CN110218732A

CN110218732A - 一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用

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Publication number: CN110218732A
Application number: CN201910516667.XA
Authority: CN
Inventors: 岳昌武; 吕玉红; 崔相宜; 赵雯; 党冬梅; 孙心悦; 田红英
Original assignee: Yanan University
Current assignee: Yanan University
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2019-09-10
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110218732B

Abstract

本发明属于基因工程疫苗技术领域，特别涉及一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用，所述重组载体是由人工合成的多基因克隆表达元件连入pIRES2‑egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间，并且在pIRES2‑egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101获得，所述基因克隆表达元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，将所述重组载体转化进大肠杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后收集纯化多基因蛋白，得抗非洲猪瘟病疫的亚单位疫苗，将所述重组载体转化进乳酸杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后可得乳酸杆菌菌苗。制备的疫苗在不同水平、不同层次刺激机体产生抗体，激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力，进行抗非洲猪瘟病毒的免疫应答。

Description

一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，特别涉及一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小为170-190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。本病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，可将其危害严重性。加热被病毒感染的血液55℃下30min或60℃下10min，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。

当前，目前尚未研发出可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，只能通过做好养殖场生物安全防护来防控非洲猪瘟。而基因工程亚单位疫苗作为近些年热点研究的生物活性型疫苗具有纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。

现有研究表明蛋白P32、蛋白CD2V、蛋白I329L均可引起非洲猪瘟病感染生物体机体相关的免疫反应。但科学研究中构建稳定表达细胞株，抗体工程和细胞工程领域如果需要实现两个或以上的基因稳定共表达，通常需要通过两个载体共转染的筛选方法来实现，且实践中常面对以下问题:①两个载体共转染需要两种筛选标记；②两个载体的共转染效率，整合效率和目的基因的共表达效率及表达稳定性存在差异；③筛选标记基因与目的基因的共整合效率低。以上问题为筛选合适的稳定表达细胞株在效率、时间和人工成本等方面提出了挑战。因此，通过单个载体实现多基因共同表达显得尤为重要。

发明内容

本发明旨在提供一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用，具有制备流程方便安全，生产效率高，所得产物纯度高、稳定性好、产量高、安全性高等优点。

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒串联基因P32-CD2V-I329L-G6L，所述非洲猪瘟病毒串联基因P32-CD2V-I329L-G6L中CD2V截取自CD2V基因的抗原肽片段，I329L截取自I329L基因的抗原肽片段；P32基因、CD2V基因、G6L基因均来自FN557520.1毒株,I329L基因来自FR682468.1毒株。

本发明提供了一种含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体，所述重组载体是由人工合成的多基因克隆表达元件连入pIRES2-egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间，并且在pIRES2-egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101基因获得，所述基因克隆表达元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种上述含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1，用序列分析软件DNAMAN分析抗原肽段，分别对CD2V蛋白的基因序列、I329L蛋白的基因序列进行抗原肽片段的截取，获得目的基因；

S2，通过DNA重组技术，利用连接肽Linker1、Linker2和Linker3 P32、Linker1、CD2V、Linker2、I329L、Linker3、G6L的顺序连接，得到基因片段P32-Linker1-CD2V-Linker2-I329L-Linker3-G6L；

其中，Linker1的氨基酸序列为：GGGGGGPPPPPP；Linker2的氨基酸序列为：PPPPPPGGGGGG；Linker3氨基酸序列为：PPPGGGPPPGGG；

S3，通过DNA重组技术将IRES1、IRES2、IRES3序列依次插入基因片段P32-Linker1-CD2V-Linker2-I329L-Linker3-G6L之间；得到基因片段P32-Linker1-IRES1-CD2V-Linker2-IRES2-I329L-Linker3-IRES3-G6L；

获得IRES1、IRES2、IRES3de引物序列如下：

IRES1F:GATGATATCTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES1R:AACTGCAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

IRES2F：ACGCGTCGACTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES2R:AGAGAGCTCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

IRES3F：AAAAGTACTTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES3R:CCGCTCGAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

S4，在P32前后分别添加EcoRI、EcoRV酶切位点，CD2V前后分别添加PstI、SalI酶切位点，I329L前后分别添加SacI、ScaI酶切位点，G6L前添加XhoI酶切位点，得到基因片段EcoRI-P32-EcoRV-Linker1-IRES1-PstI-CD2V-SalI Linker2-IRES2-ScaI-I329L-ScaI-Linker3-IRES3-XhoI-G6L；

