指示所述目标存在的它们的生物分子如DNA或RNA来进行。具有本发明的特征的测定可用于检测和鉴定特定DNA序列的存在，并且可用于诊断许多类型的感染和疾病的测定中。
这些测定适合用于细胞裂解物以及污染的样品。由于许多临床样品富含污染物，因此本文所描述的测定在这些条件下工作是有利的。虽然目前可获得许多方法用于组织中DNA的提取和纯化，但是精于污染样品分析和操作的例如本文公开的那些(QIAGEN试剂盒等)是非常有价值的并且提高了所述测定的耐用性(robustness)。对于使用本发明测定的临床样品，可以使用样品制备试剂盒。例如，可以使用怀疑含有致病性DNA的样品。可使用的示例性试剂盒和方案包括Qiagen提供的QIAamp MinElute Virus Spin试剂盒。该试剂盒使得可以在约1小时内从临床样品提取DNA。样品制备的其它方法可从供应商如Promega公司获得。
可以使用已知的技术从样品制备多核苷酸。例如，可以使用已知的裂解缓冲液、超声技术、电穿孔等处理样品以裂解含有靶多核苷酸的细胞。许多细胞裂解方法对于本领域技术人员是公知常识。
提供下面的实施例来阐释本发明但不限制本发明。
实施例
以下缩写和定义将有助于理解所公开的内容和进行的测定。
Ct(循环阈值)：反应孔中产生的荧光超过定义的阈值的循环数(qPCR)。该阈值由qPCR仪器制造商强制定义以反映在反应过程中已积累足够数量的扩增子的点。
gDNA(基因组DNA)：已从组织和/或培养的细胞纯化的脱氧核糖核酸。
变异百分比系数(％CV)：变异系数(CV)是概率分布分散度的归一化量度。它定义为标准差σ与平均值μ的比率：
c υ = σ μ
斜率：线的斜率或梯度描述其陡度、倾斜或等级。qPCR的线性回归方程的可接受斜率应该在-3.00至-3.7范围内。
R-平方(R2)值(也称为Pearson相关系数)：线相关性R2是数据拟合模型程度和数据在直线上拟合程度的量度。其受移液精度和检测范围的影响。R2≥0.94是可接受的。
qPCR百分比效率(％效率)：扩增效率E是不同模板浓度下的扩增效率，并使用以下公式从标准曲线的斜率计算：
E＝10^(-1/斜率)
％效率是在每个循环中扩增的模板百分比，使用以下公式计算：
％效率＝(E-1)×100％
％效率应该在85％和115％之间。
LOD：检测限。
LLOQ：定量的下限。
ND：未检出。
NA：不适用。
NTC(无模板对照)：qPCR实验中包含用于扩增的所有必需试剂并用洗脱缓冲液或水代替样品DNA的一系列反应孔。
qPCR：实时定量聚合酶链反应。
实施例1：引物/探针组的设计
设计两个引物/探针组用于XMRV特异性qPCR：
1.XMRV gag
XMRV628F(5′-ACTACCCCTCTGAGTCTAACC-3′)(SEQ ID NO：1)
XMRV764R(5′-GGCCATCCTACATTGAAAGTTG-3′)(SEQ ID NO：2)
XMRV gag探针(5′-FAM-CGCATTGCATCCAACCAGTC TGTG-3′-BHQ)(SEQ ID NO：3)
扩增曲线显示在图6中。
2.XMRV env
XMRV6252F(5′-TTTGATTCCTCAGTGGGCTC-3′)(SEQ ID NO：4)
XMRV6391R(5′-CGATACAGTCTTAGTCCCCATG-3′)(SEQ ID NO：5)
XMRV env探针(5′-HEX-CCCTTTTACCCGCGTCAGTGAATTCT-3′-BHQ)(SEQ ID NO：6)
设计两个引物探针组用于检测所有MLV相关逆转录病毒。扩增曲线显示在图7中。
3.MLV Pol 1
pol-F(5′-AACAAGCGGGTGGAAGACATC-3′)(SEQ ID NO：7)
pol-R(5′-CAAAGGCGAAGAGAGGCTGAC-3′)(SEQ ID NO：8)
pol探针(5′-HEX-CCCACCGTGCCCAACCCTTACAACC-3′-TAMRA)(SEQID NO：9)
4.MLV Pol 2
5’Pol2引物：(CAAGGGGCTACTGGAGGAAAG)(SEQ ID NO：10)
3’Pol2引物：(CTTTCCTCCATGTACCAGACTG)(SEQ ID NO：11)
Pol2探针：(5HEX/TATCGCTGGACCACGGATCGCAA/3BHQ_1)(SEQ IDNO：12)
设计两个引物探针组用于检测双嗜性MLV病毒：
5.MLV Env2
5’Env2引物：5’-ACCCTCAACCGCCCCTACAAGT-3’(SEQ ID NO：13)
3’Env2引物：5’-GTTAAGCGCCTGATAGGCTC-3’(SEQ ID NO：14)
