CN110656088A - 一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种稳定表达人源CaSR(钙敏感受体)基因的细胞模型，保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑CaSR，保藏编号为CCTCC NO:C201893，其构建方法是，将SNAP标签与CaSR基因通过连接序列cacgcgt相连，得到融合有SNAP标签的CaSR基因，将其与表达载体连接构建含有CaSR基因的重组质粒，将重组质粒转染哺乳动物细胞，经药物筛选培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株。该细胞模型既可用于筛选以CaSR为靶点的活性物质，又可通过SNAP‑tag与均相时间分辨荧光技术(HTRF)联合应用，准确快速研究CaSR与其它蛋白的相互作用及其寡聚化。该细胞模型能够高通量、低成本的筛选以CaSR为靶点的活性物质，筛选方法步骤简单可控，成本低，通量高，具有很好的稳定性和可靠性。

Description

一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及细胞模型的构建方法，具体涉及一种稳定表达人源CaSR(钙敏感受体)基因的细胞模型和其构建方法。
背景技术
钙敏感受体(CaSR)，作为C族G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族的一员，自1993年首次发现以来，已经在很多组织器官中进行了研究，发现其功能的改变与某些疾病的发生发展相关联。
人类的CaSR基因位于3号染色体的长臂上(3q13.3-21)，主要由1078个氨基酸残基的多肽链组成，包括3个结构域：①由612个氨基酸组成的氨基胞外区(NH2-terminalextracellular domain，ECD)，形成二聚体与Ca2+、Gd3+、Mg2+、精胺、庆大霉素等多种配体结合，大多数受体的激活和失活突变都发生在此区域；②由250个氨基酸组成的7次跨膜区(trans-menmbrane domains，TMD)；③由217个氨基酸组成的胞内羧基端尾部(COOH)，此处与G蛋白偶联，通过一系列信号转导通路，影响细胞的病理生理功能。Ca2+是CaSR的主要激动剂,许多多价阳离子(如Gd3+、Mg2+)、精胺、抗生素(新霉素)、L-氨基酸特别是芳香族氨基酸也是其激动剂。据报道，CaSR在不同的组织器官中，可能与不同的G蛋白偶联，Gq/11、Gi/o、Gs、G12/13等都有相关报道，被激活的CaSR主要与Gq相偶联，激活磷脂酶C(PLC)，进而影响其下游各种生理功能。
CaSR在体内广泛分布，如甲状腺、甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨组织、皮肤等。CaSR主要在甲状旁腺和甲状腺中表达，分别调节甲状旁腺激素(PTH)及降钙素的合成与分泌来维持细胞外液中的Ca2+浓度。CaSR的突变引起的受体失活或者过度活化可引起相关疾病，如与受体失活相关的疾病包括家族性低尿钙性高钙血症，与CaSR活化突变相关的疾病包括常染色体显性低钙血症。
CaSR也存在于包括食道、胃、小肠和结肠在内的胃肠道中，不仅可以促进食物消化、促进营养吸收、调节能量代谢，还有控制炎性反应，调节肠液平衡和免疫平衡的新兴作用。并且CaSR在结肠中具有肿瘤抑制作用，CaSR正变构调节剂可以增强其抑制肿瘤的效应，而负变构调节剂则抑制该效应。
除此之外，CaSR在血管、平滑肌、内皮细胞、中枢神经系统、胰腺、骨髓及乳腺等中也有表达。CaSR具有维持和调节细胞内Ca2+和其他矿物离子体内平衡的作用，同时也参与细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程的调控。目前针对CaSR的相关试剂已在一些疾病中进行了初步尝试，如CaSR激动剂盐酸西那卡塞(Cinacalcet)以别构调节的方式刺激CaSR的表达，现在已经应用于临床原发性甲状旁腺功能亢进(PHPT)的治疗。功能上的重要性将使得该受体成为重要的药物作用靶点，有着极高的潜在科研和市场价值。
大量的动物实验及临床前研究表明CaSR在生理及病理过程中发挥重要作用。所以建立这样一种药物筛选模型，提供了一种更为高效、便捷的药物筛选方式，能快速的找到以CaSR为靶点的药物。
基于细胞信号通路的高通量药物筛选(high throughput screening,HTS)是以细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(FONNUMF.A rapid radio chemical method for the determination of cholineacetyltransferase[J].J Neurochem,1975,24(2):407-409.)。将药物靶点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。
目前，基于GPCR下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选以CaSR为靶点活性物质的细胞模型。
O6-鸟嘌呤烷基-DNA烷基转移酶(O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase,AGT)是一种核蛋白，它通过把烷基化DNA链上鸟嘌呤O6-位的烷基转移至自身活性中心的半胱氨酸上，来行使DNA修复功能。2003年，Johnsson等利用AGT的这一性质开发了一种新型的蛋白标记技术——SNAP-tag。通过对AGT进行改造得到一种与苯甲基鸟嘌呤(benzylguanine，BG)衍生物高特异性共价结合的蛋白，分子量为22KDa，后命名为SNAP-tag蛋白。由于BG可带各种不同的其它化学基团，如生物素、荧光素(fluorescein)、罗丹明(rhodamine)等，从而实现一种标签蛋白可以被多种配体标记，是一种具有革命性意义的自我标记蛋白标签。
与其它蛋白靶向标记方法相比，SNAP-tag有其独特的优点：1)与特定底物的反应速度快，且特异性高、稳定性好；2)用于标记的荧光染料多样化，通过调控染料性能，可满足各种荧光成像研究的需求，灵活性更高；3)可开发多种功能性配体。
