CN110078801A

CN110078801A - 一种高效表达非洲猪瘟cd2v蛋白的cho细胞株

Info

Publication number: CN110078801A
Application number: CN201910428334.1A
Authority: CN
Inventors: 郭伟伟; 刘大卫; 向银辉; 王玉红; 范根成; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110078801B

Abstract

本发明提供一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；本发明所构建的重组质粒用于在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白；本发明还提供一种重组CHO细胞株，是用上述的重组质粒转染CHO细胞制备的，可用于制备CD2V蛋白，所制备的蛋白可用于鉴别诊断非洲猪瘟。本发明的表达非洲猪瘟CD2V蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，East African Swine fever,ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市沈北新区沈北街道(新城子)五五社区发生疑似非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成严重威胁，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。

非洲猪瘟(ASF)的病原是非洲猪瘟病毒(ASFV)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。ASFV主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白；可根据p72和CD2V分别进行基因型和血清型分析。CD2V是非洲猪瘟中蛋白中仅有糖基化蛋白之一，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。非洲猪瘟病毒编码的CD2V蛋白与宿主的CD2蛋白相似，CD2V蛋白在T细胞和NK细胞中表达，该蛋白能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞，而病毒在家猪间传播也是由于CD2V蛋白的表达，同时该蛋白损坏了淋巴细胞的功能。

目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，样对防御非洲猪瘟具有重大意义。

发明内容

本发明提供一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

编码上述CD2V蛋白的基因，其核酸序列为SEQ ID NO:3；

本发明再一个方面提供一种能表达上述CD2V蛋白的重组质粒，其中包含有编码CD2V蛋白的核苷酸片段；所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:3；

本发明所构建的重组质粒用于在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白；

本发明还提供一种重组CHO细胞株，是用上述的重组质粒转染CHO细胞制备的，可用于制备CD2V蛋白，所制备的蛋白可用于鉴别诊断非洲猪瘟。

本发明的表达非洲猪瘟CD2V蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

具体实施方式

本发明以2018年分离的沈阳毒株CD2V蛋白出发，经剪切优化后，用CHO细胞表达系统表达了重组CD2V蛋白，该蛋白为鉴别诊断以及后期的亚单位疫苗奠定基础。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1、表达CD2V基因的重组质粒的构建

1.1 CD2V基因的剪切、优化

将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的CD2V基因(编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2)的结构域进行分析后，将蛋白的C末端150aa剪切掉，从而能够更好的帮助蛋白更好地折叠为三级结构，使其抗原位点更好地暴露出来。为了蛋白的纯化以及后期检测的方便，将C端加入6个His氨基酸。由于CD2V核苷酸序列中存在很多稀有密码子，将其核苷酸进行了密码子优化，从而能够在CHO细胞中高效表达CD2V蛋白。

优化后的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，优化修饰后的氨基酸的序列为SEQID NO:4，能更好的表达出抗原位点。

1.2 14.4-CD2V重组质粒的构建

1.2.1酶切反应

1.2.1.1标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

1.2.1.2将步骤1.2.1.1中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。

1.2.2双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

1.2.3连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

1.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。

(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。

(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。

(7)观察记录转化结果。

1.2.5质粒抽提与PCR鉴定

1.2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中DNA溶液。

1.2.5.2 PCR鉴定

(1)标记好需要用到的PCR管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μL：

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序，获得阳性的质粒1.3将测序阳性的质粒用于CHO细胞的转染。

实施例2：CHO-K1细胞的转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；F-12培养液置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)将2.5μg实施例1制备的重组质粒DNA、P3000加入到125μl OPTI-MEM培养液中，混匀。将3.75μl lipotectamine3000加入到125μl OPTI-MEM培养液中，混匀。将脂质体与重组DNA混合，室温静止10min。

(3)从37℃培养箱中取出24小时前平铺的6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的OPTI-MEM培养液洗细胞三次，并弃去OPTI-MEM培养液。