Env2探针：5’-/FAM/CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG/BHQ/-3’(SEQ ID NO：15)
6.MLV LTR：
5’引物＝MLV-U3-B：AGC CCA CAA CCC CTC ACT C(SEQ ID NO：16)
3’引物＝3-MLV-Psi：TCT CCC GAT CCC GGA CGA(SEQ ID NO：17)
FAM探针＝MLV-U5-Psi：FAM-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG3BHQ_1(SEQ ID NO：18)
设计一个引物探针组用于检测胞嘧啶脱氨酶(CD)基因。
7.CD：
5’yCD2引物：(ATC ATC ATG TAC GGC ATC CCT AG)(SEQ ID NO：19)
3’yCD2引物：(TGA ACT GCT TCA TCA GCT TCT TAC)(SEQ ID NO：20)
yCD2探针：(5FAM/TCA TCG TCA ACA ACC ACC ACC TCG T/3BHQ_1)(SEQ ID NO：21)
用于引物探针组的寡核苷酸从IDT(Integrated DNA Technologies，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)订购。
实施例2：从包括人和犬的哺乳动物的血液和其它组织制备基因组DNA用于PCR测试。
进行XMRV(异嗜性鼠白血病病毒相关病毒)qPCR测定以定量DNA。通过标准方法如使用可商业可得的试剂盒(QIAGEN DNA血液小提试剂盒、QIAGENDNA组织试剂盒、Promega DNA组织试剂盒、Promega DNA细胞试剂盒)产生标本样品的总DNA提取。用包含系列稀释的确定拷贝数的参比质粒的8个非零样品建立定量曲线以产生Ct值对比拷贝数的相关性。线性回归分析产生用于计算样品中拷贝数的方程。显示用于XMRV gag(图8)、XMRV env(图9、XMRVpol2(图10)的定量曲线产生。
实施例3：从人和狗制备血浆用于RT-PCR测试。
在血液收集管中收集血液，并通过常规方法从全血制备血清或血浆。进行XMRV(异嗜性鼠白血病病毒相关病毒)RT-PCR测定以定量来自生物样品如全血和血浆的RNA，而不需要RNA提取。该测定采用两步扩增方法，起始步骤是由将2μL实验样品直接分配到cDNA反应混合物构成的。反转录(RT)cDNA合成完成后，移去2μL等份试样，转移到qPCR反应混合物中，并进行qPCR方案。用包含系列稀释的确定拷贝数的参比质粒的6个非零样品建立定量曲线以产生Ct值对比拷贝数的相关性。线性回归分析产生用于计算样品中拷贝数的方程。图15中显示定量曲线产生。
实施例4：QPCR DNA测定的标准化和验证。
如下所概述，进行一系列实验：
1)优化用于XMRV检测的定量PCR(qPCR)方案的循环参数，包括引物和探针浓度和退火温度。
2)使用qPCR评价XMRV env、XMRV gag和XMRV pol2引物/探针组靶向的掺入人全血基因组DNA(gDNA)中的检测灵敏度。
3)针对检测灵敏度，评价在qPCR方案中另外一组三个预循环步骤(定义为阶段)的使用。
4)评价独立来源的人全血XMRV检测灵敏度的差异。
5)评价掺入人全血gDNA的22Rv1 XMRV阳性对照的回收。
测定设计
a.qPCR方案循环参数的优化。
以各种浓度组合构成引物和探针矩阵，并用于靶向包含目的基因的适宜XMRV质粒(pUC57 XMRV gag、pET28b XMRV env或pAZ3-emd pol2)。基于Ct值、标准差和相对荧光单位(RFU)的比较，进行最适引物浓度的选择。SYBR绿色(SYBR Green)用于引物浓度优化qPCR测定，而TaqMan用于探针浓度优化测定。通过进行50℃至65℃范围的qPCR退火温度梯度进行退火温度优化。用适宜的XMRV引物组靶向关注基因特异的质粒。
b.使用qPCR在掺入质粒DNA并用XMRV env、XMRV gag或XMRV pol2引物/探针组靶向的人全血gDNA中的检测灵敏度。
将已知拷贝数的含有目的基因的质粒DNA掺入从人全血提取的基因组DNA。制备系列对数稀释的掺入gDNA并进行qPCR。在单个qPCR反应中用XMRV env(图9)、XMRV gag(图8)和XMRV pol2(图10)引物/探针组靶向样品。
c.使用一阶段qPCR方案在掺入质粒DNA并用XMRV env、XMRV gag或XMRV pol2引物/探针组靶向的人全血gDNA中的检测灵敏度。
将已知拷贝数的含有目的基因的质粒DNA掺入人全血gDNA。制备系列对数稀释的掺入gDNA，并通过向当前的qPCR方案中增加一组三个预循环步骤(定义为一阶段qPCR方案)来进行修改版的qPCR方案。在单个qPCR反应中用XMRV env(图9)、XMRV gag(图8)和XMRV pol2(图10)引物/探针组靶向样品。