在过去的十几年中，SNAP-tag特异性蛋白标记技术已成为一种用于与蛋白质相关的生物医学和生物工程研究的多功能检测标记工具。通过SNAP-tag对蛋白质的特异性标记，对于在体外、细胞内及活体水平研究蛋白质的结构、性质及功能具有较好的适用性。例如，在活体水平和细胞水平融合蛋白成像中的应用；在细胞内进行蛋白质与蛋白质相互作用研究；在蛋白质固定化中的应用；在疾病诊断与微生物致病机理研究中的应用。
构建SNAP-tag与CaSR的融合蛋白，为进一步地对CaSR靶蛋白结构动态变化、发生运输的实时动态过程跟踪检测，便于研究CaSR参与的多种生理和生化过程，以及CaSR所涉及的疾病诊断治疗、新药开发等，提供更加强有力的技术手段。
发明内容
本发明的任务是建立一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型，以克服上述现有技术中的不足。实现本发明的技术方案是：
本发明提供的这种细胞模型，是携带并能表达CaSR基因的哺乳动物细胞，即该细胞模型是克隆了表达编码人源CaSR基因序列的体外培养的哺乳动物细胞。
本发明提供的这种表达人源CaSR基因的细胞模型，它是中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR，已于2018年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201893，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
所述的CaSR基因(Gene ID:846)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述哺乳动物细胞可以为CHO细胞或HEK293细胞。本发明使用的是Invitrogen商品化细胞系CHO细胞。
本发明提供的这种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将SNAP标签与CaSR基因通过SEQ ID NO:4所示的连接序列，即cacgcgt相连，得到融合有SNAP标签的CaSR基因；
(2)将融合有SNAP标签的CaSR基因与表达载体连接，构建含有CaSR基因的重组质粒pcDNA5/FRT Flag-Snap-CaSR(human)；
(3)将重组质粒转染哺乳动物细胞，经过筛选验证，培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株，该细胞株即为所述的CaSR基因的细胞模型。
上述细胞模型的构建方法，优选地，还包括对细胞株进行综合评估的步骤：在细胞株中加入CaSR特异性激动剂或CaSR特异性抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。所述测定下游信号应答反应包括检测CaSR与其配体结合程度、CaSR下游G蛋白与[35S]GTPγS结合程度、三磷酸肌醇积累量和细胞内钙离子流变化量中的一种或几种。其中检测CaSR与其配体结合程度以及G蛋白与[35S]GTPγS结合程度可以采用放射性结合实验。优选地，本发明对细胞株进行综合评估的检测方法为检测细胞内钙离子流变化量和三磷酸肌醇积累量。所述的CaSR特异性激动剂可以是CaCl2、MgCl2、Spermine，所述的CaSR特异性抑制剂NPS 2143hydrochloride。
优选地，步骤(1)所述的表达载体为pcDNA5/FRT。
优选地，步骤(2)使用的细胞为CHO细胞。本发明使用的是Invitrogen商品化细胞系Flp-in-CHO细胞，Flp-InTM细胞系经设计可快速构建稳定表达细胞系，以能够采用Flp-InTM表达载体表达目的蛋白。这些细胞在转录活跃区上含有一个稳定整合的重组酶识别序列(FRT)位点。Flp-InTM表达载体的定点整合可确保高表达量。用Flp-InTM表达载体和Flp重组酶载体pOG44共转染Flp-InTM细胞系，使得表达载体被定点整合在每个细胞的相同染色体位点上。
上述细胞模型的构建方法，更优选地：步骤(1)还包括对构建的重组质粒进行测序鉴定；步骤(2)所述的重组质粒转染哺乳动物细胞是将重组质粒与表达重组酶的质粒pOG44共导入哺乳动物细胞中，再利用潮霉素(Hygromycin B)进行筛选，获得带有潮霉素抗性的单克隆细胞，继续培养后利用ELISA、测细胞中的Ca2+流等方法检测能够表达CaSR的阳性克隆，培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株。
优选地，所述筛选药物为CaSR激动剂、CaSR抑制剂。
本发明提供的这种细胞模型在筛选以CaSR为靶点的活性物质中的应用。
本发明提供的这种以CaSR为靶点活性物质的筛选模型，具有以下有益效果：本发明的细胞模型一方面通过检测细胞信号分子所产生的应答信号直接监测CaSR的活性，能够高通量、低成本、准确地筛选以CaSR为靶点的活性物质。本发明细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉；本发明以CaSR为靶点的活性物质的筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性，为CaSR靶点活性物质的筛选提供了新的思路，具有很好的市场前景。另一方面，通过SNAP-tag对CaSR进行特定标记，能进一步地对CaSR靶蛋白结构动态变化、发生运输的实时动态过程跟踪检测，便于研究CaSR参与的多种生理和生化过程，具有很好的科学研究价值。
附图说明
图1为本发明细胞模型的工作原理图。
图2为对阳性克隆的ELISA和细胞内钙流变化检测的鉴定结果图，其中，CHO表示CHO空细胞，CHO-CaSR-A1、C2、D1、E1、E4分别表示不同编号的CHO-CaSR细胞克隆。A：不同CHO-CaSR细胞克隆通过ELISA检测细胞膜上和细胞内CaSR的表达量，CaSR基因构建在载体pcDNA5/FRT上，并携带有Flag标签，所以检测时用Flag-HRP抗体作为一抗孵育，加入发光底物后用FlexStation 3进行检测；B：不同CHO-CaSR细胞克隆在不加入或加入2mMCaCl2刺激时胞内钙流变化。
图3为CaCl2诱导CHO-CaSR细胞内IP one积累和钙流变化的实验结果。A为不同浓度CaCl2对细胞内IP one的影响，纵坐标为细胞内IP one的积累量；B为不同浓度CaCl2对细胞内Ca2+的影响，纵坐标为细胞内Ca2+释放量，两者横坐标均为CaCl2的浓度。
