CN113444153A

CN113444153A - 非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN113444153A
Application number: CN202110823057.1A
Authority: CN
Inventors: 金梅林; 吕长杰; 姜丽丽; 赵亚; 杨丽; 赵丽; 吴超; 杨永; 邹忠; 孙小美
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Wuhan Keqian Biology Co Ltd; Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-07-21
Also published as: CN113444153B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。通过比对发现原核表达的CD2v截短蛋白作为ELISA包被抗原不能检测到非洲猪瘟病毒感染的阳性血清，而真核表达的CD2v蛋白作为ELISA包被抗原可以检测非洲猪瘟病毒感染的阳性血清。以真核表达CD2v蛋白作为包被抗原制备的间接ELISA试剂盒，同时配合以非洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的间接ELISA试剂盒，可用于鉴别ASFV野毒株和自然弱毒株的感染，操作步骤简单，结果可靠。因此，以本发明提供的真核表达的截短蛋白制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

Description

非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African SwineFeverVirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性和高度接触性的动物传染病，其临床症状主要表现为皮肤充血发绀、内脏器官严重出血、发病率高、死亡率高、病程短。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物A类动物疫病，我国将此病规定为一类动物传染病。2018年ASFV传入我国，给我国养殖业造成巨大的经济损失，随着病毒的传播，田间出现了突变弱毒株，该毒株潜伏期更长，造成的损失更为严重，因此检测该毒株的存在对ASFV的防控显得至关重要。

非洲猪瘟EP402R基因编码CD2v蛋白，是一种重要的病毒糖基化蛋白，在病毒感染的细胞中，CD2v有三种表达形式，分别是89kDa的全长糖基化蛋白，及通过蛋白水解作用产生的大小为63kDa的N-末端糖基化片段和大小约为26kDa的C-末端非糖基化片段。非洲猪瘟病毒粒子通过该蛋白凝集猪的红细胞，进而随着血液的流动在全身组织器官中大量扩增传播，在培养的原代细胞中，CD2v蛋白可以导致猪红细胞形成玫瑰花环状，这种玫瑰花环实验也是判定ASFV滴度的一种实验方法，因此该蛋白在病毒毒力方面发挥着重要作用。

国家非洲猪瘟专业实验室对2020年6月至12月非洲猪瘟与流行病学进行了调查，成功分离到22株非洲猪瘟病毒，测序发现其中有11株病毒发生了突变或缺失，这些突变或缺失导致病毒CD2v蛋白翻译提前终止，不能编码出完整有功能的CD2v蛋白。CD2v是病毒吸附红细胞活性(HAD)所必须的蛋白质，通过HAD实验证实所有CD2v蛋白翻译提前终止的突变株均丧失红细胞吸附能力。田间非洲猪瘟CD2v突变或缺失弱毒株不能够表达CD2v，失去了对猪红细胞吸附的现象，导致病毒的毒力减弱。但值得注意的是，虽然CD2v突变或缺失自然弱毒株致病力较典型强毒株明显降低，但仍然呈现明显的残留毒力，具有很强的水平传播能力，会在田间猪群中广泛传播，造成持续性感染、慢性病毒程甚至死亡。非洲猪瘟CD2v缺失或突变自然弱毒株的逐渐流行，给ASFV的诊断带来巨大障碍，为我国非洲猪瘟防控带来全新挑战。目前，主要基于实时荧光定量PCR的方法来检测非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株的感染，还没有商品化针对非洲猪瘟CD2v突变或缺失自然弱毒株和野毒株的鉴别诊断ELISA试剂盒，然而由于自然弱毒株的毒力弱，有时表现出隐形感染或间歇性排毒，导致通过实时荧光定量PCR的方法在某些情况下存在漏检等，从而不能及时发现，给疫病的控制带来巨大的挑战。非洲猪瘟病毒自然弱毒株侵入机体后会产生相应的抗体，因此通过ELISA实验检测猪只产生的抗体可以完美的避开检测不到病毒核酸这一难题，及时发现猪群中是否存在自然弱毒株，尽早剔除，防止猪群大面积感染，将非洲猪瘟病毒防控的时间缩短，减少不必要的经济损失。所以，以该蛋白作为包被抗原建立的ELISA检测方法再配合以p54蛋白为包被抗原建立的ELISA检测方法，可用于鉴别非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株感染。