d.评价来源于健康供体并掺入质粒DNA的人全血的XMRV检测灵敏度。
将已知拷贝数的质粒DNA掺入到来自健康供体全血的基因组DNA。进行gDNA的系列稀释以产生每反应1E3、1E2、1E1和1E0个拷贝数。进行0阶段和1阶段qPCR方案。在单个qPCR反应中用XMRV env(图12)、XMRV gag(图11)或XMRV pol2(图13)引物/探针组靶向样品。
e.掺入人全血gDNA的22Rv1阳性对照的回收评价。
以增加的对数稀释数将22Rv1 gDNA(XMRV阳性，E.C.Knouf等，J.Virol83：78353-7356 2009)掺入纯化的人全血gDNA(gDNA提取前和提取后)(一个人全血样品对照和一个TE样品被提取前掺入500ng的22Rv1 gDNA，获得～2.5ng/μL的终浓度)。用靶向XMRV gag、XMRV env和XMRV pol序列的引物进行0阶段和1阶段qPCR方案。
进行Pol引物组的优化(引物浓度和温度)。
XMRV gag和XMRV env引物组都是XMRV特异性的，而Pol引物组检测MLV和XMRV两者。
用于所有4个引物组的qPCR方案：BioRad Supermix65.prcl
步骤1：95℃ 5分钟
步骤2：95℃ 15秒
步骤3：65℃ 30秒[重复步骤2-344或更多次]
图6和图7显示由以上公开的方法和组合物获得的结果。
Figure BDA00002925186900441
Gold RT-PCR试剂盒和
Figure BDA00002925186900442
PCR通用混合物(universalmaster mix)从PE Biosystems获得。
Figure BDA00002925186900443
小提试剂盒和病毒RNA小提试剂盒从Qiagen公司获得。要测试的各种细胞培养材料和生物样品从厂商或受试者获得。
MLV重组分离物包含国际申请号为PCT/US09/58512且2010年4月1日以公开号WO2010/036986公开的专利申请中所述的序列。
如上所述，设计用于检测XMRV的两个引物/探针组。一个正向引物(FP)、一个反向引物(RP)和一个探针用于XMRV gag和XMRV env的检测。第三组引物/探针使用扩增XMRV和MLV的pol区的上述引物用于XMRV和MLV的检测。
qPCR反应混合物含有900nM引物(正向和反向)和200nM探针。测试的检测有效浓度包括100、200、300、400、500、600、700、800、900nM以及1∶1、1∶2、1∶3、1∶4之间任何比例的引物浓度。Taq聚合酶的活性通过在95℃下5分钟实现，之后是95℃下15秒的变性以及65℃下30秒的退火和延伸的44个循环。
实施例5：福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中MLV的检测。
去除小鼠肿瘤，并分为两等份。将一份肿瘤进行福尔马林固定、石蜡包埋，而将另一份肿瘤在-80℃冷冻。将FFPE小鼠肿瘤组织切成两半，其中一半掺入已知拷贝数量的pAZ3-emd，而另一半不掺入。将已知拷贝数量的pAZ3-emd掺入冷冻的新鲜小鼠组织和预处理孵育缓冲液中。将FFPE和冷冻的新鲜小鼠组织在含有蛋白酶K和二硫苏糖醇(DTT)的预处理孵育缓冲液中在56℃下孵育过夜。次日，将小鼠组织在Maxwell 16仪器上处理以根据标准方法提取gDNA。在NanoDrop 1000上定量提取的gDNA浓度。通过qPCR测试所提取的DNA中MLV和env2序列的存在，结果显示在图14中。
实施例6：XMRV/MLV RT-PCR测定。
进行XMRV(异嗜性鼠白血病病毒相关病毒)RT-PCR测定以定量来自生物样品如全血和血浆的RNA，而不需要RNA提取。该测定采用两步骤扩增方法，起始步骤由将2μL实验样品直接分配入cDNA反应混合物中组成。反转录(RT)cDNA合成完成后，移去2μL等份试样，转移到qPCR反应混合物中，并进行qPCR方案。用包含系列稀释的确定拷贝数的参比质粒的7个非零样品建立定量曲线以产生Ct值对比拷贝数的相关性。线性回归分析产生用于计算样品中拷贝数的方程。(图15)。
四个对照样品和一种试剂对照用于该测定并与所有的测试样品平行运行。该两步骤反应需要用于RT程序和qPCR程序的对照。因此，包括用于cDNA合成步骤的阳性、阴性和无模板对照，包括用于该方法的qPCR部分的阳性、阴性和无模板对照。
用确定量的22Rv1病毒载体掺入阴性基质样品(即全血)中(参见“参考标准”下的描述)。每次运行现制备该对照以确定RT步骤中cDNA产生的效率。