S5，在P32、CD2V、I329L、G6L目的基因后面均添加His-tag，序列：CACCACCACCACCACCAC；得到基因片段EcoRI-P32-(His-tag)-EcoRV-Linker1-IRES1-PstI-CD2V-(His-tag)-SalI Linker2-IRES2-ScaI-I329L-(His-tag)-ScaI-Linker3-IRES3-XhoI-G6L-(His-tag)；

S6，将S5获得的基因片段连接在pET-32a载体的启动子及部分序列之后，得到多基因克隆表达元件，所述pET-32a载体的启动子及部分序列序列为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATG；

S7，将多基因克隆表达元件连入pIRES2-egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间，并且在pIRES2-egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101，得到非洲猪瘟病多基因共表达载体。

本发明还提供了一种上述含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体在制备抗非洲猪瘟病疫苗中的应用。

进一步的，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体转化进乳酸杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后得得抗非洲猪瘟病疫苗。

进一步的，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后收集纯化多基因蛋白，得抗非洲猪瘟病亚单位疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明将已证实与抑制淋巴细胞增殖有关的侵染中国病猪的非洲猪瘟病毒编码基因CD2V(经本课题组与国外非洲猪瘟编码基因对比研究发现，CD2V可能存在与攻击并引发猪体快速感染并快速死亡的基因)、作为侵染中国病猪的非洲猪瘟病毒RNA聚合酶亚基6的编码基因G6L、与参与非洲猪瘟病毒进入细胞过程有关的编码基因P32、与非洲猪瘟病毒抑制细胞诱导表达I型抗生素过程有关的编码基因I329L整合成DNA疫苗，转化到大肠杆菌、乳酸杆菌体内制成菌苗、亚单位疫苗，在不同水平、不同层次刺激机体产生抗体，激发机体产生强力有效的特异性免疫应答，发挥高效的免疫保护力，抗非洲猪瘟病毒的免疫应答。

本发明的构建的重组载体不同基因间增加了IRES序列区与Linker序列区保证了彼此之间的相对独立表达而不互相影响；除P32(P30)，其余三种基因后面均加入His-tage标签，以便于后续对收集的蛋白的纯化操作。

附图说明

图1为实施例1中pIRES2-egfp载体结构图。

图2为实施例1中真核表达载体的构建(图中条带1-8分别为：未用酶切的环状载体；用PstI酶切成开环；用EcoRI、PstI两种酶切得到P32片段与剩余载体片段；用SacI、PstI两种酶切得到CD2V片段与剩余载体片段；用SacI、XhoI两种酶切得到I329L片段与剩余载体片段；用XhoI、BamHI两种酶切得到G6L片段与剩余载体片段；用EcoRI、PstI、SacI、XhoI、BamHI五种酶切得到P32片段、CD2V片段、I329L片段、G6L片段与载体骨架片段；DNA maker)。

图3为实施例2中为重组载体转染大肠杆菌JM109细胞检测目的基因蛋白表达电泳图。

图4为实施例3中为疫苗转染哺乳动物细胞效果分析(A:目的基因转染脾淋巴细胞.B:目的基因转染巨噬细胞)。

图5为实施例4中为四种不同抗原对山羊的免疫效果图。

图6为实施例4中四种不同抗原对猪的免疫效果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。

实施例1

猪瘟病毒串联基因的共表达载体的构建

S1，在NCBI数据库中查找FN557520.1毒株的P32、CD2V、G6L基因序列，通过利用软件DNAMAN分析并截取CD2V抗原肽的位置作为该串联基因中CD2V的基因序列，分析这三种片段具有的酶切位点并确定所要引入到所要合成的融合蛋白中的酶切位点，并对其核酸序列进行原核表达系统密码子优化。同样的方法查找FR682468.1毒株(登录号：)的I329L基因序列，通过利用软件DNAMAN分析并截取I329L抗原肽的位置作为该串联基因中I329L的基因序列，分析具有的酶切位点并确定所要引入到所要合成的串联基因中的酶切位点，并对其进行密码子优化；