针对CD2v蛋白目前已有一些相关的研究报道，任肖等报道了在原核表达系统中表达ASFV EP402R基因，获得重组表达CD2v蛋白，但表达的蛋白主要以包涵体形式存在，无蛋白活性。周晓慧等研究指出，CD2v胞内区氨基酸抗原指数普遍较高，而且紧密相连，提示CD2v胞内区的免疫原性较强，虽然胞外区也有抗原指数较高的氨基酸区域，但分散存在且多为5-6个氨基酸，因此推测CD2v胞外区的免疫原性较弱，因此，他们的研究选择CD2v胞内区进行原核表达，用来进行非洲猪瘟抗体血清ELISA检测。与上述方案不同，本发明使用的是其不推荐的胞外氨基酸序列。

申请号为201910426668.5的申请在SF9细胞中表达非洲猪瘟CD2v全长蛋白和210个氨基酸的截断蛋白，发现全长蛋白不表达，截短优化的片段有表达，但蛋白表达量较低为2-4mg/L，Western blot检测其具有抗原性。在申请201910428334.1中，通过截取CD2v N末端210个氨基酸序列并进行优化，发现优化前的基因不表达，优化后有表达，表达量约为3mg/L，Western blot检测其具有免疫原性；申请号201911047918.0同样选取了CD2v胞外区蛋白进行了不同截短在真核系统的表达，以此蛋白为抗原包被ELISA板进行血清学检查，CD2v的抗原包被浓度需要达到500ng/孔，说明抗原的敏感度较低。申请202010396235.2中截取自CD2v蛋白靠近跨膜域的单个免疫球蛋白样结构域的氨基酸序列，用于制备非洲猪瘟诊断制品和疫苗。202110073736.1公开了以sf9细胞表达的CD2v截短蛋白进行血清抗体检测，当抗原的包被量为100ng/孔时，可以对区分野毒感染阳性血清和阴性血清，但是对基因缺失弱毒疫苗免疫血清和自然弱毒株感染血清检测的特异性并不清楚，202110024959.9公开了用原核表达CD2v胞外区555个核苷酸的片段用于制备非洲猪瘟抗体检测ELISA试剂盒。202010445287.4中选取了片段大小在70-100KD的CD2v蛋白用于制备检测非洲猪瘟的免疫荧光层析试剂盒。而事实上，即便利用的是CD2v截短蛋白，若截取的区域有问题，检测自然弱毒株的时候，依然会出现假阳性的问题。

在申请201910069838.9中，研究人员将CD2v全长蛋白中的跨膜区除去，重组表达只含有CD2v蛋白胞外区和胞内区片段的亚单位蛋白，最终的蛋白得率为0.5-0.8mg/L，通过ELISA检测发现，表达的CD2v蛋白能够和免疫CD2v蛋白小鼠的阳性血清反应，；在201911293735.7中将CD2v全基因片段构建到CHO细胞中获得CD2v蛋白抗原，表达的CD2v蛋白能够和免疫CD2v蛋白新西兰兔的阳性血清反应；在上述方案中，抗原蛋白可以利用抗原蛋白免疫获得的血清抗体反应是理所应当的，但其是否可与病毒的阳性血清反应，此处有待商榷。

截至申请日前，目前依然没有可区分鉴别非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株感染后的血清的抗原蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原是由非洲猪瘟病毒CD2v蛋白截短后获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种可高效表达的SEQ ID NO.1所示蛋白的方法，利用该方法，目的蛋白的表达量可达到96.5mg/L。

本发明还有一个目的在于提供了SEQ ID NO.1所示蛋白在制备非洲猪瘟病毒野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原是由非洲猪瘟病毒CD2v蛋白截短后获得，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

一种可高效表达的SEQ ID NO.1所示蛋白的方法，包括将SEQ ID NO.2构建到表达载体pCMV中后，采用悬浮293细胞进行真核表达。

SEQ ID NO.1所示蛋白在制备非洲猪瘟病毒野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用，包括利用SEQ ID NO.1所示蛋白制备成间接ELISA检测试剂盒，用于检测待测样品仅为感染了非洲猪瘟病毒野毒或自然弱毒的血清。