含有XMRV的整合的逆转录病毒载体序列的22Rv1基因组DNA提供要在患者组织中筛选的实际扩增目标的最好的生物物理模拟。
使用阴性基质样品(即全血)作为阴性RT对照，因为其不含有任何可检测到的XMRV内源性序列。每次运行现制备该对照以验证在qRT步骤的cDNA合成中没有产生非特异性产物。当qPCR程序完成时得到确认。预期无扩增。
从非感染的U-87细胞分离的DNA用作阴性对照使，因为其不包含任何由XMRV引物组可检测到的内源性序列。
已证明22Rv1人前列腺癌上皮细胞系产生高滴度的人逆转录病毒XMRV。该细胞系购自ATCC，在含有10％FBS、丙酮酸钠和Glutamax的RPMI-1640培养基中增殖。将该细胞系传代四次，然后获得含有病毒载体的上清液。将上清液通过0.45μm滤膜过滤，并在-80℃下贮存。
使用参比载体22Rv1掺入PBS中用于产生定量曲线。系列稀释已知拷贝数的载体以产生Ct值对比拷贝数的相关性。线性回归分析产生用于计算样品中拷贝数的方程。通过测量整合入靶细胞基因组中的病毒基因组的拷贝数(转导单位，TU)的滴度分析来确定拷贝数。以TU等价物测量拷贝数。
进行几个研究以确定适当的引物组、反应的最适浓度以及循环参数的最适温度。设计特异性引物组并针对人源材料进行测试。这些实验的目的是确定XMRV特异性的且在测试样品中不存在背景的引物组。
确定以下引物组用于靶向XMRV特异性基因：
1.XMRV gag
XMRV628F(5′-ACTACCCCTCTGAGTCTAACC-3′)(SEQ ID NO：1)
XMRV764R(5′-GGCCATCCTACATTGAAAGTTG-3′)(SEQ ID NO：2)
XMRV gag探针(5′-FAM-CGCATTGCATCCAACCAGTC TGTG-3′-BHQ)(SEQ ID NO：3)
2.XMRV env
XMRV6252F(5′-TTTGATTCCTCAGTGGGCTC-3′)(SEQ ID NO：4)
XMRV6391R(5′-CGATACAGTCTTAGTCCCCATG-3′)(SEQ ID NO：5)
XMRV env探针(5′-HEX-CCCTTTTACCCGCGTCAGTGAATTCT-3′-BHQ)(SEQ ID NO：6)
设计两个引物探针组用于所有MLV相关逆转录病毒和XMRV的检测。
3.MLV Pol1
pol-F(5′-AACAAGCGGGTGGAAGACATC-3′)(SEQ ID NO：7)
pol-R(5′-CAAAGGCGAAGAGAGGCTGAC-3′)(SEQ ID NO：8)
pol探针(5′-HEX-CCCACCGTGCCCAACCCTTACAACC-3′-TAMRA)(SEQID NO：9)
4.MLV Pol2
5’Pol2引物：(CAAGGGGCTACTGGAGGAAAG)(SEQ ID NO：10)
3’Pol2引物：(CTTTCCTCCATGTACCAGACTG)(SEQ ID NO：11)
Pol2探针：(5HEX/TATCGCTGGACCACGGATCGCAA/3BHQ_1)(SEQ IDNO：12)
设计两个引物探针组用于双嗜性MLV病毒的检测。
5.MLV Env2
5’Env2引物：5’-ACCCTCAACCGCCCCTACAAGT-3’(SEQ ID NO：13)
3’Env2引物：5’-GTTAAGCGCCTGATAGGCTC-3’(SEQ ID NO：14)
Env2探针：5’-/FAM/CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG/BHQ/-3’(SEQ ID NO：15)
6.MLV LTR
设计一个引物探针组用于LTR序列中MLV的检测。
5’MLVLTR引物：AGC CCA CAA CCC CTC ACT C(SEQ ID NO：16)
3’MLVLTR引物：TCT CCC GAT CCC GGA CGA(SEQ ID NO：17)
MLVLTR探针：FAM-CCCCAAATGAAAGACCCCCGCTGACG 3BHQ_1(SEQ ID NO：18)
7.胞嘧啶脱氨酶基因
设计一个引物探针组用于胞嘧啶脱氨酶基因的检测。
5’yCD2引物：(ATC ATC ATG TAC GGC ATC CCT AG)(SEQ ID NO：19)
3’yCD2引物：(TGA ACT GCT TCA TCA GCT TCT TAC)(SEQ ID NO：20)
yCD2探针：(5FAM/TCA TCG TCA ACA ACC ACC ACC TCG T/3BHQ_1)(SEQ ID NO：21)。
实施例7：监测用MLV载体治疗的GBM患者。