S2，利用DNA重组技术，利用连接肽Linker1、Linker2和Linker3按照P32、Linker1、CD2V、Linker2、I329L、Linker3、G6L的顺序连接，得到基因片段P32-Linker1-CD2V-Linker2-I329L-Linker3-G6L；

其中，Linker1的氨基酸序列为：GGGGGGPPPPPP(如序列表SEQ ID NO：2)；Linker2的氨基酸序列为：PPPPPPGGGGGG(如序列表SEQ ID NO：3)；Linker3氨基酸序列为：PPPGGGPPPGGG(如序列表SEQ ID NO：4)；

获得IRES1、IRES2、IRES3de引物序列如下：

IRES1F:GATGATATCTGACCCCTCTCCCTCCCCCC(如序列表SEQ ID NO：5)；

IRES1R:AACTGCAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA(如序列表SEQ ID NO：6)；

IRES2F：ACGCGTCGACTGACCCCTCTCCCTCCCCCC(如序列表SEQ ID NO：7)；

IRES2R:AGAGAGCTCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA(如序列表SEQ ID NO：8)；

IRES3F：AAAAGTACTTGACCCCTCTCCCTCCCCCC(如序列表SEQ ID NO：9)；

IRES3R:CCGCTCGAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA(如序列表SEQ ID NO：10)；

S5，在P32、CD2V、I329L、G6L目的基因后面均添加His-tag，序列：CACCACCACCACCACCAC(如序列表SEQ ID NO：11)；得到基因片段EcoRI-P32-(His-tag)-EcoRV-Linker1-IRES1-PstI-CD2V-(His-tag)-SalI Linker2-IRES2-ScaI-I329L-(His-tag)-ScaI-Linker3-IRES3-XhoI-G6L-(His-tag)；

S6，将S5获得的基因片段连接在pET-32a载体的启动子及部分序列之后，得到多基因克隆表达元件，所述pET-32a载体的启动子及部分序列为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATG(如序列表SEQID NO：12)；

S7，先将pIRES2-egfp载体(如图1所示)进行BglII和BamHI双酶切，凝胶电泳回收长序列片段后，将多基因克隆表达元件连入pIRES2-egfp载体(如图1所示)中的BglII和BamHI酶切位点之间，然后在pIRES2-egfp载体1986nt的XbaI位点处插入oriR101(oriR101为乳酸杆菌的复制起始点)，测序并电泳分析(如图2所示)，结果正确，即得到非洲猪瘟病多基因共表达载体，用于后续实验。

实施例2

疫苗制备及目的蛋白的表达纯化

将非洲猪瘟病多基因共表达载体转入大肠杆菌表达菌、乳酸杆菌中，进行诱导表达与纯化。具体如以下步骤：

a.取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入1μL目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。

b.42℃水浴热激90S，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。

c.向每个离心管中加入500μL无菌的LB培养基(不含抗生素)混匀后置于37℃，150转/每分钟培养1小时，使细菌复苏。

d.吸取200μL已转化的感受态细胞加到有卡那的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开，将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板37℃过夜培养。

e.阳性转化子的鉴定：提取阳性转化子的基因组，跑电泳分析条带。

f.在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白:在含卡纳抗性、阳性转化子的培养基中加入IPTG使IPTG终浓度达百分之七，摇床上放置2.5h，37℃,180rpm，离心收集沉淀、破碎离心细胞、蛋白质纯化脱盐、蛋白质电泳分析结果，结果如图3所示。

实施例3

非洲猪瘟免疫保护实验

1)疫苗制备

大量收集质粒DNA、表达目的蛋白,用分光光度计测定蛋白浓度，-80℃保存。进行DNA疫苗、亚单位疫苗的稳定性和安全性试验。

2)免疫程序

多价DNA疫苗体外表达效果分析。通过原核表达，在细胞水平上检测是否有相应抗原的产生(如图4所示)：

a.将构建的哺乳动物串联表达穿梭质粒载体，通过电转化或接合转移方式转化大肠杆菌，4h后添加卡那霉素杀死未侵染的大肠杆菌细胞，于24h、36h、48h、72h、96h后收获细胞，分别利用荧光显微镜、qRT-PCR和western blotting/ELISA方法在细胞水平、mRNA及蛋白质表达水平检测基因体外表达效果。