或是联合申请号为202010700335.X申请中的实施例2中的试剂盒，用于检测待测样品是未知病毒感染的抗体血清。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明分析了非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的氨基酸区域，进行截短和密码子优化，并将CD2v N-末端区通过真核表达系统进行表达，CD2vC-末端区通过原核表达系统进行表达。由于CD2v N-末端区域的表达过程需要进行糖基化修饰，因此需要在真核系统中进行表达，而CD2vC-末端区域不需要进行糖基化修饰，因此可以选择原核表达系统进行表达。两种表达系统所产生的CD2v蛋白均为可溶的形式，通过比对发现，真核表达的CD2v N-末端蛋白相对于原核表达的CD2vC-末端蛋白具有更好的免疫原性，因此可作为检测试剂盒的包被抗原。

2、本发明构建的真核表达细胞株对选取的CD2v蛋白能够高效大量的表达，表达量达到96.5mg/L

3、本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒能够快速准确检测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。

4、该试剂盒同时配合以非洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的ELISA检测试剂盒可以用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和自然弱毒株的感染。

5、本发明提供的CD2v蛋白表达于上清且表达量高，获得的蛋白纯度高、蛋白活性好，表达的CD2v蛋白包被量仅需50ng/孔就等达到良好的检测效果，临床实用性强。

6、利用本发明的截短蛋白制备出的ELISA试剂盒，灵敏度高，特异性强，操作简便，同时配合以p54蛋白为包被抗原的检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒可以高效快速鉴别非洲猪瘟自然弱毒株和野毒株感染猪只的血清，对临床非洲猪瘟的防控起到重要作用。

附图说明

图1为真核表达CD2v N-末端区N1重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳结果。

图2为真核表达CD2v N-末端区N1重组蛋白Western-blot图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

非洲猪瘟病毒截短蛋白的获得：

1、重组质粒的获得与鉴定

分析了非洲猪瘟HLJ毒株(GenBank登录号：MK333180.1)CD2v蛋白的N-末端区和C-末端区的氨基酸位置，由于CD2v N-末端区域的表达过程需要进行糖基化修饰，因此需要在真核系统中进行表达，而CD2vC-末端区域不需要进行糖基化修饰，因此可以选择原核表达系统进行表达。密码子优化是实现异源蛋白高效表达的关键技术手段，而蛋白表达是一个系统工程，因此在进行密码子优化时仅仅把密码子替换为某物种使用频率最高的密码子，有可能起不到最佳效果，此时还需要考虑到调整GC含量，酶切位点、mRNA的稳定性、以及密码子协同性和密码子敏感性等等，但即使考虑了这些，因为其它很多的未知因素，对于很多蛋白仍然存在表达量低，有的甚至比未优化前效率更低。本发明根据293T真核表达系统密码子的偏好性对CD2v基因序列进行优化，同时结合GC含量、mRNA稳定性、翻译后折叠和修饰等因素，设计了大量不同的密码子优化序列，通过检测目的蛋白表达水平，对不同优化序列进行比较发现不同的优化序列其蛋白的表达水平差异较大。

本发明中申请人对N-末端区和C-末端区的密码子进行优化，选择了两条优化后的N-末端区序列(编码的蛋白质为SEQ ID NO.1所示)，分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，选择一条C-末端区优化后的序列，为SEQ ID NO.4所示，以这几条序列为例对密码子优化筛选过程进行示例说明。

将CD2v蛋白的N-末端区优化序列(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)和C-末端区优化序列(SEQ ID NO.4)分别构建到pCMV-C-his和pET32a载体中(北京擎科生物科技有限公司)，获得了重组质粒pCMV-EP402R-N1和pCMV-EP402R-N2、pET32a-EP402R-C。对重组质粒进行测序(北京擎科生物科技有限公司)，经比对发现，测序结果与目的基因序列一致。