图4为MgCl2与Spermine诱导CHO-CaSR细胞内钙流变化的实验结果。A为不同浓度MgCl2对细胞内Ca2+的影响，纵坐标为细胞内Ca2+释放量，横坐标为MgCl2的浓度；B为不同浓度Spermine对细胞内Ca2+的影响，纵坐标为细胞内Ca2+释放量，横坐标为Spermine的浓度。
图5为NPS 2143hydrochloride抑制CaCl2诱导的CHO-CaSR细胞内钙流变化的实验结果。橫坐标为不同浓度的NPS 2143hydrochloride，纵坐标为细胞内钙释放量。
图6为基于该细胞模型的药物筛选方法的评估结果，纵坐标为细胞内钙释放量，横坐标为样品数。CaCl2+表示加入CaCl2药物处理的实验组，CaCl2-表示未加药物处理的对照组。
图7为利用SNAP-tag对CHO-CaSR细胞的免疫印迹鉴定和FRET信号检测结果。A：CHO表示CHO空细胞，CaSR-CHO表示瞬时表达CaSR质粒的CHO细胞，CHO-CaSR表示CHO-CaSR细胞克隆。活细胞孵育非细胞渗透性SNAP tag荧光标记配体，凝胶电泳检测细胞膜上CaSR的表达量。B：不同浓度的CaCl2对CHO-CaSR细胞FRET信号影响，横坐标为不同浓度的CaCl2，纵坐标为FRET信号。
图8为本发明所用质粒pcDNA5/FRT Flag-Snap-CaSR(human)的构建示意图。将模板质粒pcDNA5/FRT Flag-clip-GB2a(human)和含有目标基因的PRK6-Flag-Snap-CaSR(human)进行Nhe1和Xho1双酶切后含取带有融合蛋白SNAP的目标基因与载体片段连接得到目标质粒。
图9将获得的重组质粒序列经过测序检测，pcDNA5/FRT Flag-Snap-CaSR(human)插入位点正确，目标序列也正确，由此得到预期目的质粒。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中用到的材料和试剂如下：
Flp-in-CHO细胞(一种中国仓鼠卵巢细胞，以下实施例中简称CHO细胞)、表达载体pcDNA5/FRT和转染试剂Lipofectin2000为Invitrogen公司的商业化产品；F12培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；其它试剂均为进口和国产分析纯试剂；CaCl2、MgCl2、Spermine购自Sigma公司；NPS 2143hydrochloride购自Tocris。
实施例1细胞模型的构建
以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为受体细胞，进行细胞模型的建立。将CHO细胞培养在含10％胎牛血清的F12培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(1)重组质粒构建
使用人源CaSR cDNA序列进行扩增，得到目的基因CaSR，将扩增的CaSR基因通过连接序列cacgcgt与SNAP融合后再与pcDNA5/FRT表达载体由连接酶催化连接，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒DNA，抽提测序以鉴定阳性克隆，鉴定正确的阳性克隆即为重组质粒，命名为pcDNA5/FRT Flag-Snap-CaSR(human)。
(2)重组质粒转染CHO细胞
DNA和脂质体(Lipofectamine2000)混合物的配制(10cM培养皿)
A溶液：
Figure BDA0001717605430000071
B溶液混合，室温放置5min；
将A液与B液混合，室温放置20min，然后将混合液加入到CHO细胞中。在37℃的二氧化碳培养箱内培养6h后，换为含血清含抗生素完全培养基。
(3)阳性克隆筛选
转染24h后的CHO细胞按1：10的密度传代再培养24h，以含300μg/mL Hygromycin B(潮霉素)的F12选择性培养基进行选择性筛选培养，每3天用选择性培养基换液一次，持续2周可见阳性克隆出现。采用极端稀释法将阳性克隆挑出，接种至96孔板再用含150μg/mLHygromycin B的F12选择培养液扩增传代，得到稳定转染的阳性克隆细胞模型。
(4)阳性克隆鉴定
步骤(3)获得的细胞模型用ELISA和检测胞内钙流方法进行鉴定，以获得克隆中CaSR的表达和功能情况，CHO空细胞作为对照。利用Flag抗体，我们在约60个克隆中发现挑选的A1、C2、D1、E1、E4号克隆都有较高的CaSR表达并具有功能(CHO-CaSR细胞系的A1、C2、D1、E1、E4)，而空细胞中没有检测到Flag信号，在CaCl2刺激下也不能激活胞内钙流(图2)。因此我们选择A1克隆做后续实验。
A1号克隆命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR(A1)。
实施例2本发明细胞模型用于药物筛选的特异性
CaSR主要与Gq蛋白偶联，CaSR激活后主要通过激活PLCβ信号通路，促发DAG和IP3生成，IP3促进胞内钙离子释放，因而可以通过检测Ca2+释放确定CaSR激活情况；另外产生的IP3在细胞内会被逐渐降解成IP1，在胞内积累，介质中加入的LiCl能使IP1稳定存在，可以通过检测IP1的积累量反映CaSR激活情况。本实施例中为了鉴定细胞系可以稳定表达功能性的CaSR，主要使用第一种方法。
为检测该细胞模型用于药物筛选的特异性，确保应答元件的响应是由CaSR的活性变化所调控。选用CaSR的多种激动剂CaCl2、MgCl2、Spermine，CaSR的特异性抑制剂NPS2143hydrochloride，分别以不同的浓度处理细胞模型并通过检测应答分子的响应确定其诱导激活率。
(1)CaCl2引起细胞内IP1的积累以及胞内Ca2+的释放
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，分别加入0.04、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001、0.0002、0.00002M的CaCl2进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为负对照，依次加入IP1-d2和Ab-Cryp，室温孵育1h后，用PHERAstar测定各组诱导的IP1的积累量。
试验结果参见图3A，CaCl2作为CaSR的特异激动剂，对CaSR的激活效果明显。在本实验中，随着CaCl2浓度增加，CHO空细胞没有被激活，而CHO-CaSR细胞产生IP1的积累量与CaCl2浓度呈剂量依赖关系。