b.将构建的哺乳动物串联表达穿梭质粒载体，通过电转化或接合转移方式转化乳酸杆菌，4h后添加卡那霉素杀死未侵染的乳酸杆菌细胞，于24h，36h、48h、72h、96h后收获细胞，分别利用荧光显微镜、qRT-PCR和western blotting/ELISA方法在细胞水平、mRNA及蛋白质表达水平检测基因体外表达效果。

c.将构建的哺乳动物串联表达穿梭质粒载体，通过电转化或接合转移方式转化哺乳动物的肿瘤细胞，4h后添加卡那霉素杀死未侵染的哺乳动物肿瘤细胞，于24h、36h、48h、72h、96h小时后收获细胞，分别利用荧光显微镜、qRT-PCR和western blotting/ELISA方法在细胞水平、mRNA及蛋白质表达水平检测基因体外表达效果。

3)DNA疫苗体内抗体产生分析：

利用四种基因分别单独免疫山羊，得到四种山羊的抗血清(对应会产生相应的抗体)，再用所构建的DNA疫苗免疫猪，得到四种融合抗原的抗体(存在于猪的抗血清内)，再通过利用四种融合抗原与猪的融合抗原(有上述猪的抗血清得到)利用正向westernblotting、抗原抗体特异性结合方法进行对照分析；再通过利用四种山羊的抗血清与猪的抗血清利用反向western blotting、抗原抗体特异性结合方法进行对照分析猪体产生四种单独抗体。完成DNA疫苗体内抗体产生分析。

a.免疫山羊至少二十只，分四组(每组三只)均注射抗血清(已进行荧光标记)，再分别注射四种不同抗原，分析免疫效果为：抽出的血液中可利用荧光显微镜观察到带有荧光性的抗原抗体复合物，可得山羊体内所产生的抗体可以与抗原发生特异性反应。如图5(A、B、C、D分别为P32、CD2V、I329L、G6L四种作为抗原的DNA片段与抗血清中的抗体特异性结合得到的带有荧光性的抗原抗体复合物)。

b.免疫猪至少十二头猪(每组三只)，分四组(每组三只)均注射异源抗血清(已进行荧光标记)，再分别注射四种不同抗原，免疫效果为：抽出的血液中可利用荧光显微镜观察到带有荧光性的抗原抗体复合物，可得山羊体内所产生的抗体可以在猪体内与抗原发生特异性反应。如图6(A、B、C、D分别为P32、CD2V、I329L、G6L四种作为抗原的DNA片段与异源抗血清中的抗体特异性结合得到的带有荧光性的抗原抗体复合物)。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 岳昌武

<120> 一种非洲猪瘟病毒串联基因、共表达载体、构建方法及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6430

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

ccggactcag atcttaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc 660

tctacaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atggaattca tggattttat 720