2、重组蛋白的表达与纯化

pET32a-EP402R-C重组质粒的原核表达：

挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养8～10小时。再按1％的比例将菌液接种于400ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养至菌液OD 600值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导表达3小时，离心收集菌体。收集的菌体，用原培养基1/10体积的BindingBuffer重悬菌体，在低温高压破碎仪中破碎菌体，重复破碎3次，菌体裂解液10000r/min，离心15分钟，收集上清。用0.22μm滤器过滤收集的上清，2～8℃保存备用。

pCMV-EP402R-N1和pCMV-EP402R-N2重组质粒的真核表达：

采用悬浮293真核表达系统，转染前一天以2x10⁶cell/mL的密度将细胞接种到新鲜培养基中，置于37℃，5％CO₂,150-175rpm转速的恒温摇床中培养；转染当天，取样计算细胞密度和活率。细胞密度应该在3-5x10⁶cell/mL，活率高于90％。调整细胞密度到3x10⁶/mL，将细胞置于125mL的细胞摇瓶中，总体积为20mL；用optim培养基稀释20μg的质粒(pCMV-EP402R-N1、pCMV-EP402R-N2)至总体积为0.5mL，用移液器轻轻吹打混匀；用optim培养基稀释40μL的lip8000转染试剂至总体积0.5mL，用移液器轻轻吹打混匀；将稀释好的DNA与转染试剂轻轻混匀，逐滴加入到细胞培养液中，滴加的同时轻轻摇动细胞瓶，摇匀后放回摇床继续培养，培养48小时收取培养上清。两种表达系统所产生的CD2v蛋白均为可溶的形式。

原核表达蛋白和真核表达蛋白经过亲和层析进行纯化，具体步骤为：首先，用5个柱体积的Binding Buffer平衡层析柱，然后上样，上样结束后再用10个柱体积的BindingBuffer平衡层析柱。然后，用Elution Buffer进行洗脱，观察仪器屏幕上出现蛋白峰时开始收集，直至峰结束后停止收集，整个过程保持液体流速为1.0ml/min，收集的蛋白用TE缓冲液透析36小时，每隔12小时换1次透析液，透析完成后收集重组蛋白，并进行SDS-PAGE分析(CD2vN-末端区蛋白N1蛋白为图1所示)，同时经Image J软件计算分析蛋白纯度，pCMV-EP402R-N1真核表达所得蛋白纯度达到95％，pCMV-EP402R-N2真核表达所得蛋白纯度达到94％,；pET32a-EP402R-C原核表达所得蛋白纯度达到94％。超微量核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，原核表达的蛋白浓度为1.88mg/mL；真核表达N1的蛋白浓度为1.93mg/ml，真核表达N2的蛋白浓度为0.56mg/ml，而且在表达的过程中还发现未优化的全长序列在真核细胞中不表达。

根据公式：蛋白得率＝纯化后蛋白浓度*纯化所得蛋白体积/取用发酵体积，经过计算可知本发明所获得的真核表达N1蛋白细胞株的表达量达到96.5mg/L，表达N2蛋白细胞株的表达量为28mg/L。因此，SEQ ID NO.2所示序列更适用于本发明的真核表达体系。

实施例2：

不同表达方式的非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白用于区分ASFV野毒和自然弱毒：

利用实施例1方法，申请人将非洲猪瘟病毒蛋白CD2v N-末端区真核表达蛋白N1和C-末端区原核表达蛋白进行表达纯化。将原核表达蛋白和真核表达蛋白分别作为包被抗原检测临床上已知背景临床血清(野毒株感染阳性血清10份，阴性血清10份，自然弱毒株感染血清10份)。

其中P54抗体阳性对照和阴性对照样品制备方法：

参考非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)，按照专利文件中实施例3进行操作。

CD2v抗体阳性血清制备方法：

选用7～8周龄健康阴性猪，要求血清经非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)检测为阴性，且以PCR或RT-PCR方法检测ASFV、CSFV、PRV、PPV、JEV核酸均为阴性。将本发明获得的CD2vN-末端区蛋白N1或原核表达的蛋白与佐剂1:1混合，颈部肌肉注射1ml/每头(蛋白含量1.0mg)，连续免疫3次，每次间隔14日。第3次免疫14天后开始采血检测，用CD2vN-末端区蛋白N1作为包被抗原，通过间接ELISA检测免疫后的血清ELISA效价不低于1:16。采集血液，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟，加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。将制备的血清用保护剂稀释10倍，0.22μm滤器过滤除菌，即为阳性对照。

CD2v抗体阴性血清制备方法：

选用7～8周龄健康阴性猪，要求血清经非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)检测为阴性，且以PCR或RT-PCR方法检测ASFV、CSFV、PRV、PPV、JEV核酸均为阴性。采集血液，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟。加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。将制备的血清用保护剂稀释10倍，0.22μm滤器过滤除菌，即为阴性对照。