②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM(钙荧光探针)孵育1h。然后分别加入0.025、0.01、0.005、0.003、0.001、0.0005、0.0001、0.00001M的CaCl2进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为负对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。
试验结果参见图3B，CaCl2作为CaSR特异性激动剂，对CaSR的激活效果明显。随着CaCl2浓度增加，CHO空细胞没有被激活，而CHO-CaSR细胞内Ca2+的诱导释放率与CaCl2浓度呈剂量依赖关系。
(2)MgCl2、Spermine引起细胞内Ca2+的释放
①将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM(钙荧光探针)孵育1h。分别加入0.05、0.025、0.01、0.005、0.003、0.001、0.0005、0.00005M的MgCl2进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为负对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。
②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM(钙荧光探针)孵育1h。分别加入0.01、0.003、0.001、0.003、0.00003、0.00001、0.000003M的Spermine进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为负对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的Ca2+释放。
试验结果参见图4，MgCl2、Spermine作为CaSR特异激动剂，对CaSR的激活效果明显。在本实验中，MgCl2、Spermine对细胞内Ca2+的诱导释放率分别与MgCl2、Spermine浓度呈剂量依赖关系，而CHO空细胞没有被激活。
(3)NPS 2143hydrochloride对CaCl2诱导内钙释放的影响
将细胞接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后，换上1μM Fluo-4AM孵育1h。使用10-9，10-8，10-7，3×10-7，10-6，3×10-6，10-5，3×10-5M NPS 2143hydrochloride预孵育30min，加入6mM的CaCl2混合液进行刺激，每组设3个重复，以CHO空细胞作为负对照。用FlexStation 3多功能酶标仪工作站测定诱导的Ca2+释放。
实验结果见图5，NPS 2143hydrochloride作为CaSR特异性抑制剂，能够有效抑制CaCl2对CaSR的激活。在本实验中，3×10-5M NPS 2143hydrochloride对浓度为6mM的CaCl2诱导的细胞系内钙释放均能抑制，使内钙释放程度接近于本底。
实施例3基于细胞模型的药物筛选方法的评估
建立筛选模型的目的是筛选活性物质，反映该物质所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确地反映受试物的生物活性，必须进行客观地评价。评价一个筛选模型的优劣有很多指标，如模型的稳定性、灵敏性、特异性等。除此之外，为了使模型能够达到筛选的要求，还需要对筛选模型进行定量评价，主要分析该模型能否有效地反映样品的活性。评价药物筛选模型的常用定量技术参数，主要如下：
(1)信号本底比(signal to background,S/B)
信号本底比反映的是药物筛选模型获得的数据(M Signal)与本底数据(M Background)之间的距离。一般来讲，这种比值越大，信号与本底的距离越大，在反映样品作用方面有越大的范围，易于反映样品作用。
一般情况下，信号本底比的数值应大于3，当值小于3时，就不能有效地反映样品的生物活性。
信号本底比的计算公式：S/B＝M Signal/M Background
(2)信噪比(signal to noise,S/N)
信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪音通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。通常情况下，信噪比要大于10才能认为是可以应用的方法。信噪比的计算公式：S/N＝(M Signal-M Background)/SD Background
其中SD Background表示本底数据标准差。
(3)Z’因子
Z’因子综合考虑了信号的变化和波动范围，它只与实验的重现性与可靠性有关，而与实验的内容无关，因而在评价高通量药物筛选模型的稳定性和可靠性中得到广泛的应用，Z’因子是没有单位的统计学参数，其值在0～1之间，Z’因子<0.5表示稳定性差，实验的可靠性低，这样的模型不能用于药物筛选，Z’因子在0.5～1时，模型稳定性高，可以充分确保建立的模型用于药物的筛选。Z’因子的计算公式如下：
MSignal表示筛选模型获得的数据、MBackground表示本底数据、SDBackground表示本底数据标准差、SDSignal筛选模型获得的数据标准差。
为了评估本筛选方法是否稳定地适用于高通量筛选，在经优化所得到的筛选条件下随机选取96孔板中的60个孔，30个孔为一组，以浓度为2mM的CaCl2为阳性对照，不加CaCl2的作为阴性对照，根据公式分别计算S/B，S/N和Z’因子，以对方法进行定量评估。
采用的三个评价指标计算结果是S/B＝12.9521，S/N＝125.4041，Z’＝0.727833，说明本方法具有很好的稳定性和可靠性(图6)。本发明的高效表达细胞模型可同时稳定表达CaSR受体，以便于检测CaSR在受到正向刺激引起的信号分子应答反应。
实施例4本发明细胞模型SNAP-tag在CaSR结构与功能研究中的应用
CaSR是一种主要依靠氨基胞外区分子间二硫桥共价键而形成的同源二聚体，在活细胞表面，主要以二聚体的形式存在。当CaSR二聚体被活性物质刺激时，会导致二聚体的两个胞外区距离发生相应的动态变化，相互远离或者靠近，进而引发下游信号的激活或失活。结合相应技术可以捕捉CaSR二聚体两胞外区在刺激时的距离变化，为CaSR进一步的结构功能研究提供便利。