tttaaatata tccatgaaaa tggaggtcat cttcaaaacg gatttaagat catcttcaca 780

agttgtgttt catgcgggta gcttgtataa ttggttttct gttgagatta tcaatagcgg 840

tagaattgtt acgaccgcta taaaaacatt gctcagcact gttaagtatg atattgtgaa 900

atctgctcat atatatgcag ggcaagggta tactgaacat caggctcaag aagaatggaa 960

tatgattctg catgtgctgt ttgaagagga gacagaatcc tcagcatcat cggaaagcat 1020

tcatgaaaaa aatgataatg aaaccaatga atgcacatcc tcctttgaaa cattgtttga 1080

gcaagagccc tcatcagagg aacctaaaga ctccaagctg tatatgcttg cacaaaagac 1140

tgtgcaacat attgaacaat atggaaaggc acctgatttt aacaaggtta ttagagcaca 1200

taactttatt caaaccattc atggaacccc tctaaaggaa gaagaaaaag aggtggtaag 1260

actcatggtc attaaacttt taaaaaaaaa acaccaccac caccaccacg atatcggcgg 1320

cggcggcggc ggcccaccac caccaccacc actgcagatg aatccaatat taaaatatca 1380

aaattattta tccacattat tttatatcat aatttttatt gtgagtggat taataatagg 1440

tatttttatt tcaatcatat ctgtattatc tatacgaaga aaaagaaaaa aacatgttga 1500

agaaatagaa agtccaccac cctctgaatc taatgaagaa gatatttctc acgatgacac 1560

cacttccata catgaaccat ctcccagaga accattactt cctaagcctt acagtcgtta 1620

tcagtataat acacctattt actacatgcg tccctcaaca caaccactca acccatttcc 1680

cctacctaaa ccatgcccgc cacctaaacc atgtcctcca cccaagccat gcccgccacc 1740

caaaccatgt cctccaccta aaccgtgttc tccacccaaa ccgtgtcgtc cacctaaacc 1800

atgtcctcca cctaaaccat gtcctccacc taaaccatgt cctccaccta aaccatgtcc 1860

tccacctaaa ccatgtcctt cacctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat 1920

cccgttacta cccaatatcc cgccattatc tacacaaaat atttcgctta ttcatgtaga 1980

tagaattatt caccaccacc accaccacgt cgacccacca ccaccaccac caggcggcgg 2040

cggcggcggc gagctcatgt taaagacgtt tcaggacatc cgtattatcc gctgcgggat 2100

gaaaaatatt tctgaaattg caggtggctt tggtaaagaa ctcaagtttt tggacctaag 2160

gtataacgat ttacaagtca tagattataa catactcaga aaacttattc gctccaacac 2220

cccaacctac ctatattaca ataatctaat gtgtggaaaa agaaattgtc ccttatacta 2280

cttcctacta aaacaggaac agacgtacct aaagcgtctt ccgcagtttt tcttaagaag 2340

aattaatttt agtaacaata acacattttt gtatcatttt ttaagctgcg ggaataagcc 2400

aggacatgag tttctggaat accaaacaaa atattgtaga acaaagtttc ccgagataaa 2460

tattacggta aatcaattga tagctaagaa aaatacggaa cgttataaaa gctgctaccc 2520

cttagtgttc atatctattt tatgctcctg tatatcattt ctgtttttat tcatttgctt 2580

gttgcgttct atttgtaaaa aatattcctg tacgaaacag caccaccacc accaccacag 2640

tactccacca ccaggcggcg gcccaccacc aggcggcggc ctcgagatgg ctgataatga 2700

caacgaggat attatcatgg atgacctcgt ggaggaatat gtggaaacgg aagaggagaa 2760

cttcgttgac agtgaggagg agtccgagga caaggacgag atcgtggagt ctccgtccat 2820

ctgcgagggc tttgtgcagg cctcgtcgca aacattggtc attatacccg ataacgagcg 2880

cattacctcc aacgttttaa ccacctttga ggccacaagg ttggtcgccg ttagagcgca 2940

acagttggca attaatgggt ctacaatgct taaaaaaaaa tatagcagtc ctattgatat 3000

agctaagcaa gaactcttta ataggaaaat tccactgctc gtcatgcgct gcatcaaggt 3060

aacaccgaag gtcaaaaaat tgttgaaata tggaacccca gggaaatggg catcccgctg 3120

tcaccaccac caccaccact agggatccgc ccctctccct cccccccccc taacgttact 3180

ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata 3240

ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt 3300

cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa 3360

gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag 3420

cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca 3480

cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc 3540

aaatggctct cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat 3600

tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta 3660

aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga 3720

taatatggcc acaaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 3780

cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 3840

gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 3900

cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 3960

ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 4020

ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 4080

cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 4140

caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 4200

cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 4260

cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 4320

gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 4380

gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 4440

cgagctgtac aagtaaagcg gccgcgactc tagaacatct caattggtct aggtgatttt 4500

aatcactata ccaattgaga tgggctagtc aatgataatt actagtcctt ttcctttgag 4560

ttgtgggtat ctgtaaattc tgctagacct ttgctggaaa acttgtaaat tctgctagac 4620

cctctgtaaa ttccgctaga cctttgtgtg ttttttttgt ttatattcaa gtggttataa 4680

tttatagaat aaagaaagaa taaaaaaaga taaaaagaat agatcccagc cctgtgtata 4740

actcactact ttagtcagtt ccgcagtatt acaaaaggat gtcgcaaacg ctgtttgctc 4800

ctctacaaaa cagaccttaa aaccctaaag gcttaagtct agatcataat cagccatacc 4860

acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa 4920

cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 4980

taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt 5040

ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt 5100

aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg 5160

caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg 5220

gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta 5280

tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg 5340

ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa 5400

gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct 5460

ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct 5520

acagggcgcg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 5580

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 5640

ataatattga aaaaggaaga gtcctgaggc ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag 5700

ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 5760

aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa 5820

agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc 5880

ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat 5940

gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt 6000

ggaggcctag gcttttgcaa agatcgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 6060

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 6120

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 6180

ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga 6240

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 6300

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 6360

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 6420

gctgcatacg 6430

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Pro Pro Pro Gly Gly Gly Pro Pro Pro Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgatatct gacccctctc cctcccccc 29

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aactgcagat tatcatcgtg tttttcaaag gaaa 34

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgcgtcgac tgacccctct ccctcccccc 30

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agagagctca ttatcatcgt gtttttcaaa ggaaa 35

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaagtactt gacccctctc cctcccccc 29

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccgctcgaga ttatcatcgt gtttttcaaa ggaaa 35

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caccaccacc accaccac 18

<210> 12

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta caaataattt 60

tgtttaactt taagaaggag atatacatg 89

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒串联基因P32-CD2V-I329L-G6L，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒串联基因P32-CD2V-I329L-G6L中CD2V截取自CD2V基因的抗原肽片段，I329L截取自I329L基因的抗原肽片段；P32基因、CD2V基因、G6L基因均来自FN557520.1毒株,I329L基因来自FR682468.1毒株。

2.一种含有权利要求1所述非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体，其特征在于，所述多基因共表达载体是由多基因克隆表达元件连入pIRES2-egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间，并且在pIRES2-egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101基因获得，所述基因克隆表达元件的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

3.如权利要求2所述的一种含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1，分别对CD2V蛋白的基因序列、I329L蛋白的基因序列进行抗原肽片段的截取，分别获得CD2V基因和I329L基因；

S2，通过DNA重组技术，利用连接肽Linker1、Linker2和Linker3按照P32、Linker1、CD2V、Linker2、I329L、Linker3、G6L的顺序连接，得到基因片段P32-Linker1-CD2V-Linker2-I329L-Linker3-G6L；

S3，通过DNA重组技术将IRES1、IRES2、IRES3核苷酸序列依次插入基因片段P32-Linker1-CD2V-Linker2-I329L-Linker3-G6L之间；得到基因片段P32-Linker1-IRES1-CD2V-Linker2-IRES2-I329L-Linker3-IRES3-G6L；

获得IRES1、IRES2、IRES3的引物序列如下：

IRES1F:GATGATATCTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES1R:AACTGCAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

IRES2F：ACGCGTCGACTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES2R:AGAGAGCTCATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

IRES3F：AAAAGTACTTGACCCCTCTCCCTCCCCCC；

IRES3R:CCGCTCGAGATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAA；

S5，在P32、CD2V、I329L、G6L目的基因后面均添加His-tag，序列：CACCACCACCACCACCAC；得到基因片段EcoRI-P32-(His-tag)-EcoRV-Linker1-IRES1-PstI-CD2V-(His-tag)-SalILinker2-IRES2-ScaI-I329L-(His-tag)-ScaI-Linker3-IRES3-XhoI-G6L-(His-tag)；

S6，将S5获得的基因片段连接在pET-32a载体的启动子及部分序列之后，得到多基因克隆表达元件，所述pET-32a载体的启动子及部分序列为：TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTACAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATG；

S7，将多基因克隆表达元件连入pIRES2-egfp载体中的BglII和BamHI酶切位点之间，并且在pIRES2-egfp载体1986nt的XbaI位点之后插入oriR101基因，得到非洲猪瘟病多基因共表达载体。

4.一种权利要求2所述的含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体在制备抗非洲猪瘟病疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体在制备抗非洲猪瘟病疫苗中的应用，其特征在于，所述疫苗通过以下方法制备得到的：将含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体转化进乳酸杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后得抗非洲猪瘟病疫苗。

6.根据权利要求4所述的含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体在制备抗非洲猪瘟病疫苗中的应用，其特征在于，所述疫苗通过以下方法制备得到的：将含有非洲猪瘟病毒串联基因的共表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞中，筛选并扩大培养后收集纯化多基因蛋白，得抗非洲猪瘟病亚单位疫苗。