1.重组蛋白CD2vN-末端区蛋白N1和C-末端区原核表达蛋白的免疫原性检测

为了进一步验证所得的真核表达CD2v蛋白的免疫原性，利用阳性对照(1:100倍稀释)作为一抗，羊抗猪lgG-HRP(1:5000)作为二抗，通过Western-blot检验抗原抗体的特异性反应，能够检测到特异性目的条带，由于真核表达的CD2v蛋白经过了糖基化修饰，在目的条带处呈现弥散状。CD2v C-末端区重组蛋白能和原核表达蛋白免疫后的阳性血清反应，具有生物学活性和免疫原性。CD2v N-末端区重组蛋白N1的Western-blot检测结果也表明其具有生物学活性和免疫原性，结果如图2所示。分别使用真核和原核表达蛋白可作为间接ELISA检测试剂盒的包被抗原进行阴阳性血清和弱毒血清的检测。

2.CD2v N-末端区真核表达蛋白N1和C-末端区原核表达蛋白用于区分ASFV自然弱毒：

将实施例1中获得的真核表达CD2v N1蛋白和原核表达CD2v C端蛋白按50ng/孔进行抗原包被，具体检测方法参考实施例3和实施例4。

以CD2v N1蛋白为包被抗原的结果判定标准为：S为样品OD_630nm值，P为阳性对照OD_630nm平均值，N为阴性对照OD_630nm平均值。若S/P值≥0.43，样品判定为阳性；若S/P值<0.43，样品判定为阴性。

以P54蛋白为包被抗原的步骤和结果判定标准参考申请号：202010700335.X中的实施例3。

原核表达CD2v C端蛋白由于无法区分阴阳性血清，因此无法进行结果判定。

结果如表1所示，原核表达的CD2vC-末端蛋白虽然为可溶的具备活性的蛋白，能和其自身免疫的阳性血清反应，但其特异性较差，不能够区分非洲猪瘟病毒野毒和弱毒株感染的血清及未感染的阴性血清，而真核表达的CD2vN-末端重组蛋白N1可以鉴别非洲猪瘟病毒野毒和弱毒感染的血清及未感染的阴性血清。

表1 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白真核表达和原核表达产物对临床血清检测结果

注：1-10号样品为已知背景非洲猪瘟野毒株感染阳性血清10份，11-20样品为未感染非洲猪瘟病毒阴性血清10份，21-30样品为非洲猪瘟弱毒株感染血清10份。

实施例3：

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)的构建：

1、阳性对照的制备：

阳性对照制备方法参考实施例1中CD2v抗体阳性血清制备方法。

2、阴性对照的制备：

阴性对照制备方法参考实施例1中CD2v抗体阴性血清制备方法。

3、酶标板的制备

通过方阵法确定重组抗原N1的最佳包被浓度为50ng/孔，在2-8℃包被14小时。弃去包被液，加入1％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液，37℃封闭2小时。弃去封闭液，自然风干后抽真空包装成成品试剂盒酶标板。

4、试剂盒其他组分的配制

包被液：取碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，加注射用水至1000ml，调pH值至9.6，置2～8℃保存备用。

封闭液：取牛血清白蛋白(BSA)5.0g、蔗糖10.0g、氯化钠(NaCl)8.5g、Tween-2005ml、硫柳汞钠0.10g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

保护剂：取氯化钾(KCl)0.2g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)1.42g、牛血清白蛋白(BSA)5.0g、硫柳汞钠0.1g、吐温20(Tween-20)0.5ml、蔗糖2.0g，加注射用水至1000ml，置2～8℃保存备用。

酶标记物：将商品化羊抗猪IgG-HRP酶标抗体5000倍稀释成工作浓度，经0.22μm滤器过滤除菌，置2～8℃保存备用。

样品稀释液：取氯化钠(NaCl)8.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g、氯化钾(KCl)0.2g、硫柳汞钠0.1g，加注射用水至1000ml。

20倍浓缩洗涤液：取吐温20(Tween-20)10.0ml，氯化钠(NaCl)160.0g、十二水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)58.0g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4.0g、氯化钾(KCl)4.0g，加注射用水至1000ml。