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)技术是检测蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具，该技术适合在活细胞内研究蛋白质-蛋白质相互作用的动态变化过程。它是通过将不同荧光蛋白作为供体-受体对，分别与研究的蛋白相融合，并通过评价FRET的效率来衡量两个蛋白质间相互作用的程度。
时间分辨荧光共振能量转移(Homogeneous Time Resolved Fluorescence，HTRF)将荧光共振能量转移(FRET)与时间分辨的检测(timeresolved measurement，TR)相结合，也常被称为TR-FRET。fluorescein或rhodamine等荧光分子的信号常常受到背景介质的干扰，使得难以获得很高的灵敏度。而TR-FRET在激发50-150毫秒后测量，非特异性的背景荧光基本已经衰减，而用于HTRF的荧光素分子还可以维持较强的信号。这样可以获得很高的信噪比，操作方便，适用于高通量的药物筛选。通过在抗体上偶联荧光素分子作为能量的供体和受体，TR-FRET可以检测10nm范围内两个分子之间的相互作用。基于TR-FRET的技术平台可以检测GPCR信号，激酶活性，细胞因子等蛋白与蛋白，多肽之间，蛋白与DNA或RNA之间相互作用。本实例中采用SNAP-Lumi4-Tb作为能量的供体，SNAP-green作为受体。用337nm的激发光激发，收集520nm(受体)的信号值，收集被激发后50μs-100μs内的读数(window1)和1200μs-1600μs内的读数(window2)。通过以下公式计算TR-FRET信号：
Figure BDA0001717605430000111
(1)细胞模型SNAP-tag CaSR融合蛋白的鉴定
通过非细胞渗透性的荧光标记配体检测了SNAP-tag在CHO-CaSR细胞中的表达，活细胞孵育非细胞渗透性SNAP-tag荧光标记配体，37℃5％CO2培养箱中孵育1h，样品经洗涤裂解，梯度胶电泳后，用Odyssey-CLx检测细胞膜上带SNAP-tag CaSR的表达量。CHO空细胞做负对照，瞬时表达CaSR质粒的CHO细胞(CaSR-CHO)做正对照，从结果可以看出(图7A)，CHO空细胞没有SNAP-tag表达，CaSR-CHO和CHO-CaSR中都可以检测出SNAP-tag的表达，并且分子量>300KDa，应为CaSR寡聚体。说明细胞模型中SNAP-tagCaSR融合蛋白正确表达。
(2)CaCl2引起CaSR二聚体构象的改变
将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上含100nM SNAP-Lumi4-Tb和75nM SNAP-green的溶液孵育1h，细胞用Tag-Lite洗3次，加入一定Tag-Lite buffer后用PHERAstar检测FRET信号，然后加CaCl2，终浓度分别0.025、0.01、0.005、0.003、0.001、0.0005、0.0001、0.00001M的CaCl2进行刺激，再用PHERAstar测定各组的FRET信号，每组设3个重复。
试验结果参见图7B，CaCl2作为CaSR特异性激动剂，对CaSR二聚体构象改变明显。由于加入CaCl2激动剂，CaSR的胞外区逐渐由open状态变为close状态，二聚体中两单体胞外区的距离逐渐变远，FRET信号逐渐减弱。横坐标为不同浓度的CaCl2，纵坐标为FRET信号。
由上实例可见：本发明细胞模型能够高通量地准确筛选以CaSR为靶点的活性物质，其制备方法简单科控，成本低廉：本发明药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，具有很好的稳定性和可靠性，可实现高通量的筛选，为筛选以CaSR(钙敏感受体)为靶点的活性物质提供了新的选择，也为探索CaSR蛋白结构功能的基础研究提供一种更为便捷的途径。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下为本发明专利申请涉及的核苷酸序列表，其中：
SEQ ID NO:1为Gene ID:846CasR基因序列；
SEQ ID NO:2为SNAP序列；
SEQ ID NO:3为将SNAP标签与CaSR基因通过连接序列cacgcgt相连得到的SNAP标签与CaSR基因的融合序列，其中1015-1557为SNAP序列，1563-4734为CasR基因序列，二者之间连接序列为cacgcgt，1009-1014为BamH1酶切位点,4734-4740为Aval酶切位点；
SEQ ID NO:4为所述SNAP序列和所述CasR基因序列二者的连接序列。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种表达人源CaSR基因的细胞模型
<141> 2018-06-29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3237
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
atggcatttt atagctgctg ctgggtcctc ttggcactca cctggcacac ctctgcctac 60
gggccagacc agcgagccca aaagaagggg gacattatcc ttggggggct ctttcctatt 120
cattttggag tagcagctaa agatcaagat ctcaaatcaa ggccggagtc tgtggaatgt 180
atcaggtata atttccgtgg gtttcgctgg ttacaggcta tgatatttgc catagaggag 240
ataaacagca gcccagccct tcttcccaac ttgacgctgg gatacaggat atttgacact 300
tgcaacaccg tttctaaggc cttggaagcc accctgagtt ttgttgctca aaacaaaatt 360
gattctttga accttgatga gttctgcaac tgctcagagc acattccctc tacgattgct 420
gtggtgggag caactggctc aggcgtctcc acggcagtgg caaatctgct ggggctcttc 480