对受试者给予增加剂量的Toca511，进行安全性和耐受性的开放性、递增剂量试验，所述受试者患有复发性高分级性神经胶质瘤(包括GBM)，经历手术后辅助放疗和化疗(参见http[:]//clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01156584？term＝tocagen&rank＝1)。制备适用于临床应用(WO2010148203)的递增剂量的Toca511(又名T5.0002)，并通过立体定向经颅注射入肿瘤来递送。起始剂量为2.6×103TU/g。符合所有纳入标准且不属于排除标准的受试者通过立体定向经颅注射入其肿瘤来接受Toca511。约3周(±1周)后受试者进行基线钆增强MRI(Gd-MRI)扫描，然后以约130mg/kg/日共6日口服5-FC开始治疗。在给药第4、第5或第6日，测定5-FC血清谷浓度，并在随后的周期中调整5-FC剂量以维持谷浓度在治疗范围内。如果耐受，约每4周(±1周)重复这些6日疗程的5-FC，直到用于肿瘤进展的新的抗肿瘤治疗的建立。受试者大约每8周进行一次Gd-MRI扫描。用Macdonald标准评估肿瘤反应。遵循标准剂量递增算法。以直至4个Toca 511剂量水平的每个剂量水平下(2.6×103、9.5×103、2.5×104，以及最大可行性剂量[MFD]，不超过1×105TU/g)评估三个受试者。目前，最低剂量水平的三个患者已被治愈。两个患者101和102使用检测全血DNA的qPCR(MLVLTR引物探针组)和使用MLV env2引物-探针组的RT-qPCR进行监测。此外，通过DNA qPCR监测唾液和尿，并测量载体的抗体(参考MLV ELISA应用)。这些数据显示在图16中。
可用于本发明的方法和组合物中用于检测XMRV和MLV相关病毒的其它引物包括表1中的那些。
表2提供可用于本发明的方法和组合物中例如用于定量PCR和定量RT-PCR以及可用于XMRV或XMRV和MLV相关病毒检测的另外的引物对和探针：
Figure BDA00002925186900511
Figure BDA00002925186900521
Figure BDA00002925186900541
Figure BDA00002925186900551
Figure BDA00002925186900571
Figure BDA00002925186900581
Figure BDA00002925186900591
Figure BDA00002925186900611
Figure BDA00002925186900621
Figure BDA00002925186900641
Figure BDA00002925186900651
Figure BDA00002925186900661
Figure BDA00002925186900671
Figure BDA00002925186900681
Figure BDA00002925186900721
Figure BDA00002925186900731
Figure BDA00002925186900741
Figure BDA00002925186900751
Figure BDA00002925186900771
Figure BDA00002925186900781
Figure BDA00002925186900791
Figure BDA00002925186900801
Figure BDA00002925186900811
Figure BDA00002925186900821
Figure BDA00002925186900831
Figure BDA00002925186900841
Figure BDA00002925186900851
Figure BDA00002925186900861
Figure BDA00002925186900871
Figure BDA00002925186900881
Figure BDA00002925186900891
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Figure BDA00002925186900931
Figure BDA00002925186900941
Figure BDA00002925186900951
Figure BDA00002925186900971
Figure BDA00002925186900981
Figure BDA00002925186900991
Figure BDA00002925186901011
Figure BDA00002925186901021
进行RT-PCR测定以定量来自生物样品如全血和血浆的RNA，而不需要RNA提取。该测定采用两步骤扩增方法，起始步骤由将2μL实验样品直接分配入cDNA反应混合物组成。反转录(RT)cDNA合成完成后，移去2μL等份试样，转移到qPCR反应混合物中，并进行qPCR方案。