底物显色液：柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 5.0)配制0.1mol/L柠檬酸盐(C₆H₈O₇·H₂O)和0.2mol/L磷酸盐(Na₂HPO₄·12H₂O)按6.1ml:6.4ml混合配制而成。TMB贮存液配制TMB溶于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为32mmol/L。取TMB贮存液用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液作1:20倍稀释，再加入终浓度7.5mmol/L聚乙二醇(PEG)、100mmol/L葡萄糖和2.94mmol/L H₂O₂，完全溶解后，避光保存，置2～8℃保存备用。

终止液：2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml去离子水中，定容至1000ml，分装，10ml/瓶，2～8℃保存备用。

实施例4：

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)的使用方法：

样品处理：取猪全血，待血液凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。

洗涤液配制：使用前，将浓缩的洗涤液从试剂盒中取出，平衡至室温(20～25℃)，并摇动，使沉淀溶解(最好在37℃水浴中加热5～10分钟)，然后用蒸馏水作20倍稀释(例如：每两块板用30ml的20倍浓缩洗涤液加上570ml蒸馏水)，混匀，稀释好的洗涤液在2～8℃可以存放7日。

样品初步稀释：将待检血清样品在血清稀释板中按1:40的比例稀释(例如：在血清稀释板中先加入195μl样品稀释液，再加5μl待检血清)，阳性对照和阴性对照在血清稀释板中按1:4倍稀释(如：180μl样品稀释液中加60μl阳性对照或阴性对照)，不同的样品要注意换吸头。样品在稀释过程中要充分混匀。

【操作步骤】

1)取适量的抗原包被板，每孔加入200μl洗涤液，洗涤1次，拍干。再将稀释好的待检血清、阳性对照和阴性对照各取100μl加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阳性对照和阴性对照各设2孔，置37℃温育30分钟。

2)弃去孔中液体，每孔加入200μl洗涤液，重复洗涤5次，最后一次拍干。

3)每孔加入100μl酶标记物，置37℃温育30分钟。

4)弃去孔中液体，洗涤方法同步骤2。

5)每孔加入100μl底物显色液，置20～25℃避光显色10分钟。

6)每孔加入50μl终止液，10分钟内读取OD_630nm值。

【结果判定】

试验成立条件是：S为样品OD_630nm值，P为阳性对照OD_630nm平均值，N为阴性对照OD_630nm平均值。若S/P值≥0.43，样品判定为阳性；若S/P值<0.43，样品判定为阴性。

实施例5：

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)的敏感性和特异性：

1、敏感性比较

本发明的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)进行以下三个方面的研究。

首先，已知阴性样品的阳性检出率研究。用本发明试剂盒和非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)分别检测20份来自临床的已知阴性样品，两者的阳性检出率均为0.00％。

其次，已知阳性非洲猪瘟野毒感染样品的阳性检出率研究。用两种试剂盒分别检测20份已知阳性样品，两者的阳性检出率均为100％。

最后，最低检出量研究。

J06、J21血清的制备：已知阳性样品中随机抽取2份，分别为J06和J21，凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清所得。

敏感性质控品：将本发明获得的真核表达CD2v蛋白与佐剂1:1混合，经猪颈部肌肉注射1ml/每头(蛋白含量1.0mg)，连续免疫3次，每次间隔14日。第3次免疫14天后开始采血检测，用该蛋白作为包被抗原进行猪血清ELISA检测，血清效价不低于1:16。之后进行颈动脉无菌采血，待血液充分凝固后，4000r/min离心10分钟，分离血清，60℃灭活30分钟，加入终浓度为0.01％的硫柳汞钠，置-70℃以下保存备用。

本发明检测敏感性质控品(免疫CD2v蛋白后的猪血清)、J06、J21的ELISA效价分别为1:32、1:64、1:64，由于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)的包被抗原不是CD2v蛋白，而敏感性质控品为免疫CD2v蛋白后的猪血清，因此对于敏感性质控品，不用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)检测。使用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)检测J06、J21的ELISA效价分别为1:16、1:64。

综上研究数据表明，本发明提供的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的敏感性与非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)相当，且非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)的敏感性优于美国Biostone非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒和英吉纳非洲猪瘟(ASFV)阻断ELISA抗体检测试剂盒，由此表明制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的敏感性良好，可用于临床检测。