tacattcccc aggtcagtta tgcctcctcc agcagactcc tcagcaacaa gaatcaattc 540
aagtctttcc tccgaaccat ccccaatgat gagcaccagg ccactgccat ggcagacatc 600
atcgagtatt tccgctggaa ctgggtgggc acaattgcag ctgatgacga ctatgggcgg 660
ccggggattg agaaattccg agaggaagct gaggaaaggg atatctgcat cgacttcagt 720
gaactcatct cccagtactc tgatgaggaa gagatccagc atgtggtaga ggtgattcaa 780
aattccacgg ccaaagtcat cgtggttttc tccagtggcc cagatcttga gcccctcatc 840
aaggagattg tccggcgcaa tatcacgggc aagatctggc tggccagcga ggcctgggcc 900
agctcctccc tgatcgccat gcctcagtac ttccacgtgg ttggcggcac cattggattc 960
gctctgaagg ctgggcagat cccaggcttc cgggaattcc tgaagaaggt ccatcccagg 1020
aagtctgtcc acaatggttt tgccaaggag ttttgggaag aaacatttaa ctgccacctc 1080
caagaaggtg caaaaggacc tttacctgtg gacacctttc tgagaggtca cgaagaaagt 1140
ggcgacaggt ttagcaacag ctcgacagcc ttccgacccc tctgtacagg ggatgagaac 1200
atcagcagtg tcgagacccc ttacatagat tacacgcatt tacggatatc ctacaatgtg 1260
tacttagcag tctactccat tgcccacgcc ttgcaagata tatatacctg cttacctggg 1320
agagggctct tcaccaatgg ctcctgtgca gacatcaaga aagttgaggc gtggcaggtc 1380
ctgaagcacc tacggcatct aaactttaca aacaatatgg gggagcaggt gacctttgat 1440
gagtgtggtg acctggtggg gaactattcc atcatcaact ggcacctctc cccagaggat 1500
ggctccatcg tgtttaagga agtcgggtat tacaacgtct atgccaagaa gggagaaaga 1560
ctcttcatca acgaggagaa aatcctgtgg agtgggttct ccagggaggt gcccttctcc 1620
aactgcagcc gagactgcct ggcagggacc aggaaaggga tcattgaggg ggagcccacc 1680
tgctgctttg agtgtgtgga gtgtcctgat ggggagtata gtgatgagac agatgccagt 1740
gcctgtaaca agtgcccaga tgacttctgg tccaatgaga accacacctc ctgcattgcc 1800
aaggagatcg agtttctgtc gtggacggag ccctttggga tcgcactcac cctctttgcc 1860
gtgctgggca ttttcctgac agcctttgtg ctgggtgtgt ttatcaagtt ccgcaacaca 1920
cccattgtca aggccaccaa ccgagagctc tcctacctcc tcctcttctc cctgctctgc 1980
tgcttctcca gctccctgtt cttcatcggg gagccccagg actggacgtg ccgcctgcgc 2040
cagccggcct ttggcatcag cttcgtgctc tgcatctcat gcatcctggt gaaaaccaac 2100
cgtgtcctcc tggtgtttga ggccaagatc cccaccagct tccaccgcaa gtggtggggg 2160
ctcaacctgc agttcctgct ggttttcctc tgcaccttca tgcagattgt catctgtgtg 2220
atctggctct acaccgcgcc cccctcaagc taccgcaacc aggagctgga ggatgagatc 2280
atcttcatca cgtgccacga gggctccctc atggccctgg gcttcctgat cggctacacc 2340
tgcctgctgg ctgccatctg cttcttcttt gccttcaagt cccggaagct gccggagaac 2400
ttcaatgaag ccaagttcat caccttcagc atgctcatct tcttcatcgt ctggatctcc 2460
ttcattccag cctatgccag cacctatggc aagtttgtct ctgccgtaga ggtgattgcc 2520
atcctggcag ccagctttgg cttgctggcg tgcatcttct tcaacaagat ctacatcatt 2580
ctcttcaagc catcccgcaa caccatcgag gaggtgcgtt gcagcaccgc agctcacgct 2640
ttcaaggtgg ctgcccgggc cacgctgcgc cgcagcaacg tctcccgcaa gcggtccagc 2700
agccttggag gctccacggg atccaccccc tcctcctcca tcagcagcaa gagcaacagc 2760
gaagacccat tcccacagcc cgagaggcag aagcagcagc agccgctggc cctaacccag 2820
caagagcagc agcagcagcc cctgaccctc ccacagcagc aacgatctca gcagcagccc 2880