(4)每个细胞孔加入2ml10％、1％双抗的胎牛血清的F-12培养液。

(5)将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

(6)转染后72小时，收取上清，进行蛋白检测，同时将细胞进行加压筛选。

(7)144小时后，将单克隆细胞进行检测，将阳性的细胞进行扩增。可用于大生产制备蛋白。

实施例3：蛋白纯化与检测

4.1重组CD2V蛋白在CHO细胞内的表达与鉴定

将实施例3挑选的细胞，37℃培养至240小时，收集上清。将收集的蛋白液进行SDS-PAGE蛋白分析。结果发现优化前的CD2V基因在CHO细胞中没有表达，而优化的CD2V基因在CHO细胞中有表达，其蛋白含量约3mg/L。

4.2重组CD2V蛋白的层析纯化

将收集的CD2V上清液，用GE的Ni Sepharose excel介质进行亲和层析。收集的上清5000rpm离心5min，作为上样液。

4.2.1用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。

4.2.2用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗介质。

4.2.3上样，柱子每毫升可挂4mg蛋白。

4.2.4用20倍柱体积的洗涤缓冲液清洗介质。

4.2.5用5倍柱体积的洗脱缓冲液将蛋白洗脱。

4.3 westernblot试验

将4.2制备的蛋白进行SDS-PAGE，采用半干法20伏转印30min，将目的蛋白条带转移到PVDF膜，转印膜用封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶500稀释的非洲猪瘟病毒阳性血清37℃作用1.5h，PBST洗3次，用1∶2000稀释的HRP标记的羊抗猪酶标抗体37℃作用1.5h，PBST洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemiDOC进行显色，结果优化后的核苷酸序列为SEQ IDNO:4的基因在CHO细胞内表达的CD2V蛋白条带很亮，说明表达的CD2V蛋白免疫原性好。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660

cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720

atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780

tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840

tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900

cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960

ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020

cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080

taa 1083

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr Ile

195 200 205

Pro Leu Ser Ile Ile Ile Gly Ile Thr Ile Ser Ile Leu Leu Ile Ser

210 215 220

Ile Ile Thr Phe Leu Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys His Val Glu Glu

225 230 235 240

Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln His

245 250 255

Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu Leu

260 265 270

Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr Met

275 280 285

Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro Cys

290 295 300

Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys

305 310 315 320

Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro Ser

325 330 335

Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn Ile Ser

340 345 350

Leu Ile His Val Asp Arg Ile Ile

355 360

<210> 3

<211> 651

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgataattt tgatattcct cattttttct aacattgtac tgagcattga ttactgggtg 60

tccttcaata aaaccataat tctcgatagt aatataacaa atgataacaa cgacataaat 120

ggtgtaagtt ggaatttttt caacaatagt tttaataccc ttgccacttg cgggaaggcc 180

gggaattttt gtgagtgttc caactacagc acctctattt acaacattac aaataactgc 240

tccctcacaa tctttcctca taatgacgta tttgatacta cttatcaggt agtatggaac 300

caaataataa attacacaat taaattgctt acccccgcta ccccacctaa cataacttac 360

aattgtacca acttcttgat aacttgcaag aaaaataatg gtactaacac taatatatat 420

ttgaatatca acgatacctt cgttaaatat acaaacgagt caattctgga atacaactgg 480

aataatagta acatcaataa ttttaccgca acatgtataa ttaataatac aataagtacc 540

tctaacgaaa caacactcat taattgcaca tacctcaccc tgtcaagtaa ctatttctac 600

accttcttca agctgtacta cataccttta catcaccatc atcatcacta a 651

<210> 4

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr Ile

195 200 205

Pro Leu His His His His His His

210 215

Claims

1.一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其特征在于，所述的CD2V蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO:3。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒中包含有权利要求2所述的基因。

5.权利要求4所述的重组质粒在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白的应用。

6.一种重组CHO细胞株，其特征在于，所述的重组CHO细胞株是用权利要求4所述的重组质粒转染CHO细胞制备的。

7.权利要求6所述的重组CHO细胞株在制备权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白中的应用。

8.权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用。

9.权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用。

10.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是使用权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白作为抗原制备的。