2.特异性比较

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)从以下两个方面进行研究：首先，已知未感染动物样品的阳性检出率研究。用本发明和非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)分别检测50份阴性样品，结果均为阴性。其次，交叉反应研究。用两种试剂盒分别检测CSFV抗体阳性血清、PRV抗体阳性血清、PPV抗体阳性血清、PRRSV抗体阳性血清、JEV抗体阳性血清、pCMV空载阳性血清、4份ASFV抗体阴性血清，结果均为阴性。综上研究结果表明本发明具有良好的特异性。

实施例6：

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v包被抗原)鉴别野毒株和自然弱毒株：

使用非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)(包被抗原为p54蛋白)和本发明的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v为包被抗原)。检测24份血清，其中10份为ASFV野毒感染血清(1-10)，10份为ASFV缺失CD2v弱毒株感染血清(11-20)，这20份血清均购自于中国兽医药品监察所；其余四份血清，其中1份CD2v阳性对照血清，一份为CD2v阴性对照血清，一份为p54阳性对照血清，一份为CD2v阴性对照血清，4份血清均由本实验室制备保存。

本发明的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(CD2v为包被抗原)的实验方法按照实例3进行操作，非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒(申请号：202010700335.X中的实施例2)按照专利文件中相关实施例进行操作。检测结果于下表：

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu

195 200 205

<210> 2

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatcatcc tgatcttcct gatcttcagc aacatcgtgc tgagcatcga ctactgggtg 60

agcttcaaca agaccatcat cctggacagc aacatcacca acgacaacaa cgacatcaac 120

ggcgtgagct ggaacttctt caacaacagc ttcaacaccc tggccacctg cggcaaggcc 180

ggcaacttct gcgagtgcag caactacagc accagcatct acaacatcac caacaactgc 240

agcctgacca tcttccccca caacgacgtg ttcgacacca cctaccaggt ggtgtggaac 300

cagatcatca actacaccat caagctgctg acccccgcca ccccccccaa catcacctac 360

aactgcacca acttcctgat cacctgcaag aagaacaacg gcaccaacac caacatctac 420

ctgaacatca acgacacctt cgtgaagtac accaacgaga gcatcctgga gtacaactgg 480

aacaacagca acatcaacaa cttcaccgcc acctgcatca tcaacaacac catcagcacc 540

agcaacgaga ccaccctgat caactgcacc tacctgaccc tgagcagcaa ctacttctac 600

accttcttca agctg 615

<210> 3

<211> 615

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgatcatcc tgatcttcct catttttagc aacattgtgc tgtctattga ctactgggtg 60

agcttcaata agactattat cttggattcc aacatcacta atgacaataa cgacatcaat 120

ggcgtctcct ggaacttctt taacaacagt ttcaacaccc tggccacttg cggcaaggca 180

ggtaacttct gtgagtgtag taattattct acaagtatat acaacatcac caataactgt 240

tctctgacca tctttcccca caacgatgtt tttgacacaa cctaccaggt ggtctggaac 300

cagatcatca actatacaat taagctcctc accccagcca ctcctccaaa tataacttac 360

aattgcacca acttcctgat cacctgcaag aagaataacg gaacaaatac caacatttac 420

ctgaacatca acgatacgtt tgtgaagtac accaatgaga gtatcctgga atataattgg 480

aacaactcaa atattaacaa ctttacagca acttgtatca tcaacaatac catctcaacc 540

tctaacgaga ccaccttgat caactgcact tacctcacgc tctccagtaa ctatttttac 600

accttcttca aattg 615

<210> 4

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagaagcatg ttgaagaaat cgaaagcccg ccgccggaaa gtaatgaaga agaacagtgc 60

cagcatgatg ataccaccag cattcatgaa ccgagtccgc gcgaaccgct gctgccgaaa 120

ccgtatagcc gctatcagta taataccccg atctattata tgcgcccgag tacccagccg 180

ctgaatccgt ttccgctgcc gaaaccttgc ccgccgccga aaccgtgccc gcctcctaaa 240

ccgtgccctc cgccgaaacc ttgtccgagt gccgaaagct atagcccgcc gaaaccactg 300

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种表达权利要求1所示蛋白的制备方法，包括将SEQ ID NO.2构建到表达载体pCMV中后，采用293细胞进行真核表达。

3.权利要求1所述的蛋白在制备非洲猪瘟病毒野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用。