agatgcaagc agaaggtcat ctttggcagc ggcacggtca ccttctcact gagctttgat 2940
gagcctcaga agaacgccat ggcccacagg aattctacgc accagaactc cctggaggcc 3000
cagaaaagca gcgatacgct gacccgacac cagccattac tcccgctgca gtgcggggaa 3060
acggacttag atctgaccgt ccaggaaaca ggtctgcaag gacctgtggg tggagaccag 3120
cggccagagg tggaggaccc tgaagagttg tccccagcac ttgtagtgtc cagttcacag 3180
agctttgtca tcagtggtgg aggcagcact gttacagaaa acgtagtgaa ttcataa 3237
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gacaaagact gcgaaatgaa gcgcaccacc ctggatagcc ctctgggcaa gctggaactg 60
tctgggtgcg aacagggcct gcacgagatc aagctgctgg gcaaaggaac atctgccgcc 120
gacgccgtgg aagtgcctgc cccagccgcc gtgctgggcg gaccagagcc actgatgcag 180
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ctcgccgtga aagagtggct gctggcccac gagggccaca gactgggcaa gcctgggctg 540
ggc 543
<210> 3
<211> 8820
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
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ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
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gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg 5700
atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 5760
ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 5820
tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 5880
atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 5940
aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 6000
ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt 6060
atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg 6120
ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt ggttgacggc 6180
aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc 6240
gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt 6300
gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa 6360
tagcacgtac tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 6420
atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 6480
ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 6540
acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 6600
atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 6660
tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 6720
gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 6780
gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 6840
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 6900
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 6960
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 7020
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 7080
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 7140
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 7200
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 7260
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 7320
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 7380