在一个单独的实施方案中，使用
Figure BDA00002925186901031
病毒RNA小提试剂盒从细胞培养上清液、全血或血浆分离RNA。然后使用RNA进行反转录。反转录之后，使用cDNA进行qPCR测定。
已经描述本发明的一些实施方案。然而，应理解在不偏离本发明精神和范围的前提下可以进行各种修改。因此，其它的实施方案在权利要求的范围内。
Figure IDA00002925187600011
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Claims (50)

1.分离的寡核苷酸，其由选自以下组成的组的序列组成：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或表1或2中所列的任何序列以及与前述任何序列至少95％相同且能与MLV相关的多核苷酸杂交的寡核苷酸。
2.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：1和2以及与SEQ ID NO：1和2至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
3.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：4和5以及与SEQ ID NO：4和5至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
4.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：7和8以及与SEQ ID NO：7和8至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
5.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：10和11以及与SEQ ID NO：10和11至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
6.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：13和14以及与SEQ ID NO：13和14至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
7.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：16和17以及与SEQ ID NO：16和17至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
8.权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其包含由SEQ ID NO：19和20以及与SEQ ID NO：19和20至少95％相同且与MLV相关的多核苷酸杂交的序列组成的引物对。
9.权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自XMRV和MLV之间同源区域的引物。
10.确定将要经历或正在经历使用MLV相关病毒的逆转录病毒基因递送治疗的受试者中病毒含量的方法，该方法包括：
从所述受试者获得样品；
在适合核酸扩增的条件下使所述样品与权利要求1-9中任一项所描述的一个或多个引物对接触，以获得扩增产物；
使所述样品与一个或多个与所述扩增产物杂交的探针接触；
检测杂交产物；
指示受试者具有包含MLV相关病毒的病毒含量。
11.权利要求10所述的方法，其中所述MLV相关病毒是用于基因递送的重组逆转录病毒载体。
12.权利要求10所述的方法，其中所述MLV相关病毒是XMRV病毒。
13.权利要求10所述的方法，其中在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之前进行所述方法。
14.权利要求10所述的方法，其中在递送MLV相关逆转录病毒载体用于基因递送之后进行所述方法。
15.权利要求10所述的方法，其中所述MLV相关病毒包含5’LTR、gag基因、pol基因、env基因、与将被递送的异源多核苷酸连接的env基因的调节域3′、以及3’LTR和在5’LTR中用于在哺乳动物细胞中表达的启动子。
16.权利要求15所述的方法，其中所述调节域是内部核糖体进入位点(IRES)。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。