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 7440
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 7500
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 7560
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 7620
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 7680
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 7740
aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 7800
tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 7860
atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 7920
cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 7980
gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 8040
gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 8100
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 8160
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 8220
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 8280
aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 8340
atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 8400
tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 8460
catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 8520
aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 8580
tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 8640
gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 8700
tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 8760
tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 8820
<210> 4
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cacgcgt 7

Claims (10)

1.一种表达人源CaSR基因的细胞模型，其特征在于，它是中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR，已于2018年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201893，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.一种细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带并能表达CaSR基因的哺乳动物细胞，所述CaSR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞。
4.权利要求1～3中的任意一项所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将SNAP标签与CaSR基因通过SEQ ID NO:4所示的连接序列相连，得到融合有SNAP标签的CaSR基因；
(2)将融合有SNAP标签的CaSR基因与表达载体连接，构建含有CaSR基因的重组质粒pcDNA5/FRT Flag-Snap-CaSR(human)；
(3)将上述重组质粒转染哺乳动物细胞，经过药物筛选，培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株，该细胞株即为所述的细胞模型。
5.根据权利要求4所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，在步骤(2)后还包括对细胞株进行综合评估的步骤：在细胞株中加入CaSR特异性激动剂或CaSR特异性抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。
6.根据权利要求4所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的表达载体为pcDNA5/FRT。
7.根据权利要求6所述的细胞模型的构建方法，所述的质粒pcDNA5/FRT含有FRT位点。
8.根据权利要求4所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的哺乳动物细胞为Invitrogen商品化细胞系Flp-in-CHO细胞。
9.根据权利要求5所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述的CaSR特异性激动剂为CaCl2、MgCl2或Spermine，所述的CaSR特异性抑制剂NPS 2143hydrochloride。
10.权利要求1～3中的任意一项所述的细胞模型在筛选以CaSR为靶点的活性物质中的应用。
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