18.权利要求14-17任一项所述的方法，其中所述方法监测MLV相关逆转录病毒载体的传播。
19.权利要求18所述的方法，其中所述方法在病程年期间定期进行。
20.一种用于检测样品中病毒剂存在的方法，该方法包括：
使用定量聚合酶链反应或其它扩增方法测量样品中多核苷酸的量，所述定量聚合酶链反应或其它扩增方法包括使用选自以下组成的组的寡核苷酸引物/探针组合：
(i)SEQ ID NO：1、2和3；
(ii)SEQ ID NO：4、5和6；
(iii)SEQ ID NO：7、8和9；
(iv)SEQ ID NO：10、11和12；和
(v)根据权利要求9的引物对以及与XMRV和MLV两者具有至少95％同一性的相应探针。
21.权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA。
22.权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA。
23.权利要求20所述的方法，其中所述定量聚合酶链反应是RT-qPCR。
24.权利要求20所述的方法，所述测量检测病毒剂相关的核酸的单拷贝。
25.权利要求20所述的方法，其中所述病毒剂包含MLV相关病毒和/或XMRV。
26.权利要求20所述的方法，其中所述样品是哺乳动物组织。
27.权利要求20所述的方法，其中所述样品是哺乳动物血液。
28.权利要求25所述的方法，其中所述病毒剂是基因治疗载体。
29.权利要求28所述的方法，其中所述基因治疗载体是复制型载体。
30.权利要求20所述的方法，其中在包括基因治疗载体治疗的治疗方案之前进行所述方法。
31.权利要求20所述的方法，其中在包括基因治疗载体的治疗方案之后对受试者进行所述方法。
32.权利要求20所述的方法，其中进行所述方法以监测受试者中包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。
33.权利要求28至32任一项所述的方法，其中所述基因治疗载体包括复制型MLV载体。
34.权利要求12所述的方法，其中在包括基因治疗载体的治疗方案之前进行所述方法。
35.权利要求20所述的方法，其中在包括基因治疗载体的治疗方案之后进行所述方法。
36.权利要求20所述的方法，其中进行所述方法以监测包括基因治疗载体的治疗方案的剂量。
37.权利要求20所述的方法，其中所述样品来自受试者。
38.一种试剂盒，其用于进行权利要求10-19任一项所述的方法。
39.一种试剂盒，其用于进行权利要求20所述的方法。
40.权利要求10-36任一项所述的方法，用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的＜100拷贝的MLV相关DNA。
41.权利要求10-36任一项所述的方法，用于检测从固定的组织病理学切片提取的样品中的＜100拷贝的MLV相关RNA。
42.权利要求10或20所述的方法，其中所述方法检测MLV相关病毒和XMRV两者。
43.权利要求10或20所述的方法，其中所述方法仅检测MLV相关病毒，而不检测XMRV。
44.权利要求10或20所述的方法，所述方法检测XMRV gag和MLV gag。
45.权利要求10或20所述的方法，其中所述方法检测XMRV pol和MLVpol。
46.权利要求10或20所述的方法，其中所述方法检测XMRV Env和MLVEnv。
47.权利要求10或20所述的方法，用于检测来自哺乳动物宿主的血浆或血清中的XMRV或MLV相关病毒。
48.一种使用权利要求10所述的方法选择性检测人中MLV相关病毒而不检测XMRV的方法，该方法包括使用选自由以下序列组成的组的引物：
SEQ ID NO：10和11；
SEQ ID NO：13和14；
SEQ ID NO：16和17；
SEQ ID NO：19和20；
与前述序列至少95％相同的序列；
及它们的组合。
49.一种确定人受试者是否具有患前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险的方法，该方法包括使用SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所述的引物对和探针或表1或2所述的引物/探针，扩增来自受试者的样品中的多核苷酸，其中扩增产物的存在指示前列腺癌或慢性疲劳综合征的风险。
50.一种针对MLV、MLV变体或XMRV感染筛选血液供给或组织库的方法，包括利用SEQ ID NO：4、5、7、8、10、11、13、14所述的引物或表1或2中的任何引物针对血液供给和组织库进行扩增反应，和检测扩增产物。
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